CN102776125A

CN102776125A - 一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法及应用

Info

Publication number: CN102776125A
Application number: CN2012102328115A
Authority: CN
Inventors: 李辉; 刘勇弟; 林匡飞; 吕树光; 张倩; 陆强; 黄中子; 王玉凤; 王晓丽
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2012-11-14

Abstract

本发明公开了一种在高盐条件下高效降解甲苯、并以甲苯作为唯一碳源和能源生长的中度嗜盐菌群的构建方法，并筛选到一组能降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群。构建方法包括以下步骤：（1）将受苯系物污染的高盐土样接种至NaCl浓度为1M—3.5M的基础无机盐培养基中，并加入甲苯作为唯一碳源和能源，在30℃、120r/min下好氧培养获得菌液；（2）菌群的连续驯化。本发明得到的中度嗜盐菌群能适应广泛的盐度范围，同时以甲苯作为唯一碳源，降解高浓度的甲苯。该菌群不仅对甲苯具有很高的降解速率，并且对高盐度和高甲苯浓度也具有很强的耐受能力，因此在高盐苯系物废水的生物处理领域具有重要的研究优势和广阔的应用前景。

Description

一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一种能够在高盐条件下高效降解甲苯，并利用甲苯作为唯一碳源和能源生长的中度嗜盐菌群的构建及应用。

背景技术

石油开采、印染、制革、制药、化工、食品加工等工业排放出大量高盐有机废水，含盐量一般在15%-25%左右，并含有多种难降解或有毒的有机物。近年来高盐有机废水的排放量呈急剧增长的趋势，我国目前排放的工业污水中有一半属高盐废水，年排放量已超过100亿吨，相当于一个太湖的储水量。其中，大量的化工废水与石油开采废水中含有较高的盐度和高浓度的苯系物。苯系物（BTEX）包括苯、甲苯、二甲苯和乙苯，具有致癌和致突变的作用，并具有生殖毒性。它能毒害人体的中枢神经系统，并引发各种骨髓瘤和白血病等严重疾病，被许多国家列为优先控制的污染物。

由于高盐苯系物废水排放到环境中对生态系统和人体健康造成了极大危害，因此探索行之有效的高盐有机污染物降解技术已成为废水处理中亟待解决的问题。生物处理法相比物化方法因其经济、高效、无害成为首选的处理方法。但目前普遍认为常规的生化法难以适应高盐环境，且大量盐分及其浓度波动带来的冲击会对微生物产生抑制和毒害作用，因此普通的微生物处理系统难以在高盐条件下有效降解BTEX等有机污染物。

在自然界的高盐环境如盐湖、死海、盐场和海洋中，广泛存在着一些能耐高盐度的嗜盐菌，由于其独特的代谢方式和对高盐条件的适应性，使嗜盐菌在高盐废水的生物处理中具有很大优势。已有研究发现，一些嗜盐菌能够在高盐条件下降解BETX等有机污染物，如Halobacter杆菌，金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌等。但目前已报道的能降解较高浓度BTEX的菌群种类和数量较少，且这些菌群能适应的盐度范围十分狭窄，尤其是在较高盐度下或在较大的盐度波动时这些菌群对BTEX的降解能力相当有限，因而限制了其应用。

由于中度嗜盐菌相比其它嗜盐菌分布更为广泛，并具有极宽的盐适应范围，对营养要求低，代谢能力强，更易于适应高盐环境，以其为主的生物处理系统更具稳定性和耐冲击能力，从而受到了越来越多的关注。但目前对能够在很宽的盐度范围内降解高浓度甲苯的中度嗜盐菌群的研究仍鲜有报道。因此，筛选和驯化能够适应宽泛的盐浓度条件并能高效降解高浓度BTEX的中度嗜盐菌群逐渐成为近年来相关领域的研究热点。现有文献也没有关于本发明筛选得到的菌群具有高盐条件下高效降解甲苯、并以甲苯作为唯一碳源和能源生长的功用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种在高盐条件下高效降解甲苯、并以甲苯作为唯一碳源和能源生长的中度嗜盐菌群的构建方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供利用上述构建方法获得的能降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群。

本发明所要解决的第三个技术问题是，提供利用上述构建方法获得的能降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的应用。

为了解决上述问题，本发明提供了一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法，包括以下步骤：

（1）菌群的构建：将受苯系物污染的高盐土样接种至NaCl浓度为1M—3.5M的基础无机盐（MSM）培养基中，并加入甲苯作为唯一碳源和能源，在30℃、120r/min下好氧培养获得菌液；

（2）菌群的连续驯化：待甲苯降解完全后重新投加甲苯，每隔一定时间后，在无菌条件下移取体积含量为30%的菌液转接至新配置的步骤（1）所述的基础无机盐培养基中，并继续加入甲苯培养，经过6—7次驯化和富集，得到中度嗜盐菌群。所述中度嗜盐菌群能够在1 M~3.5 M NaCl浓度范围内彻底降解浓度最高达150 mg/L的甲苯。

作为一个优选方案，所述基础无机盐培养基中NaCl浓度为1.5M；所述甲苯的浓度范围为100~120 mg/L。

为了解决本发明第二个技术问题，提供利用上述构建方法获得的降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群，所述菌群包括Marinobacter， Prolixibacter，Balneola和Halobacillus中的一种或几种，所述中度嗜盐菌群能够在1 M~3.5 M NaCl浓度范围内彻底降解浓度最高达150 mg/L的甲苯。

为了解决本发明第三个技术问题，提供利用上述构建方法获得的降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群在降解甲苯中的应用。

本发明的优点在于，本发明得到的中度嗜盐菌群能适应广泛的盐度范围，同时以甲苯作为唯一碳源，降解高浓度的甲苯。该菌群不仅对甲苯具有很高的降解速率，并且对高盐度和高甲苯浓度也具有很强的耐受能力，因此在高盐苯系物废水的生物处理领域具有重要的研究优势和广阔的应用前景。

附图说明

图1为富集菌群在不同盐度下对甲苯的降解曲线，(■) 1 M NaCl (●) 1.5 M NaCl (▲)2 M NaCl (★)2.5 M NaCl (○)3 M NaCl (◆)3.5 M NaCl (▼)灭菌对照。

图2为驯化菌群的过程，2 M NaCl下不断加入甲苯对菌群驯化富集，该菌群对甲苯的降解曲线，(▲)驯化的菌群 (●)灭菌对照组。

图3为富集菌群在1~ 3.5 M NaCl盐度下，以甲苯和MSM为培养基培养4个月后在不同盐度下16S rDNA的DGGE电泳图。

图4为1~3.5 M NaCl盐度下以甲苯和MSM培养的富集菌群的16S rDNA序列建树。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式做详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1. 中度嗜盐菌群的驯化富集培养

a．用干净、灭菌的铁铲采集地表下5~10厘米带有泥水的土样，然后迅速放入无菌的自封袋中，上部留出部分空气，将自封袋带回实验室后放置于4℃的冰箱中保存。

b．在125 ml血清瓶中加入盐浓度分别为1 M、1.5 M、2 M、 2.5 M 、3 M、 3.5 M NaCl 的基础无机盐（MSM）培养基40 ml，500 ul微量元素和500 ul维生素。MSM培养基组成包括：

Figure 2012102328115100002DEST_PATH_IMAGE002

微量元素组成包括：

MnCl₂·4H₂O	0.1
		CoCl₂·6H₂O	0.19
SnCl₂	0.07
		H₃BO₃	0.03
NiCl₂·6H₂O	0.024
		Na₂MoO₄·2H₂O	0.036
CuCl₂·2H₂O	0.002
		25% HCl（7.7 M）	10 mL
Distilled water（1L）	990mL

维生素组成包括：

维生素B₁₂	0.1
		烟酸	0.2
D-泛酸钙	0.1
		盐酸吡哆醇B₆	0.3
二水盐酸硫胺	0.2
		对氨基苯甲酸	0.08
生物素	0.02
		ddH₂O	1L

磁力搅拌2h溶解，在121℃下将培养基灭菌20min。

c．取土样10 g加入到上述血清瓶中，在1 M和1.5 M氯化钠的培养瓶中加入9.0 ul纯的甲苯，在2 M、 2.5 M、 3 M和3.5 M氯化钠的培养瓶中加入6.0 ul纯的甲苯作为唯一碳源和能源，迅速用丁基橡胶塞和铝盖将血清瓶塞紧以尽量减少挥发，倒置于30℃培养箱中好氧培养。培养瓶中的空气作为菌群生长所需氧气的来源。将同一土样在121℃灭菌20分钟后，其他条件均与上述相同，作为灭菌对照组。

d．每2~3天检测一次培养液内的甲苯浓度，在降解完全后打开瓶塞，重新加入相同浓度的纯甲苯，换新的塞子继续培养。重复此过程6~7次后，在无菌条件下移取30%的菌液转接至新配置的盐浓度分别为1 M、1.5 M、2 M、 2.5 M 、3 M、 3.5 M NaCl的MSM培养基中，与上述方法相同，反复加入甲苯。重复此转接培养过程，直至血清瓶中全部为不含污泥的菌液。

实施例2 . 菌群在不同盐度下对甲苯的降解能力

在得到不含淤泥的菌液后，测定在1 M~3.5 M各个盐浓度下驯化出的菌群对甲苯的降解能力，如图1所示。

该菌群在NaCl浓度为1 M 或者1.5 M时，可以在7天内完全降解150 mg/L的甲苯。在NaCl浓度为2 M 或者2.5 M时，完全降解100 mg/L的甲苯分别需要9天和11天。在NaCl浓度为3 M 或者3.5 M时，该菌群要完全降解100mg/L的甲苯则需要更久的时间，约15天。该结果表明，本发明从土样中成功驯化富集得到了在1 M~3.5 M这样一个很宽的盐度范围内有效降解苯系物的菌群。

上述实验过程均设置了灭菌对照样，结果表明对照组中没有生物降解发生，只有极微量的挥发可忽略不计。

实施例3. 中度嗜盐菌群的连续驯化

在上述驯化40天后得到的菌群中，选择在2 M NaCl（11.7%）的盐度下，往培养基中不断加入100~120mg/L的纯甲苯连续驯化。驯化过程中，隔天取微量培养液通过气相色谱检测底物甲苯的降解，当培养液中的甲苯浓度低于气相色谱的检测限时，重新添加纯的甲苯至终浓度为100~120mg/L。该过程重复进行100天以上，驯化前后菌群对甲苯降解能力的变化如图2所示。该菌群在驯化之初完全降解100mg/L的甲苯需要9天，而到驯化末期，该菌群可在5天内完全降解120mg/L的甲苯。结果表明，尽管驯化过程中甲苯浓度不断提高，但菌群对甲苯的降解时间越来越短。说明本发明所设计的菌群连续驯化方法是十分有效的，经上述连续驯化得到的嗜盐降解菌群对甲苯的降解速率和耐受浓度均有显著提高。

实施例4. 降解菌群的多样性与优势菌种的系统发育分析

本发明通过PCR-DGGE的方法分析了经不同盐度水平驯化4个月后甲苯降解菌群的多样性。DGGE条带图如图3所示。各个条带的测序结果序列已提交Genebank，序列号为：JQ618279~JQ618284。

对DGGE条带割胶测序结果的BLAST分析表明，Marinobacter在1 M 和 1.5 M NaCl盐浓度下均大量存在，而另一菌种Prolixibacter为1.5 M NaCl浓度下的优势菌种；2 M 和 2.5 M NaCl浓度下为Balneola，而Halobacillus则为3 M 和 3.5 M NaCl 浓度下的优势菌种。

本发明对1~3.5 M NaCl 盐度下培养的甲苯降解菌群建立了系统发育树如图4所示。经16S rRNA鉴定，本发明驯化富集得到的甲苯降解菌群中的优势菌种分别属于红球菌属、单胞菌属和柠檬酸杆菌属，其最适NaCl浓度(w/v)为5%-10%，耐盐范围为0-20%。这些优势菌种也是在宽范围的盐浓度条件下有效降解苯系物的功能菌。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌群的构建：将受苯系物污染的高盐土样接种至NaCl浓度为1M—3.5M的基础无机盐培养基中，并加入甲苯作为唯一碳源和能源，在30℃、120r/min下好氧培养获得菌液；

（2）菌群的连续驯化：待甲苯降解完全后重新投加甲苯，每隔一定时间后，在无菌条件下移取体积含量为30%的菌液转接至新配置的步骤（1）所述的基础无机盐培养基中，并继续加入甲苯培养，经过6—7次驯化和富集，得到中度嗜盐菌群。

2. 根据权利要求1所述的一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法，

其特征在于，所述基础无机盐培养基中NaCl浓度为1.5M。

3. 根据权利要求1所述的一种降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群的构建方法，

其特征在于，所述甲苯的浓度范围为100~120 mg/L。

4. 利用权力要求1所述的构建方法获得的降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群，

其特征在于，所述菌群包括Marinobacter， Prolixibacter，Balneola和Halobacillus中的一种或几种。

5. 利用权力要求1所述的构建方法获得的降解高盐苯系物的中度嗜盐菌群在

降解甲苯中的应用。