CN111004749B - 一株耐盐的迟缓芽孢杆菌gbw-hb1902及其应用 - Google Patents

一株耐盐的迟缓芽孢杆菌gbw-hb1902及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株耐盐的迟缓芽孢杆菌GBW‑HB1902及其应用。所述的迟缓芽孢杆菌GBW‑HB1902的分类命名为迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus，其保藏编号为CGMCC No.18392，该菌菌落为圆形，淡黄色，直径1‑2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环；最适生长温度为28‑32℃，pH值为7.2‑8.5。迟缓芽孢杆菌GBW‑HB1902具有耐广盐性，可以在20～40‰的盐浓度下正常生长，并具有在高盐环境中快速降解污水中氨态氮的能力，能够有效改善难降解氨态氮水体的生物处理效果和污水处理设施在高盐极端环境条件下的运行稳定性，具有广阔的应用前景。

Description

一株耐盐的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株耐盐的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902 及其应用。
背景技术
垃圾渗滤液是垃圾在堆放和处理过程中由于发酵、雨水冲刷和地表水、地下水浸泡而渗滤出来的污水。渗滤液是一种成分复杂的高浓度有机废水，其性质取决于垃圾成分、垃圾的粒径、压实程度、现场的气候、水文条件和填埋时间等。目前，许多干旱和沿海地区的水资源短缺，为了缓解淡水资源日益紧缺的局面，一些沿海地区已经推行直接将海水应用于工业生产和生活中，这也导致了排放的废水中含有大量的无机盐。另外，杀虫剂、除草剂、有机过氧化物、制药和染料等化学制造业，肉类加工厂和海产品加工厂等排放的生产废水中，也含有大量的无机盐。这些高盐、高有机物的废水就会导致生活垃圾渗滤液的高盐度，而这种高盐度则是垃圾渗滤液的一大处理难点，因此这些渗滤液废水中除了含有有机污染物外，还含有大量的无机盐，如Gl-，SO4 2-，Na+，Ca2+等离子，若渗滤液未经处理直接排放，就会给生态环境带来极大的污染和危害，并严重影响人们的生活质量和身体健康。
生物处理法现在已被广泛应用于废水的处理中。但高含盐废水中的无机盐对一般微生物具有较强的抑制作用。因此，寻找耐盐微生物和嗜盐微生物，会在高含盐废水处理中发挥了积极作用，并且利用耐盐菌或嗜盐菌接种也是改进好氧活性污泥处理含盐废水的最佳方法。
发明内容
本发明克服了上述现有技术中的不足和缺陷，提供了一种耐盐的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902及其应用，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902具有很好的耐盐特性，能够高效去除废水中的氨态氮。
为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：
本发明提供了一株迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902，分类命名为迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus，保藏编号为CGMCC No.18392。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的菌落为圆形，淡黄色，直径 1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌具有广盐性，生长盐度范围为20～40‰。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生长温度为15～40℃，最适生长温度为28-32℃。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生长pH值为6～9，最适pH值为7.2-8.5。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902为好氧菌，其最适生长溶解氧浓度为2-4mg/L。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902繁殖速度快，培养3h后进入对数生长期，12-14h时进入对数生长末期，菌数达到3×1010cfu/mL。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的适宜生长培养基中包括酶解豆粕、玉米面和葡萄糖。
进一步的，所述酶解豆粕是采用中性蛋白酶于37-40℃酶解获得。
进一步的，所述中性蛋白酶的添加量为800-1000U/g。
本发明还提供了所述的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在制备用于降解高盐垃圾渗透液中氨态氮的微生物菌剂中的应用。
进一步的，在所述应用时，使用的是迟缓芽孢杆菌发酵菌液；所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902经发酵培养获得迟缓芽孢杆菌发酵菌液；所述迟缓芽孢杆菌 GBW-HB1902的发酵条件为：罐压0.1～0.2MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％，搅拌速度200～220rpm，发酵时间14～17h。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌发酵菌液的添加量为污水处理池体积的 0.1-0.3‰。
进一步的，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的氨态氮去除率为80％以上。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：
本发明的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902分离自高盐水体环境，具有耐广盐性，在20～40‰的盐度范围内均能生长良好。迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在体外培养繁殖快，在12-14h就能达到对数末期；并且该菌在高盐环境中，具有快速降解污水中氨态氮的能力，其降解率能够达到80％以上，因此其可作为微生物强化菌剂开发用于高盐度垃圾渗滤液中氨态氮去除产品，应用于高盐污废水处理中，能够有效解决高盐度污水处理系统微生物生化性差，污染物去除效率低等问题，改善难降解氨态氮水体的生物处理效果和污水处理设施在高盐极端环境条件的运行稳定性，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在2216E平板上的菌落形态特征。
图2为所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生长曲线。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
下述实施例中所需培养基的配方如下：
1、高盐度氨态氮降解菌富集筛选液体培养基：葡萄糖5g，(NH4)2SO41g， Na2CO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.4g，NaCl 30g，pH 7.5-8，蒸馏水1L。
2、高盐度氨态氮降解菌分离纯化固体培养基：葡萄糖5g，(NH4)2SO40.5g，Na2CO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.4g，NaCl 30g，琼脂粉12g，pH 7.5～8，蒸馏水1L。
3、改良营养肉汤(NB)培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，(NH4)2SO4 2g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、水1L、pH 7.2～7.5。
4、改良营养肉汤(NB)固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g， (NH4)2SO42g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、琼脂粉15g、水 1L、pH 7.2～7.5。
5、2216E固体培养基：蛋白胨5.0g/L，酵母粉1.0g/L，柠檬酸铁0.1g/L，氯化钠19.45g/L，氯化镁5.98g/L，硫酸钠3.24g/L，氯化钙1.8g/L，氯化钾0.55g/L，碳酸钠0.16g/L，溴化钾0.08g/L，氯化锶0.034g/L，硼酸0.022g/L，硅酸钠0.004g/L，氟化钠0.0024g/L，硝酸钠0.0016g/L，磷酸氢二钠0.008g/L，琼脂15g/L，pH 7.6 ±0.2。
6、发酵培养基：葡萄糖100g/L、玉米浆干粉20g/L、NaCl 5g/L、(NH4)2SO42g/L、KH2PO40.15g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、Na2HPO44g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、余量为水，液体培养基的pH为6.5～7.5。
实施例1：迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的筛选、分离与鉴定
1、迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的筛选与纯化
取垃圾渗滤液、海水、盐碱地土样各2g，加入50mL的PBS缓冲溶液中，振荡5min，使样品充分混匀，1000rpm离心5min，收集样品上清液，备用。取10mL 上述样品上清液，分别加入到装有200mL高盐度氨态氮降解菌富集筛选液体培养基的锥形瓶中，28℃，150rpm恒温摇床培养3d，富集3次。取培养的菌悬液梯度稀释后取100μL涂布于高盐度氨态氮降解菌富集筛选固体培养基上，置于28℃培养箱培养。在48h之后，挑取不同形态单菌落在2216E固体培养基上划线培养，重复分离纯化3次，最后得到单菌落，将该单菌落命名为GBW-HB1902。
如图1所示，所述菌株GBW-HB1902在2216E平板上的菌落为圆形，淡黄色，直径1-2μm，表面光滑湿润有光泽，中间略凸起，不透明，边缘整齐，无晕环。
2、迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的鉴定
以所述的菌株GBW-HB1902的DNA为模板，使用16S rRNA通用引物进行扩增，扩增片段进行序列测定，将得到的菌株GBW-HB1902的16S rDNA测序结果与GenBank中的序列进行比对分析，结果显示，菌株GBW-HB1902与Bacillus lentus同源性最高，因此确定该菌株GBW-HB1902为迟缓芽孢杆菌。
将筛选到的菌株GBW-HB1902进行菌种保藏，所述迟缓芽孢杆菌 GBW-HB1902的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年08月16日；迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus的保藏编号为CGMCC No.18392。
实施例2：迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生长测定及生理生化特征
1、迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生长测定
将斜面培养的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902接种至改良NB培养基中，在pH 7.2-7.5，28-32℃下恒温摇床培养24h，制得GBW-HB1902菌液，其中每1.0h取样一次，在OD600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。如图2所示，实验结果表明， GBW-HB1902在培养的前3h为生长迟缓期，随后进入对数生长期，待培养至12-14 h时进入对数生长末期，菌数达到3×1010cfu/mL，14-20h为生长稳定期，接着进入衰亡期，从而完成整个生长周期。
2、迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生理生化特征
将制得的GBW-HB1902菌液在NB培养基中进一步培养后，根据《伯杰细菌鉴定手册》的菌株生理生化检测方法对迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902进行检测。结果如表1所示，迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在15～40℃温度范围都能正常生长，最适生长温度为28～32℃；在pH值6～9的范围内均能生长，最适生长pH值为 7.2～8.5，对酸性环境的耐受性差；在溶氧含量1～5mg/L范围内都能正常生长，最适生长溶解氧浓度在2～4mg/L，因此迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902属于好氧菌；并且该菌能够产生尿素酶、β-葡萄糖苷酶和甘油，能够降解或分解动力-硝酸盐、西蒙式枸橼酸盐和半固体琼脂。另外，迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902适宜生长的培养基配方如下：酶解的豆粕20g/L、玉米面10g/L、葡萄糖50g/L、NaCl 30g/L、 (NH4)2SO42g/L、KH2PO40.15g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、Na2HPO4 4g/L、 MgSO4·7H2O 0.05g/L、余量为水，液体培养基的pH为5～7.8；所述酶解的豆粕是将豆粕采用中性蛋白酶40℃酶解1h制得，中性蛋白酶的添加量为1000U/g。
表1迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的生理生化特征
Figure BDA0002337291540000051
注：<+>表示阳性，<->表示阴性。
实施例3：迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的盐度耐受试验
为了检验迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在高盐度条件下的存活性能，对其在不同盐度的耐受情况进行检测。将NB培养基使用氯化钠配制成不同盐浓度，然后将斜面培养的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902接种至不同盐浓度的NB培养基中，在 pH 7.2-7.5，28～32℃恒温摇床培养18h，得到迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902菌液，检测该菌在不同盐浓度培养基中的生长状况。结果如表2所示，GBW-HB1902具有广盐性，在20～40‰盐度范围内均能生长良好。
表2迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在不同盐浓度中的生长情况
Figure BDA0002337291540000061
实施例4：氨态氮去除率测试
采用奈氏试剂比色法(GB-7479.87)检测水体氨态氮浓度。模拟高盐度条件 (盐度32‰、pH 7.8、温度28～32℃，溶解氧≥2mg/L)下，迟缓芽孢杆菌 GBW-HB1902对含有不同浓度氨态氮水体的48h处理实验，并计算氨态氮去除率，每浓度梯度设3个重复实验。
将迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902种子液按20％的体积比接种至发酵培养基中，调整罐压为0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％，搅拌速度为200rpm，发酵15h，得到迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902发酵菌液。取60mL发酵菌液离心，随后加入 15mL无菌水将沉淀了的菌体重悬混匀，然后各取1mL菌悬液分别加入到体系均为100mL的5个不同初始氨态氮浓度的测试液中，进行48h氨态氮去除率的试验。结果如表3所示，经过48h处理后，迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在高盐度条件下对多种不同初始浓度的氨态氮都具有较好的去除效果，且去除率均在80％以上，表明该菌株可以在高盐条件下有效去除垃圾渗透液中的氨态氮，具备高盐快速降解渗透液中氨态氮的功能，在对高盐度垃圾渗透液中氨态氮去除方面具备重大应用价值与意义。
表3迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的48h氨态氮去除率测试结果
Figure BDA0002337291540000062
本发明所述的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在实际应用中使用方法简单，其步骤如下：将迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在罐压为0.1MPa，温度28～30℃，溶氧≥30％，搅拌速度为200rpm的条件下，发酵15h制成发酵菌液；然后直接从好氧池进水口添加污水生化处理好氧池体积的0.1-0.3‰的发酵菌液进好氧池中即可，便可以达到有效去除污水或渗透液中氨态氮的目的，提高污水处理效率和质量。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一株迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902，其特征在于，其分类命名为迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus，保藏编号为CGMCC No.18392。
2.权利要求1所述的迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902在制备用于降解高盐垃圾渗透液中氨态氮的微生物菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902经发酵培养获得迟缓芽孢杆菌发酵菌液；所述发酵温度28～30℃，发酵时间14～17h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述迟缓芽孢杆菌发酵菌液的添加量为污水处理池体积的0.1-0.3‰。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述迟缓芽孢杆菌GBW-HB1902的氨态氮去除率为80%以上。
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