CN111909885A - 一种耐盐降cod菌种、培养方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用，所述耐盐降COD菌种为嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20538。本发明的菌种具有耐盐和分解难分解有机物的能力，可直接投加于生物反应器中，比普通的污泥驯化更加快速和高效，且成本可控。
Description
技术领域
本发明涉及一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用，属于污水处理的技术领域。
背景技术
我国煤化工行业在过去十数年间取得了长足进步与发展，以煤制气和煤制油为代表的新型煤化工技术取得重要突破，行业发展迅速，2020年预计可形成500亿立方煤制气和3000万吨煤制油的产业规模。而随着产业扩张，与之相应的资源和环境问题却日益突出，煤化工水资源供需矛盾逐步显现，环境污染问题日益突出，尤其是煤化工高盐废水，已成为制约行业发展的主要因素之一。
煤化工高盐废水主要来源于煤气洗涤废水、循环水系统排水、除盐水系统排水以及在回用水处理系统中产生的浓水，该类废水盐含量在3%~8%，有机物成分复杂且难降解，有机污染物以酚、油、胺、萘、吡啶、喹啉、蒽等杂环芳香族化合物为主。有机物的存在一方面易造成盐浓缩过程中膜系统的污染，另一方面随着有机物的累积会影响结晶盐品质以及造成蒸发结晶设备堵塞。
目前针对于这类高盐有机废水，大多数采用高级氧化法，如芬顿氧化、臭氧氧化、电催化氧化等，但是存在投资高、运行成本高的问题；生物法运行成本低，但是对于这类难降解有机物，常规的生化处理效果不理想。为了提高生物法对煤化工高盐废水中难降解有机物的去除效果，可以培养高效耐盐菌种用于生化氧化处理体系。
虽然多数处理系统都设计了生物反应池或其他生物反应装置，但由于没有高效菌株，生化工艺段处理效果并不理想。目前应用较多的活性污泥生物反应池在煤化工高盐废水处理的实际应用中效果并不理想。
现阶段一些学者在通过菌株筛选与扩培应用于难降解有机物生化处理系统。卢永等利用固定化白腐菌对焦化废水进行深度处理，使COD去除率稳定在60~70%。柯斌清等利用萘和吡啶作为碳源对污泥进行筛选获得1组优势混合菌组，其COD去除率为87.2%。但是对于煤化工高盐废水体系中去除难降解有机物的菌株，在实际筛选和分离过程中仍存在一定困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株耐盐降COD菌种，所述耐盐降COD菌种为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.20538。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种耐盐降COD菌种的培养方法，包括下列步骤：
步骤1：页岩气采出水生化污泥、煤化工废水生化污泥和市政污水生化污泥分别采集得到样品污泥；
步骤2：将样品污泥混合均匀，然后加入无菌富集培养基中，于20-30℃、150-250rpm恒温振荡条件下，对样品污泥进行富集培养，得到富集后的菌液；
步骤3：将富集后的菌液稀释100-100000倍后均匀涂布于具有限制性培养基的平板上，使用透气封口膜封好，倒置放于20-30℃的恒温箱中进行恒温培养；待平板上的菌落长至1~2mm，挑取单菌落于扩繁培养基中，于20-30℃、150-250rpm恒温振荡培养8-24h；
步骤4：向步骤3制得的菌液中添加诱变剂，培养15-25分钟后加入Na2S2O3以终止反应，并将菌液离心去上清后，加入灭菌的营养肉汤培养基，于20-30℃、150-250rpm恒温培养8-24h，涂平板获得突变体单菌落，然后使用甘油管法保存于-80℃冰箱中，该菌种为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20538。
优选的技术方案为：所述无菌富集培养基由1-5g的柠檬酸钠、0.5-4g的NH4Cl、0.1-1g的KH2PO4、0.1-0.2g的 MgSO4·7H2O和10-30g的NaCl，加蒸馏水定容至1L，再经灭菌后制得。
优选的技术方案为：所述限制性培养基由1-100ml的待处理废水、0.1-0.2g 的K2HPO4、0.1-0.5g的CaCl2·2H2O、10-30g的NaCl、0.2g的MgSO4·7H2O和15g的琼脂，加蒸馏水定容至1L制得；所述限制性培养基的pH值为5.5~6.5。
优选的技术方案为：所述扩繁用培养基由4g的蔗糖、2g的葡萄糖、0.5g的可溶性淀粉、0.3g的(NH4)2SO4、0.3g的尿素、0.1g 的K2HPO4、0.2g的酵母粉和10-30g的NaCl，加蒸馏水定容至1L制得。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一株耐盐降COD菌种的应用，所述耐盐降COD菌种为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.20538；所述耐盐降COD菌种具有降解煤化工废水的能力。
优选的技术方案为：将含有耐盐降COD菌种的菌液按1~5%体积分数接种至待处理的煤化工废水，然后在20~30℃条件下，连续曝气维持DO值5~8mg/L。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明通过菌种的连续筛选为煤化工高盐废水的生化处理提供了菌种来源，使生化处理降COD更加高效和快速。该方法筛选获得的菌种可以进行快速繁殖，和普通污泥驯化相比所用时间更短，缩短生化工艺的调试时间。
2、本发明的菌种具有耐盐和分解难分解有机物的能力，可直接投加于生物反应器中，比普通的污泥驯化更加快速和高效，且成本可控。
附图说明
图1菌落形态特征。
图2 菌体显微图片。
图3实例一与普通活性污泥出水COD值对比。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
针对煤化工高盐废水处理的耐盐降COD菌种筛选及应用：
经过对煤化工废水生化污泥、排水口土壤及市政污水生化污泥等处群落进行富集、菌种分离、诱变育种、降解能力测定、菌种鉴定和保藏，获得了降解煤化工高盐废水内有机物能力最佳的菌株，并将该菌株用于煤化工高盐废水的生化处理过程。使用16S序列测序和分析完成该菌株的鉴定，并将该菌株保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20538。
煤化工高盐废水主要包括煤气洗涤废水、循环水系统排水、除盐水系统排水以及在回用水处理系统中产生的浓水。这些废水的无机污染物以氨氮、氰化物、硫化物、硫氰化物、氟化物为主；有机污染物以酚、呋喃、胺、萘、吡咯、吡嗪、蒽等杂环芳香族化合物为主。
所获得的菌种为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，菌种保藏号为CGMCC No. 20538。其菌落形态为菌落呈粉色圆状，表面湿润，易挑起。显微结果为菌体呈杆状或者弯杆状，长度大小约为5μm。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，并登记入册，证明存活。
菌种分离所用限制性培养基成分：煤化工废水RO浓水1~100ml、尿素 0.1~0.5g、K2HPO4 0.2~1g、CaCl2·2H2O 0.1~0.5g、NaCl 10~30g、MgSO4·7H2O 0.1~0.3g、琼脂15g，加蒸馏水定容至1L。
所用培养基：碳源2~10g、氮源0.2~1g、K2HPO4 0.1g、酵母粉0.2g、NaCl 10~30g。培养基组成成分，碳源为蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、麦芽糖中的一种或多种，氮源为尿素、硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、碳酸氢铵和磷酸铵中的一种或多种。
所获得菌株的应用技术：该菌株可单独使用，也可与其他菌株混合使用；可直接投加于生化反应池，或活化后投加于生化反应池。
菌种可作为强化菌剂应用于各种生化反应池。生化反应池包括但不限于：活性污泥法的SBR工艺段、CASS工艺段和AO工艺段；生物膜法的生物滤池工艺段、生物接触氧化工艺段和生物转盘工艺段中的一个或多个工艺段。
实施例1：一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用
耐盐降COD菌种的筛选步骤包括：样品富集、菌种分离、诱变育种、降解能力测定、菌种鉴定和保藏等步骤。
1.1 样品富集
本实施例所用样品采自于页岩气采出水生化污泥、煤化工废水生化污泥、市政污水生化污泥。
菌液富集：将上述3个样品混合均匀，取2g，加入200ml无菌富集培养基中，于30℃、200rpm恒温振荡条件下，对污泥样品进行富集培养。
富集培养基为：柠檬酸钠3g，NH4Cl 2g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.15g，NaCl 20g，加蒸馏水定容至1L。
1.2 菌种分离
将富集后的菌液稀释50000倍，均匀涂布于限制性培养基平板上，使用透气封口膜封好，倒置放于25℃恒温箱中恒温培养。
限制性培养基为：待处理废水50ml、K2HPO40.15g、CaCl2·2H2O 0.3g、NaCl 20g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，pH为6。
待限制性平板上的菌落长至1~2mm，挑取单菌落于扩繁培养基中，于25℃、200rpm恒温振荡培养16h。
扩繁用培养基为：蔗糖4g、葡萄糖2g、可溶性淀粉0.5g、(NH4)2SO4 0.3g、尿素0.3g、K2HPO4 0.1g、酵母粉0.2g、NaCl10~30g。
1.3 诱变育种
向菌液中添加质量分数为10%的诱变剂甲基磺酸乙酯1~10ml，进行人工诱变。培养20min后，加入质量分数为2%的Na2S2O3 8ml终止反应，并将菌液离心去上清后，加入灭菌的营养肉汤培养基，于30℃、200rpm条件下恒温培养20h，稀释涂平板获得突变体单菌落。
1.4 菌种保藏
将获得的菌株使用甘油管法保存于-80℃冰箱中。后保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1.5 菌种鉴定
将菌种活化后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌种DNA，后使用16S引物进行PCR扩增获得扩增序列，经琼脂糖凝胶电泳检测后送测序公司测序。经核酸序列同源性检测，该菌为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，菌种保藏号为CGMCC No. 20538。
1.6 菌株对煤化工废水有机物降解能力测定
将扩繁的菌液按3%体积比接种至待处理废水，然后置于摇床上在25℃、100~200rpm条件下进行摇瓶处理。每隔6h取水样测定其COD。
实例2：一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用
1.1 样品富集
如图1-3所示，本实施例所用样品采自于页岩气采出水生化污泥、煤化工废水生化污泥、市政污水生化污泥。
菌液富集：将上述3个样品混合均匀，取0.5g，加入200ml无菌富集培养基中，于30℃、200rpm恒温振荡条件下，对污泥样品进行富集培养。
富集培养基为：柠檬酸钠5g，NH4Cl 1g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.1g，NaCl30g，加蒸馏水定容至1L。
1.2 菌种分离
将富集后的菌液稀释100000倍，均匀涂布于限制性培养基平板上，使用透气封口膜封好，倒置放于30℃恒温箱中恒温培养。
限制性培养基为：待处理废水100ml、K2HPO4 0.2g、CaCl2·2H2O 0.1g、NaCl 30g、MgSO4·7H2O 0.2g、琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，pH为5.5~6.5。
待限制性平板上的菌落长至1~2mm，挑取单菌落于扩繁培养基中，于30℃、200rpm恒温振荡培养24h。
扩繁用培养基为：蔗糖4g、葡萄糖2g、可溶性淀粉0.5g、(NH4)2SO4 0.3g、尿素0.3g、K2HPO4 0.1g、酵母粉0.2g、NaCl 30g。
1.3 诱变育种
向菌液中添加10%诱变剂甲基磺酸乙酯3ml，进行人工诱变。处理20min后，加入2%Na2S2O3终10ml终止反应，并将菌液离心去上清后，加入灭菌的营养肉汤培养基，于30℃、200rpm条件下恒温培养24h，稀释涂平板获得突变体单菌落。
1.4 菌种保藏
将获得的菌株使用甘油管法保存于-80℃冰箱中。
1.5菌株和普通污泥对煤化工废水RO浓水有机物降解能力测定
煤化工废水RO浓水进水水质
煤化工废水RO浓水进水COD为835mg/L、pH为9.3、氨氮含量3.086mg/L，含盐量为36.7g/L，为硫酸钠型水样，其中氯离子和硝酸根离子含量也较高。RO浓水为生化处理后再经RO浓缩后的产水，其可生化性较常见煤化工废水更差。
反应器为3L烧杯，加入待处理废水至3L刻度线，将扩繁的菌液按1%体积比接种至待处理废水，条件控制温度30℃，连续曝气维持DO值5~8mg/L。每隔8h取水样测定其COD值。起始水样COD值为835mg/L，72h后COD值为134.82mg/L，COD去除率为83.85%。
对比例：反应器为3L烧杯，加入待处理废水至3L刻度线，将普通活性污泥按10%体积比接种至待处理废水，条件控制温度30℃，连续曝气维持DO值5~8mg/L。每隔8h取水样测定其COD值。起始水样COD值为835mg/L，72h后COD值为436.76mg/L，COD去除率为47.7%。
实例3：一种耐盐降COD菌种、培养方法及应用
煤化工煤气洗涤废水进水COD为488mg/L、pH为8.6、氨氮含量200mg/L，含盐量为10g/L，为硫酸钠型水样，其中氯离子和硝酸根离子含量也较高。
反应器为3L烧杯，加入待处理废水至3L刻度线，将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌种相同的菌种扩繁后的菌液按1%体积比接种至待处理废水，条件：控制温度30℃，连续曝气维持DO值5~8mg/L。每隔8h取水样测定其COD值。起始水样COD值为488mg/L，72h后COD值为32.1mg/L，COD去除率为93.4%。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (7)
1.一株耐盐降COD菌种，其特征在于：所述耐盐降COD菌种为嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20538。
2.一种耐盐降COD菌种的培养方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：页岩气采出水生化污泥、煤化工废水生化污泥和市政污水生化污泥分别采集得到样品污泥；
步骤2：将样品污泥混合均匀，然后加入无菌富集培养基中，于20-30℃、150-250rpm恒温振荡条件下，对样品污泥进行富集培养，得到富集后的菌液；
步骤3：将富集后的菌液稀释100-100000倍后均匀涂布于具有限制性培养基的平板上，使用透气封口膜封好，倒置放于20-30℃的恒温箱中进行恒温培养；待平板上的菌落长至1~2mm，挑取单菌落于扩繁培养基中，于20-30℃、150-250rpm恒温振荡培养8-24h；
步骤4：向步骤3制得的菌液中添加诱变剂，培养15-25分钟后加入Na2S2O3以终止反应，并将菌液离心去上清后，加入灭菌的营养肉汤培养基，于20-30℃、150-250rpm恒温培养8-24h，涂平板获得突变体单菌落，然后使用甘油管法保存于-80℃冰箱中，该菌种为嗜冷假单胞菌 (Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20538。
3.根据权利要求2所述的耐盐降COD菌种的培养方法，其特征在于：所述无菌富集培养基由1-5g的柠檬酸钠、0.5-4g的NH4Cl、0.1-1g的KH2PO4、0.1-0.2g的 MgSO4·7H2O和10-30g的NaCl，加蒸馏水定容至1L，再经灭菌后制得。
4.根据权利要求2所述的耐盐降COD菌种的培养方法，其特征在于：所述限制性培养基由1-100ml的待处理废水、0.1-0.2g 的K2HPO4、0.1-0.5g的CaCl2·2H2O、10-30g的NaCl、0.2g的MgSO4·7H2O和15g的琼脂，加蒸馏水定容至1L制得；所述限制性培养基的pH值为5.5~6.5。
5.根据权利要求2所述的耐盐降COD菌种的培养方法，其特征在于：所述扩繁用培养基由4g的蔗糖、2g的葡萄糖、0.5g的可溶性淀粉、0.3g的(NH4)2SO4、0.3g的尿素、0.1g 的K2HPO4、0.2g的酵母粉和10-30g的NaCl，加蒸馏水定容至1L制得。
6.一株耐盐降COD菌种的应用，其特征在于：所述耐盐降COD菌种为嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophila)，已于2020年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.20538；所述耐盐降COD菌种具有降解煤化工废水的能力。
7.根据权利要求6所述的耐盐降COD菌种的应用，其特征在于：将含有耐盐降COD菌种的菌液按1~5%体积分数接种至待处理的煤化工废水，然后在20~30℃条件下，连续曝气维持DO值5~8mg/L。
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| 黄秋婷等: "几种低温微生物菌株及其组合对北方农村生活污水处理效果", 《北京化工大学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501057A (zh) * | 2020-11-11 | 2021-03-16 | 大连海洋大学 | 盐单胞菌及处理高盐废水的方法 |
| CN112501057B (zh) * | 2020-11-11 | 2024-02-02 | 大连海洋大学 | 盐单胞菌及处理高盐废水的方法 |
| CN114686391A (zh) * | 2020-12-31 | 2022-07-01 | 中国石油化工股份有限公司 | 一株高耐盐菌及其应用 |
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