CN106635857A

CN106635857A - 一种施氏假单胞菌及其培养应用

Info

Publication number: CN106635857A
Application number: CN201510737176.XA
Authority: CN
Inventors: 郭志华; 高会杰; 孙丹凤; 赵胜楠; 李宝忠
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Dalian Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: Sinopec Dalian Petrochemical Research Institute Co ltd; China Petroleum and Chemical Corp
Priority date: 2015-11-04
Filing date: 2015-11-04
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2035-11-04
Also published as: CN106635857B

Abstract

本发明涉及一种施氏假单胞菌及其培养应用。该菌株为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5，已于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.10940。该菌株可应用于盐含量1.0wt%-10wt%的含盐废水中COD的高效脱除，而且能够在40℃高温下生长。本发明还提供一种脱COD的耐盐菌剂，该菌剂中包括施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5。本发明提供的施氏假单胞菌可快速降解脱除高含盐废水中的COD，具有耐盐能力强，处理效果好等特点。

Description

一种施氏假单胞菌及其培养应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种耐盐的脱COD施氏假单胞菌及其培养应用，该菌株特别适用于高含盐废水中COD的高效去除。

背景技术

来源于石油、化工、医药和化肥等行业的盐含量高于1%的高含盐废水普遍含有较高的COD，废水中污染物不断排放到环境中会引起严重的污染问题。淡水资源的缺乏问题日益严重，废水的处理及其回收利用更受到人们的重视。

物理或化学法处理高含盐废水中的COD，成本高并且可能会造成二次污染。传统生物法在处理低盐度废水时有很大优势，但在高盐、高酸碱、高温或低温逆环境中，微生物的降解能力就会受到抑制。耐盐菌处理高含盐废水具有普通活性污泥法无可比拟的优势，且比物理化学法成本低，会产生较为明显的经济效益和社会效益，可以为相关废水处理达标排放提供技术支撑。

耐盐菌技术正是基于工程领域的问题和急需而产生，通过科学方法驯化出处理高含盐废水的优势耐盐菌，该类菌体以其独特的细胞结构和物质组成能够在较高含盐度的环境中生长。该类耐盐微生物的耐盐性状与其适应极端环境的丰富酶系和活性产物有关。

施氏假单胞菌可用于废水中总氮脱除、COD脱除及有机物降解等多个领域。

在采用施氏假单胞菌处理废水中氨氮及总氮技术领域：CN201310375037.8涉及到一种应用于废水脱总氮的施氏假单胞菌WZUF25，保藏号为CGMCC No.7685。该菌株不仅对NO₃ ^--N和NO₂ ^--N的去除率高，而且具有很高的同化NH₄ ⁺-N能力，可为同步硝化和反硝化提供种源。CN201410009181.4涉及到一种应用于脱硝酸盐的施氏假单胞菌DN-LWX19，保藏号为CGMCC No.8521。该菌株对初始NO₃ ^--N浓度为32mg/L的模拟污水，24h去除率能达到98%，32h去除率达100%，且无亚硝酸盐积累。CN201410022561.1涉及到一种应用于低温生物脱氮的施氏假单胞菌DN-3，保藏号为CGMCC No.8291。CN201210151039.4涉及到一种应用于养殖水体快速脱总氮的施氏假单胞菌DB-33，保藏号为CGMCC No.5993。该菌株可快速降解水体中的硝酸盐，亚硝酸盐，氨氮。CN201210201976.6涉及到一种应用于兼性厌氧反硝化的施氏假单胞菌LZ-4，保藏号为CCTCC NO：M2011430。CN200910273046.X涉及到一种应用于水体中总氮脱除的施氏假单胞菌YZN-001，保藏号为CCTCC NO：M209107。CN200910273368.4涉及到一种应用于水体中总氮脱除的施氏假单胞菌CY003，保藏号为CCTCC NO：M209196。

在采用施氏假单胞菌进行有机物降解脱除领域：CN201110322523.4涉及到一种包含施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌、穿孔假单胞菌和枯草芽孢杆菌的应用于特异性有机物降解的复合菌剂，对卤代烃类、苯酚类、苯酸类、芳香烃类、多环芳烃类、杂环化合物、邻苯二甲酸酯等有毒有害有机污染物具有特异降解能力。CN201210573242.0涉及到一种包含恶臭假单胞菌RW10S2、施氏假单胞菌、恶臭假单胞菌DN6和恶臭假单胞菌BIRD-1的应用于苯系物降解的复合菌剂。CN200910303045.5涉及到一种降解高分子多环芳烃（BAP，BGP，PAHs）效率较高的施氏假单胞菌MT-5。CN201310746598.4涉及到一种应用于提高厌氧产沼效率和污泥有机质分解率的施氏假单胞菌KY-02。

在采用施氏假单胞菌进行COD降解脱除领域：CN201310680417.2涉及到一种应用于好氧反硝化的施氏假单胞菌JH-1，保藏号为CCTCC NO：M2013488，其可同步脱除有机废水中60-80%的COD。CN201110118549.7涉及到一种应用于兼性厌氧反硝化的施氏假单胞菌LZ-14，保藏号为CCTCC NO：M2011119，其可同步去除有机废水中的COD。

在高含盐废水处理领域，盐含量是影响微生物处理废水效率的一个关键性因素。信欣等（生物强化技术处理高含盐有机废水[J].水处理技术，2008，8：66-70）采用生物强化技术处理高含盐有机废水，采用耐盐菌生物强化的皂素废水生物处理系统活性污泥的脱氢酶活性显著提高，系统耐受氯离子浓度高达2.8%时，皂素废水COD的去除率为84.41%。CN201210130657.0、CN201210130644.3、CN201010536065.X和CN201210130658.5涉及到采用沼泽考克氏菌（Kocuriapalustris）FSDN-A、科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）FSDN-C，节杆菌（Arthrobactercreatinolyticus）FDN-1、水氏黄杆菌（Flavobacteriummizutaii）FDN-2、脱氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）DN-3和甲基杆菌（Methylobacteriumphyllosphaerae）SDN-3对含盐废水及催化裂化催化剂废水中的氨氮、总氮及化学需氧量进行生物处理的方法。该方法需要培养多种菌株进行复配制备耐盐菌剂，制备过程复杂，生产成本较高。

目前，已知筛选获得的施氏假单胞菌存在不具有耐盐性能或耐盐性能不佳等问题，不适用于高含盐废水的处理。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐盐的脱COD施氏假单胞菌及其培养应用。本发明提供的施氏假单胞菌可快速降解脱除高含盐废水中的COD，具有耐盐能力强，处理效果好等特点，不需要复配菌剂，极大地降低了耐盐菌剂的生产成本。

本发明提供一种施氏假单胞菌FSTB-5，其分类命名为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），已于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10940。

本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5，主要形态特征为：菌落颜色为浅姜黄色，菌株个体为杆状。生理生化特征表现为：革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，具有硝酸盐还原性能，可水解利用多种碳源。

本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5能够耐受林可霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南及萘啶酸等中的一种或几种。

本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5的16SrRNA基因序列见序列表。

本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5在含盐废水脱除COD中的应用。该菌株能够应用于盐含量1wt%-10wt%的含盐废水中COD的高效脱除，而且能够在40℃高温下生长。

本发明中，所述含盐废水可以是经过预处理的化工合成废水、煤化工废水，也可以是炼油工艺、煤化工工艺及化工合成工艺等产生的废水经过反渗透减量化单元产生的浓盐水。所述的含盐废水盐含量为0.5wt%-10wt%，优选为1.0wt%-8.0wt%，COD（Cr法，下同）含量为200-20000mg/L。

本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5的培养方法，包括菌株活化、液体种子液培养、曝气培养等三个阶段，具体步骤为：

（1）菌株活化：将施氏假单胞菌FSTB-5接种到FSTB固体培养基的斜面或者平板中，25-40℃培养24-48小时，然后保存于4℃冰箱中。

（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下挑取斜面或平板中活化的菌株接种到三角瓶中，25-40℃培养24-72h。所述FSTB液体培养基为：FeSO₄•7H₂O 25mg/L，NH₄NO₃ 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl₂ 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值范围4.5-8.5，优选为5.0-8.0。FSTB固体培养基是在液体培养基中加入20g/L的琼脂。

（3）曝气培养：在设有曝气装置的密闭反应器中加入FSTB液体培养基，按照反应器体积比0.5%-25%的比例接种液体种子液，pH值控制在5.0-8.0，曝气培养48-96小时，之后进行周期性的补料和排料操作，排料量占反应器体积的5%-90%，补料量占反应器体积的5%-90%，也可补加少量的碳源、氮源和微量元素物质，培养24-48小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有较高浓度施氏假单胞菌的浓菌液产品。

本发明中，培养结束后，采集培养完毕的菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比。在封闭式培养环境下，施氏假单胞菌为纯菌株，相似百分比达到95%以上。

本发明还提供一种脱COD的耐盐菌剂，该菌剂中包括施氏假单胞菌FSTB-5。所述的耐盐菌剂可以是只采用施氏假单胞菌FSTB-5菌液制得的耐盐菌剂，也可以与其他耐盐菌剂复配，如可以与现有的具有脱氮、除磷及降解难降解有机物的微生物菌剂结合，实现更好的废水处理效果。

本发明提供的耐盐施氏假单胞菌FSTB-5是一株在高含盐水体中具有较好COD脱除性能的菌株，耐盐能力强，处理效果好，可以直接用于含盐废水的处理，也可以投加到现有含盐废水处理系统中，提高废水处理效果。本发明提供的施氏假单胞菌FSTB-5的培养方法，可直接利用污水处理厂含盐废水（根据水质条件补加少量天然培养基和化学合成培养基）进行优势菌株培养富集增浓工作，极大的维持耐盐菌剂的生长特性和耐受特性，并降低耐盐菌剂的培养成本。

生物材料保藏说明

本发明提供的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.10940；保藏日期：2015年6月1日。

具体实施方式

本发明的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5是2014年6月从取自湖南省岳阳市某石化企业用于处理环氧氯丙烷生产废水的活性污泥中分离筛选得到的，其生理生化试验结果见表1。

表1施氏假单胞菌FSTB-5的生理生化试验结果

经“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”鉴定，该菌株属于施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），命名为FSTB-5。

实施例2筛选和分离纯化

采用逐渐提高培养液中盐浓度的方法对取自湖南省岳阳市某石化企业用于处理环氧氯丙烷生产废水的活性污泥进行驯化培养15天。

取上述驯化好的活性污泥，采用稀释涂布的方法在富集培养基中进行初步分离，由此得到15个生长状态良好且性状各异的菌落。所采用的富集培养基含有的主要成分为：COD为1000mg/L，钙离子浓度为1000mg/L，全盐量为10000mg/L，所采用的固体培养基中琼脂含量为2.0%。

然后采用平板划线的方法对得到的菌落进行转接，划线转接到筛选培养基中，进行进一步的分离和筛选。采用的筛选培养基含有的主要成分为：COD_Cr为1000mg/L，钙离子浓度为4000mg/L，全盐量为25000mg/L，所采用的固体培养基中琼脂含量为2.0%。

由上述操作得到10株纯菌株，其中一株即为施氏假单胞菌FSTB-5。

实施例3施氏假单胞菌FSTB-5耐盐能力的考察

本发明所述的施氏假单胞菌FSTB-5的培养方法包括：菌株活化、液体种子液培养、曝气培养，具体过程如下：

（1）菌株活化：将施氏假单胞菌FSTB-5接种到含有FSTB固体培养基的平板中，35℃环境下培养48小时，然后保存于4℃冰箱中待用。所述FSTB固体培养基为：FeSO₄•7H₂O 25mg/L，NH₄NO₃ 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl₂ 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20g/L，pH值7.8。

（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下用接种环挑取斜面中活化后的菌株接种到三角瓶中，35℃条件下培养48小时。所述FSTB液体培养基为：FeSO₄•7H₂O 25mg/L，NH₄NO₃ 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl₂ 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值7.8。

（3）曝气培养：采用密闭的反应器进行培养，所采用反应器及各种器具均需要灭菌完全，进气和排气位置需安装细菌过滤装置，培养液、酸碱调节剂及微量元素溶液均需要灭菌后按照无菌操作规程投加，反应器需配备曝气装置，并可进行进水、调酸、调碱、补料和排水排料操作，在该器具中放入灭菌后的FSTB液体培养基，按照反应器体积百分比10%的比例接种液体种子液，开启培养过程后，培养过程中采用酸碱自动控制系统将培养液pH值范围控制在5.0-8.0，曝气培养72小时之后进行周期性的补料和排料操作，排料为反应器体积百分比25%的培养液，补料为反应器体积百分比25%的FSTB液体培养基，也可同时补加少量的碳源、氮源和微量元素物质，培养24小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，由此得到含有纯施氏假单胞菌的浓菌液产品。

采集上述培养完毕的浓菌液，稀释后涂布到含有FSTB固体培养基的平板中，对长出的菌落进行计数并统计与FSTB-5相似菌落的百分比，相似百分比达到95%以上，即认定该施氏假单胞菌为纯菌株。

采用上述培养得到的施氏假单胞菌FSTB-5处理含盐废水。本实施例以经过预处理的环氧氯丙烷生产工艺废水为例，所处理含盐废水的水质为：COD浓度范围为800-2000mg/L，盐含量为2wt%-10wt%，处理温度30-40℃。处理效果如表2所示。

表2施氏假单胞菌FSTB-5处理含盐废水的效果

由表2可知，施氏假单胞菌FSTB-5能够耐受的盐含量为2wt%-10wt%，能够在40℃高温下生长，可以高效脱除废水中的COD。

本发明所述施氏假单胞菌FSTB-5对实际含盐废水的适应性和处理效果非常好，具有较强的COD降解功能，可直接采用该菌株的纯培养处理含盐废水，也可单独放大培养后作为外源功能微生物投加到现有工艺流程，有针对性地对实际工艺状况进行优化调节，解决高盐环境下活性污泥处理效果差且易退化的问题。采用耐盐菌处理高含盐废水比物理化学法成本低，直接应用会产生较为明显的经济效益和社会效益，可为高含盐相关废水处理达标排放提供技术支撑。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院

<120> 一种施氏假单胞菌及其培养应用

<130> 新申请

<170> PatentIn version 3.5

<211> 1320

<212> DNA

<213> Pseudomonas stutzeri

ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag 60

gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta 120

tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat 180

ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct 240

acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc 300

gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt 360

taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca 420

gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta 480

ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac 540

tggcgagcta gagtatggca gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag 600

atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctggg ctaatactga cactgaggtg 660

cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc 720

gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc 780

tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 840

ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatgcagag 900

aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactctgac acaggtgctg catggctgtc 960

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta 1020

gttaccagca cgttaaggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1080

tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg 1140

tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc 1200

cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga 1260

atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1320

Claims

1.一种施氏假单胞菌FSTB-5，其分类命名为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri），已于2015年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.10940。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：该菌株形态特征为：菌落颜色为浅姜黄色，菌株个体为杆状。

3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：该菌株的生理生化特征为：革兰氏阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，具有硝酸盐还原性能，可分解利用多种碳源。

4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：该菌株能够耐受林可霉素、二甲胺四环素、利福霉素SV、醋竹桃霉素、万古霉素、氨曲南及萘啶酸中的一种或几种。

5.权利要求1所述的施氏假单胞菌FSTB-5在含盐废水脱除COD中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：该菌株能够应用于盐含量1wt%-10wt%的含盐废水中COD的高效脱除，而且能够在40℃高温下生长。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述含盐废水是经过预处理的化工合成废水、煤化工废水，或者是炼油工艺、煤化工工艺及化工合成工艺产生的废水经过反渗透减量化单元产生的浓盐水，盐含量为0.5wt%-10wt%，COD含量为200-20000mg/L。

8.根据权利要求1所述施氏假单胞菌FSTB-5的培养方法，其特征在于包括菌株活化、液体种子液培养、曝气培养等三个阶段，具体步骤为：

（1）菌株活化：将施氏假单胞菌FSTB-5接种到FSTB固体培养基的斜面或者平板中，25-40℃培养24-48小时，然后保存于4℃冰箱中；

（2）液体种子液培养：配制FSTB液体培养基，分装于三角瓶中，灭菌并冷却至室温后，无菌环境下挑取斜面或平板中活化的菌株接种到三角瓶中，25-40℃培养24-72h；

（3）曝气培养：在设有曝气装置的密闭反应器中加入FSTB-2液体培养基，按照反应器体积比0.5%-25%的比例接种液体种子液，pH值控制在5.0-8.0，曝气培养48-96小时，之后进行周期性的补料和排料操作，排料量占反应器体积的5%-90%，补料量占反应器体积的5%-90%，培养24-48小时为1个培养周期，之后按照上述比例排出对应体积的培养液，得到含有较高浓度施氏假单胞菌的浓菌液产品。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述FSTB液体培养基为：FeSO₄•7H₂O 25mg/L，NH₄NO₃ 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl₂ 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH值范围4.5-8.5；FSTB固体培养基是在液体培养基中加入20g/L琼脂。

10.一种脱COD的耐盐菌剂，其特征在于：菌剂中包括施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5。