CN104130960B - 一株微小杆菌及其有效溶藻成分在控制蓝藻水华中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株微小杆菌及其有效溶藻成分3‑苄‑2,5‑二酮哌嗪在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY‑3109,保藏号为CGMCC No.8980,并且从其代谢产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分3‑苄‑2,5‑二酮哌嗪,该溶藻物质对铜绿微囊藻9110的半数致死量LD50为4.8μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产,最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

Description

一株微小杆菌及其有效溶藻成分在控制蓝藻水华中的应用
技术领域
本发明涉及环境微生物领域,特别涉及一株具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109和分泌的有效溶藻成分3-苄-2,5-二酮哌嗪及其在蓝藻水华控制中的应用。
背景技术
在海洋、湖泊和水库中,蓝藻可以形成水华和赤潮,从而影响和改变水的理化性质,并且能直接和间接引起食藻动物的大量死亡。特别是对于以湖泊水和水库水为水源的饮用水生产,藻类的危害更为严重。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。
目前有一些水华治理方法,如物理法(机械除藻、电磁场除藻、超声除藻),化学法(投入Cu2+杀藻)等。但这些方法或者成本很高难以推广,或者会对生态环境造成次生破坏,均不太理想。由于物理方法和化学方法存在上述缺陷,而生物方法因其环保﹑经济等潜在优点,受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类可以直接(菌藻细胞接触)或者间接(分泌胞外物质)抑制灭杀蓝藻的细菌统称,它们是淡水生态环境系统的重要组成部分,对减少蓝藻的生物量,维持生态平衡具有重要作用。
因此,本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质,以开发微生物杀藻剂,用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
发明内容
鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理成本太高或容易造成二次污染的缺陷,本发明所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质,用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
为实现上述目的,本发明提供了一株具有溶藻活性的微小杆菌及其代谢产物在蓝藻水华控制中的应用。
本发明提供了一株具从太湖水体中分离获得的有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109,该菌的形态为杆状,1.1~1.2μm×1.4~3.2μm,革兰氏阳性,以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦,淡橙色,色素不扩散。嗜碱,能在pH6.5~11.5生长。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其 他糖产酸,主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性,氧化酶阴性。可以还原硝酸盐,水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37℃。经16srRNA基因序列分析和同源性比较,得知该菌株与GenBank中某微小杆菌菌株有99%的同源性,故鉴定为微小杆菌属细菌,命名微小杆菌GLY-3109菌株。
该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号CGMCC No.8980,保藏日期为2014年3月28日。保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所,邮编:100101,电话:86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是KC688875。
进一步地,本发明提供了上述微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用。
进一步地,本发明微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过其发酵产物,包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
微小杆菌GLY-3109发酵产物的制备步骤如下:
1)、发酵微小杆菌GLY-3109菌株,获得发酵液;
2)、用萃取剂萃取发酵液,获得萃取液;
3)、将萃取液蒸干,获得粗提物;
4)、将粗提物溶于水后过滤;
5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质,即为发酵液提取物。
优选地,步骤1)中,发酵条件为,微小杆菌GLY-3109接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中,28℃、220rpm环境条件下发酵48h。
优选地,步骤2)中,萃取剂为乙酸乙酯,萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1,混合后,放入振荡器中振荡24h,分离出的上层乙酸乙酯溶液即微小杆菌GLY-3109发酵液的萃取液。
优选地,步骤3)中,过滤为使用0.22μm孔径滤膜过滤。
优选地,步骤4)中,进一步提纯手段为柱层析,具体为:将滤液通过半制备柱,用HPLC进行初步纯化,得到溶藻成分;将得到的溶藻成分通过分析柱,用HPLC进行进一步纯化,得到具有溶藻活性的有效成分ES-1。
微小杆菌GLY-3109的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过LC-MS和GC-MS分析获得。
有效溶藻成分ES-1的分子离子峰为205.0970,样品分子量为204.0007,分子式为C11H12N2O2,可信度为99.15%;对ES-1进行GC-MS分析,与GC-MS数据库中3-苄-2,5-二酮哌嗪的相似度(similarity index)为936.958,大于850。
进一步地,将样品ES-1的LC-MS和GC-MS结果进行综合分析,有效的溶藻成分ES-1是所述微小杆菌GLY-3109的代谢产物3-苄-2,5-二酮哌嗪,其具有结构式(I)。
经测定,3-苄-2,5-二酮哌嗪(ES-1)对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为4.8μg/mL。
进一步地,本发明所提供的具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109可制成溶藻菌剂。
进一步地,本发明所提供的具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109的发酵产物,包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物,可制成溶藻药剂。
在本发明的实施例3中给出了微小杆菌GLY-3109发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率为:98±2.1%。
本发明的微小杆菌GLY-3109发酵液制备方法简单,制备周期短。微小杆菌GLY-3109的发酵液对太湖中的铜绿微囊藻9110具有很好的溶藻效果,而铜绿微囊藻是太湖蓝藻水华中的主要蓝藻。微小杆菌GLY-3109发酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于蓝藻水华的控制,且溶藻效果较好。其中,微小杆菌GLY-3109发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率达到98±2.1%。微小杆菌GLY-3109的代谢产物3-苄-2,5-二酮哌嗪对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110具有显著的致死作用,可用于新型杀藻剂的研发和生产,最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
以下将结合附图对本发明的微小杆菌GLY-3109菌株及其代谢产物3-苄-2,5-二酮哌嗪在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是加入溶藻菌GLY-3109后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间变化的曲线图;
图2是溶藻菌GLY-3109的发酵液乙酸乙酯萃取液加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果照片;
图3是溶藻物质3-苄-2,5-二酮哌嗪加入到藻液中后,铜绿微囊藻9110的24小时存活率随加入的溶藻物质浓度变化的曲线图。
具体实施方式
实施例1溶藻细菌的筛选
将太湖梅梁湾水域采集的10mL自然水样加入到90mL对数期的铜绿微囊藻9110的藻液中,两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平板,28℃培养24h,取菌落密度适中的平板,按照菌落形态的不同挑选不同菌株。
将筛选出来的菌株分别接种入10mL牛肉膏蛋白胨培养基中,28℃,220rpm培养24h,将10mL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中。另外将10mL灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基同样加入90mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养48h后计算其溶藻效率,选取了其中溶藻效率较高的一株细菌进行进一步研究,该菌株代号为GLY-3109。
藻液培养条件:铜绿微囊藻9110用BG11液体培养基培养,放置于光照培养箱中,25℃,光照强度40μmol photons m-2s-1,光暗周期比为12h:12h(光照:黑暗)。
溶藻效率计算方法:溶藻效率(%)=(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度×100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度用血球计数板测定。
图1为加入溶藻菌GLY-3109后铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的变化曲线(加入溶藻菌GLY-3109(1×108cells/mL)(◆)和空白对照(■))。
实施例2微小杆菌GLY-3109菌株的鉴定
用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对菌株GLY-3109进行鉴定,该菌的形态为杆状,1.1~1.2μm×1.4~3.2μm,革兰氏阳性,以周生鞭毛运动。兼性厌氧。在营养琼脂上菌落平坦,淡橙色,色素不扩散。嗜碱,能在pH6.5~11.5生长。可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖和一些其他糖产酸,主要产物是乳酸、乙酸和甲酸。该菌株接触酶阳性,氧化酶阴性。可以还原硝酸盐,水解明胶、淀粉和酪素。最适生长温度37℃。经16srRNA基因序列分析和同源性比较,得知该菌株与GenBank中某微小杆菌菌株有99%的同源性,故鉴定为微小杆菌属细菌,命名微小杆菌GLY-3109菌株。
实施例3微小杆菌GLY-3109发酵液及其乙酸乙酯萃取液的制备方法
将微小杆菌GLY-3109按照1%接种量接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中,28℃下220rpm摇床培养48h后得到微小杆菌GLY-3109含菌发酵液。将乙酸乙酯按照1:1的比例加入发酵液中,放入振荡器中振荡24h,分离出上层溶液,即乙酸乙酯萃取液。将乙酸乙酯蒸干,加水溶解,再使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后用于进一步纯化代谢产物。
实施例4微小杆菌GLY-3109对铜绿微囊藻的溶藻效果
微小杆菌GLY-3109对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110溶藻效果如图1所示。图1表明,加入微小杆菌GLY-3109后,铜绿微囊藻9110细胞浓度 随时间的延长而下降,第六天时的溶藻率为98±2.1%。其中加入的微小杆菌GLY-3109的起始浓度为1×108cells/mL。而空白对照中铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而上升。
实施例5GLY-3109菌株溶藻机制的研究
将微小杆菌GLY-3109发酵液按照实施例3所述的方法制成乙酸乙酯萃取液,用离心干燥器蒸干后,用无菌水溶解后备用。最后把灭菌牛肉膏蛋白胨培养基同样离心干燥浓缩作为对照。将按照上述方法制得的萃取液以及浓缩牛肉膏蛋白胨对照分别加到圆纸片(直径1cm)上,放置于铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养2天后观察圆纸片周围的抑藻圈的形成以判断其溶藻效果。
铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法:向每块平板上倒入适量(约20mL)BG11琼脂培养基(琼脂比例1.5%),待其凝固后备用。将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液4000g离心20min后弃掉上清,收集藻细胞沉淀加入到100mL灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1%琼脂,放置于53℃水浴中防止凝固),摇匀后倒入制好的BG11固体平板上层(每块平板约倒入20mL),待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。
实验结果如图2所示,显示微小杆菌GLY-3109的发酵液萃取液有很好的溶藻效果,这表明该菌株具有分泌胞外溶藻物质进行溶藻的性能。
实施例6微小杆菌GLY-3109发酵产物中溶藻有效成分的提取纯化
利用HPLC技术将溶藻菌GLY-3109的溶藻发酵产物纯化,得到具有溶藻功能的纯化合物ES-1,具体步骤如下:
将微小杆菌GLY-3109发酵液的萃取液通过DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制备柱,水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行初步纯化,得到溶藻有效成分。然后通过DIKMA SupersilTM C18-EP分析柱,水为流动相的HPLC技术手段进行进一步纯化,得到有效溶藻成分ES-1,用于结构鉴定。
实施例7微小杆菌GLY-3109发酵产物中有效溶藻成分的化学结构鉴定
利用LC-MS﹑GC-MS分析具有溶藻功能的代谢产物的化学结构。
将纯化后的样品ES-1进行LC-MS分析,得到样品ES-1的分子离子峰为205.0970,该物质的分子式被确定为C11H12N2O2,可信度为99.15%。
将纯化后的样品ES-1进行GC-MS分析,与GC-MS数据库中3-苄-2,5-二酮哌嗪的相似度(similarity index)为936.958,大于850。
将样品ES-1的LC-MS和GC-MS结果进行综合分析,可以确定具有溶藻效果的代谢产物ES-1是3-苄-2,5-二酮哌嗪,其化学结构如下式所示。
实施例8微小杆菌GLY-3109溶藻代谢产物3-苄-2,5-二酮哌嗪的溶藻效能研究
将3-苄-2,5-二酮哌嗪加入到太湖中主要的蓝藻即铜绿微囊藻藻液中,使3-苄-2,5-二酮哌嗪的浓度形成一个系列:10μg/mL﹑5μg/mL﹑4μg/mL﹑3μg/mL﹑2μg/mL和1μg/mL。将加入3-苄-2,5-二酮哌嗪的铜绿微囊藻9110放入光照培养箱中培养24小时后测定溶藻率。实验结果表明,3-苄-2,5-二酮哌嗪对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为4.8μg/mL(图3)。此结果表明微小杆菌GLY3109的代谢产物3-苄-2,5-二酮哌嗪是十分有效的控制蓝藻的物质。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一株具有溶藻活性的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号CGMCC No.8980,保藏日期为2014年4月11日,所述微小杆菌GLY-3109能发酵产生3-苄-2,5-二酮哌嗪。
2.如权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109在控制蓝藻水华中的应用。
3.如权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
4.一种溶藻菌剂,其特征在于,所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109。
5.一种溶藻药剂,其特征在于,所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)GLY-3109的发酵产物,所述发酵产物为发酵液或发酵液提取物。
6.一种制备发酵液提取物的方法,包括如下步骤:
1)、发酵权利要求1所述的微小杆菌GLY-3109,获得发酵液;
2)、用萃取剂萃取发酵液,获得萃取液;
3)、将萃取液蒸干,获得粗提物;
4)、将粗提物溶于水后过滤;
5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质,即为发酵液提取物。
7.如权利要求6所述的制备发酵液提取物的方法,其中步骤1)中,发酵条件为,微小杆菌GLY-3109接种于pH 7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中,28℃、220rpm环境条件下发酵48h。
8.如权利要求6所述的制备发酵液提取物的方法,其中步骤2)中,萃取剂为乙酸乙酯,乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。
9.如权利要求6所述的制备发酵液提取物的方法,其中步骤5)中,所述进一步提纯手段为:将滤液通过半制备柱,用HPLC进行初步纯化,得到溶藻成分;将得到的溶藻成分通过分析柱,用HPLC进行进一步纯化,得到单一组分的有效溶藻成分。
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