CN102206605A - 具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用 - Google Patents

Abstract

一种微生物应用技术领域的具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用，通过从太湖水体中分离获得具有较强溶藻活性的微小杆菌A27(Exiguobacterium sp.A27)，保藏号CGMCC No.4114。用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

Description

具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用

技术领域

本发明涉及的是一种微生物应用技术领域的菌株及方法，具体是一种具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用。

背景技术

随着全球水体富营养化的加剧，有害藻类水华的爆发日趋频繁，其造成的环境和经济问题日益引起人们的重视，针对我国湖泊面临的严重富营养化问题，在湖内污染源、流域点源与面源污染控制需要投入巨大资金且短期内难以取得成效的情况下，探索控制浮游藻类生物量和抑制“水华”发生的有效途径是非常必要的。藻类的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法主要是电磁场、机械除藻等，可作为蓝藻水华控制的辅助性措施，但处理能力有限。化学除藻的方法主要包括施用除草剂、杀藻剂及金属盐等，化学药剂除藻技术虽有快速高效的优点，但会带来水体的二次污染问题，不适于在作为饮用水源地的水域应用。在利用物理、化学和常规方法治理水华不甚理想的情况下，寻找一种更加有效的水华防治途径势在必行。

溶藻细菌作为防治水华的可能微生物已经引起越来越多的关注。据报道，多数溶藻细菌能够分泌胞外物质，可对宿主藻类起到抑制或者灭杀的作用，因此通过筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌产生的高效溶藻物质开发生物杀藻剂就成为一个很有发展潜力的新思路。从自然水体中分离纯化出可以抑制和灭杀铜绿微囊藻(Microcystis)(蓝藻水华中最常见和主要藻类)的溶藻细菌，对于安全、快速和高效治理蓝藻水华问题具有重要的实践价值。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有溶藻活性的微小杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用，从太湖水体中分离获得了一株具有较强溶藻活性的微小杆菌A27，可以用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一株具有溶藻活性的微小杆菌A27，其学名为：Exiguobacterium sp.A27，该菌株为杆菌，1.1～1.2μm×1.4～3.2μm，革兰氏阳性，不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在pH6.5～11.5生长。化能异养菌，发酵代谢。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸，主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性，氧化酶阴性。可以还原硝酸盐，水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37℃。经16s rRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与某微小杆菌菌株有97％的同源性，故鉴定为微小杆菌属细菌，命名为微小杆菌A27，该菌种的16s rRNA基因在GenBank中的登录号是FJ751911。

上述具有溶藻活性的微小杆菌A27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4114，保藏日期为2010年10月1日。

保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，邮编：100101电话：86-10-64807596。

本发明涉及上述微小杆菌A27的无菌发酵液的制备方法，通过将微小杆菌A27接种于pH7.0的灭菌LB液体培养基中，在37℃、200rpm的环境下发酵24小时得到其含菌发酵液；进一步经12000g离心20min后将上清再用0.22μm孔径的膜过滤，得到无菌发酵液。

本发明涉及利用上述微小杆菌A27抑制蓝藻水华，通过将所述微小杆菌A27制备得到的无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。

实验表明，上述微小杆菌A27的溶藻效果具有广谱性。在细菌密度高于4×10⁷个/mL时A27对铜绿微囊藻表现出了很好的溶藻效果，同时微小杆菌A27对处于延滞期和对数期的铜绿微囊藻具有很好的溶藻效果；同时微小杆菌A27用液体LB培养后的含菌发酵液及离心过滤除菌后的无菌发酵液都均有较强的溶藻活性。该无菌发酵液经过高温处理后溶藻活性没有明显下降，说明发酵液中的溶藻成分具有热稳定性。微小杆菌A27发酵液中的溶藻活性成分可以用甲醇提取出来，该甲醇提取物也具有很强的溶藻活性。微小杆菌A27及其发酵液和甲醇提取物均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制。

附图说明

图1为加入的A27菌液中细菌密度差异对溶藻效果的影响示意图；

图中：(a)微小杆菌A27不同接种浓度时铜绿微囊藻细胞密度随时间的变化曲线。(b)微小杆菌A27不同接种浓度时细菌密度随时间的变化曲线(■：对照，●：1.5×10⁴，▲：1.5×10⁵，

1.5×10⁶，1.5×10⁷和1.5×10⁸个/mL)。图中箭头表示接种点。

图2为A27菌液对三个不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果示意图；

图中：■：对照，●：对数期藻，▲：延滞期藻，

平台期藻)。图中箭头表示接种点。

图3为A27无菌发酵液、121℃热处理后的无菌发酵液、发酵液甲醇提取物和空白LB培养基的溶藻效果示意图；

图中：(a)微小杆菌A27的无菌发酵液溶藻效果(浓缩10倍)。(b)微小杆菌A27的无菌发酵液经过高温灭菌后的溶藻效果(浓缩10倍)。(c)微小杆菌A27发酵液的甲醇提取物的溶藻效果.(d)LB培养基溶藻效果(浓缩10倍，作对照)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例

1.溶藻细菌的筛选

将太湖梅梁湾水域采集的自然水样50μl接种于5mL LB液体培养基中培养富集24h(37℃，200rpm发酵培养)，将培养液加入到100mL培养至对数期的铜绿微囊藻PCC7806的藻液(藻细胞密度约1×10⁷个/mL)中。两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂LB平板，37℃培养24h，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。

将筛选出来的溶藻细菌按照1％的比例分别接种入10mL LB培养基中，37℃，200rpm培养24h，将10mL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中(藻细胞密度约1×10⁷个/mL)。另外将10mL灭菌后的LB培养基同样加入90mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养48h后计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率最高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为A27。

藻液培养条件：铜绿微囊藻用BG11液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25℃，光照强度40μmol photons m^-2s^-1，光暗周期比为12∶12。

溶藻效率计算方法：溶藻效率(％)＝(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度＊100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度可以用血球计数板测定。

2.A27菌株的鉴定

用形态观察、染色、生理生化反应、16s rRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的微小杆菌A27进行鉴定，该菌株为杆状，1.1～1.2μm×1.4～3.2μm，革兰氏阳性，不生孢，不抗酸。以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在LB平板上菌落平坦，淡橙色，色素不扩散。嗜碱，能在pH6.5～11.5生长。化能异养菌，发酵代谢。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸，主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性，氧化酶阴性。可以还原硝酸盐，水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37℃。经16s rRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某微小杆菌菌株有97％的同源性，故鉴定为微小杆菌属细菌，命名为微小杆菌A27。该菌种已经保藏于国家微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4114，保藏日期为2010年10月1日。该菌种的16s rRNA基因在GenBank中的登录号是FJ751911。

3.A27菌体密度对溶藻效果的影响

将微小杆菌A27按照1％接种量分别接种于5份LB培养基中(各10mL)，37℃，200rpm摇床培养24h后将菌液12000g离心，弃上清，离心下来的菌体用适量无菌LB重悬后按照1∶9的比例加入90mL铜绿微囊藻藻液(藻细胞密度约1×10⁷个/mL)中，使得五个实验组的初始A27细菌密度分别为1.5×10⁴个/mL，1.5×10⁵个/mL，1.5×10⁶个/mL，1.5×10⁷个/mL，1.5×10⁸个/mL。使用10mL无菌LB+90mL藻液作为对照组。每24h测对照组和五个实验组的藻细胞密度(血球计数板法)和藻液中的A27细菌密度(平板涂布法)，每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式，如图1所示。

实验结果表明：当藻液中的细菌浓度超过一个特定阈值时，微小杆菌A27开始表现出明显的溶藻效果，从图1得出这个细菌密度阈值大约是4×10⁸个/mL。

4.A27菌株对不同生长阶段铜绿微囊藻的溶藻效果

将3份按照步骤3所述方法在LB培养液中培养24小时的A27菌液(各10mL)分别加入到处于延滞期(藻细胞密度约5.25×10⁶个/mL)、对数期(藻细胞密度约1.22×10⁷个/mL)和平台期(藻细胞密度约2.20×10⁷个/mL)的铜绿微囊藻藻液中(各90mL)，在光照培养箱中培养，每24小时用血球计数板法测定对照组和实验组的藻细胞密度，每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式，如图2所示。

实验结果表明微小杆菌A27对于处于延滞期和对数期的铜绿微囊藻具有较好的溶藻效果(2天时溶藻率分别为61.9％和62.6％)，对于平台期藻细胞溶藻效果较差(2天时溶藻率为22.4％)。

5.A27菌株对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果

将13份按照步骤3所述方法培养好的10mLA27菌液分别加入13株蓝藻和真核藻(表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用空白LB培养基分别加入13种藻液中作为对照(1∶9)，在光照培养箱中培养48h后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式。

本实验中用到的藻种有7株购自武汉水生所藻种库，另外6株筛选自太湖水体。实验结果表明，微小杆菌A27对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果，对两株真核藻种(绿藻M7和衣藻BS3)没表现出很好的溶藻效果(表1)。此结果表明微小杆菌A27的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。

表1.微小杆菌A27对13株藻株的溶藻效果

注：表中用星号(＊)标记的藻株是从太湖梅梁湾水体中筛选得到的，其余藻株都是购买自武汉淡水藻种库。

6.A27发酵液、无菌发酵液和其甲醇提取物的制备方法

将微小杆菌A27按照1％接种量接种于灭菌LB培养基中，37℃下200rpm摇床培养24h后得到微小杆菌A27发酵液(含菌)。此含菌发酵液经过12000g离心20min后再用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后得到A27无菌发酵液。将100mL无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后，残留固体用1L的甲醇浸泡过夜，再将甲醇溶液经过12000g离心20min后取上清，蒸干后得到A27无菌发酵液的甲醇提取物。

7.A27菌株溶藻方式的研究

将2mLA27发酵液按照步骤6所述的方法制成无菌发酵液，用离心干燥器浓缩10倍后得到其无菌浓缩上清。另外将2mLA27无菌发酵液在121℃下灭菌20min后在用离心干燥器浓缩10倍后得到其高温处理后的无菌浓缩上清。另外将2mLA27发酵液按照步骤6所述的方法制成甲醇提取物，用200μl无菌水溶解后备用。最后把2mL的灭菌LB培养基同样离心干燥浓缩10倍作为对照。将按照上述方法制得的A27无菌浓缩上清、高温处理的无菌浓缩上清、甲醇提取物以及浓缩LB对照分别加入圆纸片(直径1cm)上，放置于铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养2天后观察圆纸片周围的抑藻圈的形成以判断其溶藻效果。

铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法：向每块平板上倒入适量(约20mL)BG11固体培养基(琼脂比例1.5％)，待其凝固后备用。将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液12000g离心20min后弃掉上清，收集藻细胞沉淀加入到100mL灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1％琼脂，放置于53℃水浴中防止凝固)，摇匀后倒入制好的BG11固体平板上层(每块平板约倒入20mL)，待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。

实验结果显示微小杆菌A27的无菌发酵液有很好的溶藻效果(图3a)，这表明该菌株是分泌某些胞外溶藻物质进行溶藻。经过121℃高温处理后的无菌发酵液也表现出了很好的溶藻能力(图3b)，说明发酵液中的溶藻成分不是大分子蛋白质，具有较强热稳定性。甲醇提取物的溶藻能力(图3c)表明发酵液中的溶藻成分极性较强，容易溶于甲醇这种极性较强的有机溶剂。

Claims (4)

1.一株具有溶藻活性的微小杆菌A27，其特征在于，其名称为：Exiguobacterium sp.A27，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4114，保藏日期为2010年10月1日。

2.一种根据权利要求1所述微小杆菌A27的无菌发酵液的制备方法，其特征在于，通过将微小杆菌A27接种于pH7.0的灭菌LB液体培养基中，在37℃、200rpm的环境下发酵24小时得到其含菌发酵液；进一步经12000g离心20min后将上清再用0.22μm孔径的膜过滤，得到无菌发酵液。

3.一种根据权利要求1或2所述微小杆菌A27的应用，其特征在于，用于抑制蓝藻水华。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，通过将所述微小杆菌A27制备得到的无菌发酵液用旋转蒸发器蒸干后经过甲醇溶取后用于溶藻。

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