CN102965298B - 赖氨酸芽孢杆菌及其降解mc-lr的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明赖氨酸芽孢杆菌及其降解MC-LR的方法，属于环保水处理技术领域。提供了纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillusfusiformis），保藏编号为CGMCC NO.6107。本发明还提供了利用纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillusfusiformis）菌种降解MC-LR的方法。赖氨酸芽孢杆菌能与蓝藻共生，能够适应自然环境，且该菌对MC-LR的分解利用具有专一性，外加碳源能够较大程度地促进其降解作用，对于利用微生物法去除长期遭受蓝藻水华污染的大面积水体中的MC-LR具有较广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于环保水处理技术领域，具体涉及一种从太湖流域蓝藻藻浆压滤液中筛选的1株赖氨酸芽孢杆菌及利用其降解微囊藻毒素-LR（MC-LR）的方法。
背景技术
近年来，随着经济的快速发展，工、农业已呈现大规模机械化，作业过程中产生的大量含氮磷废水皆就近排入附近河流、湖泊等水体，带来的富营养化问题已日趋严重，蓝藻水华频繁暴发。据研究报道，25%-70%的蓝藻水华污染可产生微囊藻毒素（MCs）。MCs是一类环状七肽肝毒素，具有90多种同分异构体，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）和微囊藻毒素-RR（MC-RR）是我国蓝藻水华水体中出现频率及含量较高的两种类型。MCs在水中的溶解度大于1.0 g/L，不易被沉积物、悬浮颗粒物吸附，几乎全部以溶解性状态分布于水体中，可在水生生物体内富集，并通过食物链进入人体，低剂量的MC-LR即可引发原发性肝癌、大肠癌、胰腺癌等疾病，严重危害人类健康，世界卫生组织和我国的饮用水标准均规定了MC-LR不超过1.0 μg/L的限值。
MC-LR因具有环状结构化学性质稳定，在自然条件下降解过程非常缓慢，且具有热稳定性，煮沸30 min也不能破坏其毒性，常规水处理工艺对其去除率较低。目前，去除MC-LR的方法主要有化学法、物理法和生物法等，其中微生物降解法是公认的最为安全有效的方法。据公开研究报道，能够降解MC-LR的微生物种类稀少，种群结构单一，仅局限于某些特殊菌株。如公开号为CN1785851的发明专利，从滇池底泥中筛选出1株降解MCs的食酸戴尔福特菌。《农业环境科学学报》2009年第28卷第8期1669-1675页报道了杨静东等采用从太湖水华蓝藻细胞中提取的MCs作为微生物生长的唯一碳源和氮源，从富营养化的太湖水体中筛选出降解MCs的微生物菌群。公开号为CN102154170的发明专利，是本发明人从太湖河浜底泥中筛选出1株降解MC-LR的球形芽孢杆菌。但目前已报道的MC-LR降解菌仅在特定条件下表现出高效性，常用外加碳源对其降解性能多具有抑制作用，菌剂制备碳源选择受限，以致于MC-LR降解菌在实际工程中的应用难以大规模实现。
根据生物进化论适者生存的原理，蓝藻水华水体中可能存在与蓝藻共生的细菌，本发明以取自常州雪堰镇藻水分离站的太湖蓝藻藻浆压滤液作为MC-LR降解菌的来源，通过驯化、富集、分离纯化，从中筛选出1株具有MC-LR降解能力的赖氨酸芽孢杆菌。本发明提供的这株赖氨酸芽孢杆菌对MC-LR的分解利用具有专一性，常用外加碳源能够促进其降解MC-LR，因此，这种与蓝藻共生的细菌在天然水体中更易繁殖，且能成为优势菌种，在蓝藻水华污染治理中的应用前景更为广阔。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，针对MC-LR难以有效去除的难题而提供的一种从蓝藻藻浆压滤液中筛选的对MC-LR分解利用具有专一性的赖氨酸芽孢杆菌，并利用其降解MC-LR的方法。
本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了MC-LR降解菌R3，建议的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）。已于2012年5月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.6107。
利用上述菌种降解MC-LR的方法，按照下述步骤进行：
将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）单菌落接种于营养肉汤液体培养基中于温度30℃、摇床转速130 r/min条件下培养20 h至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培养基中，相同条件下培养20 h至对数期，备用。
将上述对数期赖氨酸芽孢杆菌按照投菌量为2-10%（以体积分数计）的比例接种到以MC-LR为唯一碳源、pH值为5.0-9.0的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养7 d即能够有效地降解MC-LR。
上述降解MC-LR的方法优选：以体积分数计为4-6%的投菌量接种到以MC-LR为唯一碳源、pH值为7.0的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养7 d。
其中所述的营养肉汤液体培养基组成如下：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。
其中所述的无机盐培养基组成如下：K2HPO4 1.6 g，KH2PO4 0.4 g，NH4Cl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 25 mg，FeCl3·6H2O 2.3 mg，适量MC；蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。
本发明的主要优点：
1、本发明选用价廉易得的营养肉汤培养基分离筛选、纯化MC-LR降解菌，具有成本低、安全、高效等优点。
2、本发明选择太湖蓝藻藻浆压滤液作为MC-LR降解菌的菌种分离源，所筛选出的1株赖氨酸芽孢杆菌能与蓝藻共生，能够适应自然环境，且该菌对MC-LR的分解利用具有专一性，外加碳源能够较大程度地促进其降解作用，对于利用微生物法去除长期遭受蓝藻水华污染的大面积水体中的MC-LR具有较广阔的应用前景。
具体实施方式
菌株的筛选及鉴定：
1、样品采集
以取自常州市雪堰镇藻水分离站的太湖蓝藻藻浆压滤液作为MC-LR降解菌的菌种分离源。筛选降解菌用到的MC-LR是在实验室条件下从太湖蓝藻细胞中提取、提纯的。
2、培养基配制
营养肉汤培养基：称取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g及NaCl 5 g于烧杯中，加入蒸馏水1000 mL，在电炉上加热，并搅拌，使之快速溶解，调节pH至7.0-7.2，然后分别取100 mL培养基于锥形瓶中，用纱布和牛皮纸将锥形瓶封好，放入高压锅中121℃灭菌20 min。固体培养基加入琼脂2.4%。
无机盐液体培养基：称取K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4 g，NH4Cl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 25 mg，FeCl3·6H2O 2.3 mg，MC 49.07 μg于烧杯中，加入蒸馏水1000 mL，调节pH至7.2-7.4，于高压锅中121℃灭菌20 min。
3、筛选方法
将采集的水样10 mL接入内装玻璃珠和90 mL无菌水且已灭菌的锥形瓶中，将该锥形瓶放入温度30℃的摇床中，转速130 r/min，摇匀，取10 mL接入50 mL以MC-LR作为唯一碳源的无机盐培养基中进行驯化培养4 d，共4次，逐次增加MC-LR的浓度。然后进行倍比稀释将样品稀释到10-5、10-6、10-7，采用涂布法进行分离，每个梯度做3个平行。根据菌落形态、大小、颜色等挑选其中长势较好的菌落，在以MC-LR为唯一碳源的固体培养基中划线分离培养2-3 d，然后进行纯化培养，继代5-6次，得到相对优势的MC-LR降解菌株。
4、菌株形态及生理生化性能
通过对菌株进行形态观察、染色反应和生理生化测定，并根据科学出版社《常见细菌系统鉴定手册》（2001）对其进行鉴定。
形态学特征：菌落为圆形、较大，呈淡黄色透明状，边缘平滑整齐，中间凸起，有粘性，油镜下观察，菌体为杆状。
生理生化特征：革兰氏染色阴性，接触酶阳性，好氧，乙酰甲基醇（V.P）阴性，甲基红（M.R）阴性，糖或醇类发酵无变化，淀粉水解、产硫化氢阴性，硝酸盐还原阳性，葡萄糖氧化发酵产酸。
5、菌株的16S rDNA序列同源性分析
通过将菌株的16S rDNA序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank中的已知序列比对，该菌株与序列登录号为JF742762的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌ZB2（Lysinibacillus fusiformis）相似度高达99.9%，且在基于距离法构建的系统发育树中两菌株处于同一分支，自展值为100，其中重复数设置为1000，可信度高。
本发明提供了MC-LR降解菌R3，建议的分类命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）。已于2012年5月11日保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.6107。
根据16S rDNA序列同源性分析，结合菌株的形态学特征及生理生化特性，初步鉴定本发明所筛选出的MC-LR降解菌为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）。该菌在NCBI的GenBank中申请的序列登录号为JQ991002。
利用上述菌株降解MC-LR的具体实施例如下：
实施例1
将对数期（20 h）赖氨酸芽孢杆菌按照体积分数5%的投菌量接种至初始MC-LR浓度49.07 μg/L，pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的无机盐培养基中，置于摇床温度30℃，转速130 r/min条件下培养7 d，采用酶联免疫法测MC-LR剩余浓度。7 d后，当pH为5.0时，MC-LR的去除率为33.80%；当pH为6.0时，MC-LR的去除率为40.96%，当pH为7.0时，MC-LR的去除率为46.47%，当pH为8.0时，MC-LR的去除率为41.22%，当pH为9.0时，MC-LR的去除率为30.13%。可见，酸性和碱性条件，都不利于该菌株生长，最适pH为7.0，这与一般MC降解菌都适于生存在中性稍偏碱环境相一致。据检测，蓝藻暴发时水体pH值为7.0-8.0，因此，该菌在实际工程应用时满足其pH条件，能够充分发挥其降解作用。
实施例2
将对数期（20 h）赖氨酸芽孢杆菌分别按体积分数2%、4%、6%、8%、10%的投菌量接种于pH值为7.0，MC-LR初始浓度为49.07 μg/L的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养，7 d后采用酶联免疫法检测MC-LR剩余浓度。当接种量为2%时，MC-LR的去除率为13.16%；当接种量为4%时，MC-LR的去除率达到46.69%；当接种量为6%时，MC-LR的去除率为46.07%；当接种量为8%时，MC-LR去除率为25.98%；当接种量为10%时，MC-LR的去除率仅为5.73%。可见，最佳投菌量为4-6%，接种量过多或过少都不利于MC-LR的去除，最佳投菌量是微生物充分利用MC-LR而将之去除的关键因素。
实施例3
将对数期（20 h）赖氨酸芽孢杆菌按照体积分数5%的投菌量接种至pH值皆为7.0，初始MC-LR浓度分别为7.73、24.73、30.92、92.75、123.66 μg/L的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养，7 d后采用酶联免疫法检测MC-LR剩余浓度。当MC-LR的初始浓度为7.73 μg/L时，MC-LR去除率为21.96%；当MC-LR的初始浓度为24.73 μg/L时，MC-LR去除率为22.04%；当MC-LR的初始浓度为30.92 μg/L时，MC-LR去除率为41.22%；当MC-LR的初始浓度为92.75 μg/L时，MC-LR去除率为18.84%；当MC-LR的初始浓度为123.66 μg/L时，MC-LR去除率为12.59%。可见，MC-LR初始浓度对MC-LR的去除有较大影响，MC-LR浓度过低或过高都不利于该赖氨酸芽孢杆菌利用MC-LR而将其去除。
实施例4
将对数期（20 h）赖氨酸芽孢杆菌按照体积分数5%的投菌量接种至pH值皆为7.0，分别含无菌水、甲醇、乙醇、葡萄糖不同外加碳源的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养，7 d后采用酶联免疫法检测MC-LR剩余浓度。MC-LR初始浓度为39.26 μg/L，7 d后，当MC-LR为唯一碳源时，MC-LR去除率为21.52%；当甲醇为外加碳源时，MC-LR去除率为30.26%；当乙醇为外加碳源时，MC-LR去除率为36.90%；当葡萄糖为外加碳源时，MC-LR去除率为59.26%。可见，这3种碳源对该赖氨酸芽孢杆菌去除MC-LR都有一定的促进作用，其中葡萄糖的促进作用最强。
Claims (3)
1.纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），保藏编号为CGMCC NO.6107。
2.利用权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）菌种降解MC-LR的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
将纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）单菌落接种于营养肉汤液体培养基中于温度30℃、摇床转速130 r/min条件下培养20 h至对数期，再按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤液体培养基中，相同条件下培养20 h至对数期，备用；
将第二次培养至对数期的赖氨酸芽孢杆菌按照投菌量以体积分数计为2-10%的比例接种到以MC-LR为唯一碳源、pH值为5.0-9.0的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养7 d即能够有效地降解MC-LR。
3.根据权利要求2所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）菌种降解MC-LR的方法，其特征在于以体积分数计为4-6%的投菌量接种到以MC-LR为唯一碳源的pH值为7.0的无机盐培养基中，在30℃摇床转速130 r/min下培养7 d。
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