CN112501090B - 一株地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用。地衣芽孢杆菌，其命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BWFA55，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月8日，保藏编号：GDMCC No:61354。所述地衣芽孢杆菌在杀灭包括水华鱼腥藻、铜绿微囊藻和水华束丝藻中的一种或多种有害藻类中的应用；应用于防治水华和赤潮；应用于水产养殖中治理水体环境。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
近年来，伴随着经济的高速发展和生活品质不断提高，越来越多营养丰富、成分复杂的生产、生活废水汇入河道湖泊。这些富含氮、磷、碳等元素的废水使得水体中的生物量，尤其是蓝藻的爆发式增长，严重破坏了水体的生态环境，甚至威胁到了人类的身体健康。
水华鱼腥藻（Anabaena flosaquae）是蓝藻水华中除微囊藻之外的常见优势种群，具有很强的营养竞争性。同时，水华鱼腥藻还可分泌藻毒素，该种毒素具有极强的神经毒性，将直接或间接地对生物体及人体健康造成严重伤害并引发各种疾病。蓝藻水华在世界范围内频发，对水环境、人类健康及各国经济构成严重威胁。因此寻找行之有效地抑藻方法是现阶段水生生态保护与水体生态修复领域的重要研究内容之一。
近年来，大量研究表明，藻-细菌间的相互作用是导致蓝藻水华的消退的重要原因，因此分离筛选对水体蓝藻水华具有抑制作用的溶藻细菌引起了国内外环保领域专家学者的广泛关注，目前已有越来越多的研究人员在实验室条件下对溶藻菌的筛选、溶藻特性、生理生化方面进行了研究，然而针对将溶藻细菌实际应用到暴发蓝藻水华水体中的研究仍有一定的局限性。
发明内容
本发明目的在于提供一株地衣芽孢杆菌及其应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
本发明一方面提供了一株地衣芽孢杆菌，其命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)BWFA55，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏日期：2020年12月8日，保藏编号：GDMCC No:61354。经验证为革兰氏阳性菌，16SrRNA序列如SEQ ID №.1所示。
本发明第二方面提供了一种菌剂，其活性成分可以是直接使用地衣芽孢杆菌BWFA55的菌体，或者由BWFA55发酵后未经处理的菌液，又或者是BWFA55发酵后的无菌上清液，再或者是BWFA55发酵后的高温灭活处理菌液。
本发明第三方面提供了一种粉剂，其由上述菌剂浓缩、干燥后制成。
上述菌株和/或所述菌剂和/或所述粉剂，在杀灭有害藻类中的应用，包括：水华鱼腥藻、铜绿微囊藻和水华束丝藻中的一种或多种；在防治水华和赤潮中的应用；在水产养殖中治理水体环境中的应用。
所述的地衣芽孢杆菌BWFA55的培养方法，包括以下步骤：
（1）将BWFA55单菌落接种于营养肉汤培养基中于温度约30 ℃、摇床转速10~20 r/min条件下培养约24h，至对数期；
（2）按照体积分数5%的接种量转接至新鲜的营养肉汤培养基中，于温度约30 ℃、摇床转速100~200 r/min条件下培养约24h至对数期。
上述菌株和/或所述菌剂和/或所述粉剂的应用方法是投放至含有有害藻类的水域中，在温度条件约28℃，光周期分别设置（10~12）h全黑暗、（10~12）h全光照的光循环环境下实现有害藻类的降解。
在本发明的一些应用实施方式中，所述全光照的光照强度为2000~3500lux。
在本发明的一些应用实施方式中，所述含有有害藻类的水域中，叶绿素a初始浓度为945.23~3081.13μg/L，pH值为7.0~7.5。
在本发明的一些应用实施方式中，调整所述活性成分的浓度至OD600约为1，按照活性成分与含有有害藻类的水域体积比为1:（5~100）进行接种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
以黄化的有害藻类为溶藻细菌的菌种分离源，通过4~5次液体感染富集，有针对性的从中分离筛选降解有害藻类的菌株。本发明提供的地衣芽孢杆菌通过分泌非蛋白酶类杀藻物质间接溶藻，对有害藻类表现出高效性，使得蓝藻水华得到有效控制成为可能。
附图说明
图1是本发明实施例1、2、3、4的BWFA55溶藻效果曲线图；
图2是本发明实施例5的BWFA55溶藻效果曲线图；
图3是本发明实施例6的BWFA55与铜绿微囊藻、水华束丝藻、水华鱼腥藻共培养七天后，叶绿素a浓度的初始值与终末值对比图；
图4是本发明实施例7的BWFA55发酵时长对水华鱼腥藻的溶藻效果曲线图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
菌株的分离筛选及鉴定：
1、样品采集
无菌条件下收集黄化水华鱼腥藻液的上清液。
2、培养基配制
营养肉汤培养基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉粉3 g/L及NaCl 5 g/L于烧杯中，加入1000 mL蒸馏水，加热搅拌，使之快速溶解，调节pH至7.0~7.2，然后取100 mL培养基于锥形瓶中，用纱布和牛皮纸将锥形瓶封好，放入高压锅中121℃灭菌20 min。固体培养基加入琼脂1.5%。
水华鱼腥藻培养基：称取NaNO3 1.5 g，K2HPO4 0.04 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.036 g，柠檬酸0.006 g，柠檬酸铁铵 0.006 g，EDTA-Na2 0.001 g，NaCO30.02 g及微量溶液1 mL于烧杯中，加入1000 mL蒸馏水搅拌溶解后调pH至7.0，于高压锅中121 ℃灭菌20 min。
微量溶液：称取硼酸2.86 g，MnCl2·4H2O 1.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，Na2MoO4·2H2O 0.39 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g，加入1000 mL蒸馏水，搅拌溶解。
3、分离筛选方法
（1）富集驯化
将收集的黄化水华鱼腥藻上清液，经孔径0.8 μm微孔滤膜过滤，滤液再经孔径0.22 μm的滤膜过滤，截留黄化藻液中的细菌，在无菌条件下将截留细菌的滤膜剪碎后投加到100 mL新鲜的水华鱼腥藻液中，置于28 ℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱静置培养，黄化后按1:5的比例转接至新鲜的藻液中再次进行富集培养，重复4-5次，以富集得到具有稳定溶藻能力的细菌菌群。
（2）筛选、平板分离
将经过4-5次富集驯化的菌藻共培养液，通过梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），分别接种于营养琼脂培养基上，30 ℃培养48 h后，分别挑取不同的单菌落，采用画线法于营养琼脂培养基上再次进行平板分离，置于30 ℃的恒温培养箱中培养48 h，重复3~4次，得到纯化的细菌，通过分别对其溶藻性能进行判定分析，得到1株高效溶藻细菌，将其单菌落于斜面培养基中保存备用。
4、菌株形态及生理生化性能
通过对菌株进行形态观察、染色反应和生理生化测定，并根据科学出版社《常见细菌系统鉴定手册》（2001）对其进行鉴定。结果如下：
菌落形态特征：菌落为菌落粗糙、不规则、不透明、粘着、扩展。
5、菌株的16S rRNA序列同源性分析
通过将菌株的16S rRNA序列与美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank中的已知序列比对，该菌株与序列登录号为ATCC 14580的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）相似度高达99.7%，且在基于距离法构建的系统发育树中两菌株处于同一分支，自展值为99，其中重复数设置为1000，可信度高。
根据16S rRNA序列同源性分析，结合菌株的形态学特征及生理生化特性，初步鉴定本发明所筛选出的溶藻细菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。本发明提供了溶藻细菌BWFA55，建议的分类命名为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。已于2020年12月8日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No:61354。
以下提供本发明利用上述菌株处理水华鱼腥藻、铜绿微囊藻和水华束丝藻的7个实施例：
本发明供试藻种为水华鱼腥藻FACHB-245、铜绿微囊藻FACHB-930和水华束丝藻FACHB-1040均购自中科院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库，以叶绿素a浓度的变化表征藻类的去除效果。
将玻璃纤维滤膜放置在连有真空泵的油滤器上，根据水样叶绿素浓度准确量取定量体积的水样进行抽滤。将过滤后的滤膜放入具塞玻璃离心管中，加入10 mL 95 %乙醇溶液，盖紧塞帽剧烈振荡片刻，置于4 ℃冰箱避光浸泡2 h，浸泡过程中需振荡3次。将离心管在转数为3500 rpm、温度为4 ℃的条件下离心15 min。取离心后的上清液倒入1 cm比色皿中，以95 %乙醇做参比，分别在630 nm、647 nm、664 nm和750 nm波长处测定吸光值。
计算公式如下：
ρChla=[11.85（A664-A750）-1.54（A647-A750）-0.08（A630-A750）]V1/V2L；
溶藻率=（ρ1-ρ2）/ρ1×100%；
抑藻率=（ρ3-ρ2）/ρ3×100%。
式中：
ρChla—叶绿素α的质量浓度，μg/L；
A630—提取液在波长630处的吸光度值；
A647—提取液在波长647处的吸光度值；
A664—提取液在波长664处的吸光度值；
A750—提取液在波长750处的吸光度值；
V1—提取液体积，10 mL；
V2—水样体积，L；
L—比色皿光程，1 cm；
ρ1—样品起始叶绿素a含量，μg/L；
ρ2—样品当天叶绿素a含量，μg/L；
ρ3—对照当天叶绿素a含量，μg/L。
实施例1
本实施例处理的是100 mL新鲜水华鱼腥藻液，叶绿素a浓度959.70±48.23 μg/L，pH值为7.0。具体实施例步骤如下：首先将地衣芽孢杆菌BWFA55于温度30 ℃、摇床转速150r/min条件下培养至对数期（24 h），然后按菌藻比1:100的投菌量，将1 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为961.96±57.43 μg/L，置于28 ℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，168h时叶绿素a浓度为3472.59±116.71 μg/L，CK组叶绿素a浓度为4124.56±179.38 μg/L，抑藻率为15.62±6.48%。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处在于处理的水华鱼腥藻液叶绿素a浓度不同、投菌量菌藻比不同。本实施例处理的是100 mL新鲜水华鱼腥藻液，叶绿素a浓度953.24±49.76 μg/L，pH值为7.0。具体实施例步骤如下：首先将地衣芽孢杆菌BWFA55于温度30 ℃、摇床转速150 r/min条件下培养至对数期（24 h），然后按菌藻比1:20的投菌量，将5 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为961.96±57.43 μg/L，置于28℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，168 h时叶绿素a浓度为197.71±52.73 μg/L，去除率为78.98±6.56 %。
实施例3
本实施例与实施例1、2不同之处在于处理的水华鱼腥藻液叶绿素a浓度不同、投菌量菌藻比不同。本实施例处理的是100 mL新鲜水华鱼腥藻液，叶绿素a浓度955.28±36.00μg/L，pH值为7.0。具体实施例步骤如下：首先将地衣芽孢杆菌BWFA55于温度30 ℃、摇床转速150 r/min条件下培养至对数期（24 h），然后按菌藻比1:10的投菌量，将10 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为961.96±57.43 μg/L，置于28 ℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，72 h时叶绿素a浓度为74.35±21.32 μg/L，去除率为90.72±1.35%。
实施例 4
本实施例与实施例1、2、3不同之处在于处理的水华鱼腥藻液叶绿素a浓度不同、投菌量菌藻比不同。本实施例处理的是100 mL新鲜水华鱼腥藻液，叶绿素a浓度967.34±77.97 μg/L，pH值为7.0。具体实施例步骤如下：首先将地衣芽孢杆菌BWFA55于温度30 ℃、摇床转速150 r/min条件下培养至对数期（24 h），然后按菌藻比1:5的投菌量，将20 mL对数期菌液接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度为961.96±57.43μg/L，置于28 ℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，每隔24 h取样测定叶绿素a浓度。经过上述方法处理的藻液，168 h时叶绿素a浓度为97.33±15.79 μg/L，去除率为89.81±2.46%。
实施例1~4的实验结果如图1所示，施加培养至对数期的BWFA55菌剂后，72h开始能观察到不同投菌量之间的差异。菌藻比分别为1:20、1:10和1:5的实施例2、实施例3和实施例4，其叶绿素a得到抑制，并逐步降低，实施例3和实施例4的溶藻效果无显著差异，说明当BWFA55占据生长优势后，过高的菌剂浓度并不能带来更高的收益。
实施例5
本实施例与上述4个实施例不同之处在于处理的水华鱼腥藻液叶绿素a浓度不同、菌液处理方式不同，固定菌藻比1:10的投菌量，光循环12 h:12 h。本实施例处理的是4份相同的新鲜水华鱼腥藻液，每1份为100 mL。具体实施例步骤如下：首先将地衣芽孢杆菌于温度30 ℃、摇床转速150 r/min条件下培养至对数期（24 h）。然后按照以下4种方式处理对数期菌液：①菌源液（B1）；②将菌液①高速离心（12000 r/min，10 min）取上清液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，得到发酵后的无菌上清液，并经平板验证其无菌（B2）；③收集②中离心后的菌体，经无菌水洗涤3-4次，制备菌体重悬液（B3）；④将菌液①高温（121℃）灭活处理30min，得到高温灭活处理菌液（B4）。再以菌藻比1:10的投菌量取10 mL上述4种不同方式处理过的菌液，将其分别接种到藻液中，以无菌水作空白对照，取样测定初始叶绿素a浓度分别为915.28 ±44.28μg/L、918.42±61.21 μg/L、931.61±61.21 μg/L、938.42±59.33 μg/L，pH值为7.0。置于28 ℃、光强2500 lux、光循环12 h:12 h的光照培养箱中静置培养，7 d后取样测定叶绿素a浓度。经过上述4种方法处理的藻液，7 d后叶绿素a浓度为依次分别56.26±29.59 μg/L、103.60±20.26μg/L、3079.39±220.26μg/L、678.44±43.55 μg/L，而对照组叶绿素a浓度为4372.19±190.54 μg/L。如图2所示，当菌液处理方式为①时，叶绿素a的去除率为93.74±3.54 %；当处理方式为②时，叶绿素a的去除率为88.59±2.97 %；当处理方式为③时，通过与对照组对比可知，地衣芽孢杆菌菌体仅在后期表现出一定的抑藻效果；当处理方式为④时，叶绿素a的去除率为27.31±9.25%。由此可见，该地衣芽孢杆菌通过分泌胞外非蛋白酶类杀藻物质间接溶藻，表现出高效性。
从上面的测试数据可知本发明可以有效抑制和溶解水华鱼腥藻，有良好的应用价值。
实施例6
按实施例4提供的方法，取BWFA55培养至对数期的菌剂按菌藻比1:10的投菌量，分别处理铜绿微囊藻液、水华束丝藻液和水华鱼腥藻。分别取样测定初始叶绿素a浓度为3698.11±145.18μg/L，3571.61±84.77μg/L及3803.62±54.63μg/L。在BWFA55共培养七天后，各组的叶绿素a浓度分别降至1198.19±78.39μg/L、2170.29±37.84μg/L和426.32±32.88μg/L。如图3所示（CK为该实验组初始叶绿素a，BWFA55为终末叶绿素a），各组叶绿素a的去除率分别为67.51±3.40%、39.20±2.50%和88.78±1.02。可见BWFA55对多种高浓度的有害藻类也能起到溶解、杀灭的作用。
实施例7
按实施例4提供的方法，验证BWFA55发酵时长对溶解水华鱼腥藻效果的影响。实验初始叶绿素a浓度为3112.02±139.90μg/L。将地衣芽孢杆菌BWFA55于温度30 ℃、摇床转速150 r/min条件下培养，分别于24 h、72h、120h时取样，然后分别按菌藻比1:10注入藻液中共培养。每24h记录菌藻共培养的叶绿素a，7d后得到如图4所示曲线图，各样品的叶绿素a浓度分别为406.46±16.93μg/L、541.10±20.04μg/L和1817.56±64.81μg/L，溶藻率分别为86.91±1.13%、82.57±1.43%以及41.45±4.72%。证明BWFA55的杀藻物质在发酵时间超过72h后分泌量减少，溶藻效果下降。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 碧沃丰生物科技（广东）股份有限公司;碧沃丰工程有限公司
<120> 一株地衣芽孢杆菌及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1457
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
gtgcaaatgg cggcatacta tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg 60
atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact 120
ccgggaaacc ggggctaata ccggatgctt gattgaaccg catggttcaa ttataaaagg 180
tggcttttag ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac 240
ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg 300
agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag 360
tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaaac tctgttgtta 420
gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac ggtacctaac cagaaagcca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta 540
ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac 600
cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt 720
ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagagggttt ccgcccttta gtgctgcagc 840
aaacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcctct gacaacccta gagatagggc ttccccttcg ggggcagagt 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatggg cagaacaaag ggcagcgaag ccgcgaggct aagccaatcc 1260
cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaacctttt ggagccagcc 1440
gctcgatagt gacctag 1457
Claims (8)
1.一株地衣芽孢杆菌，其特征在于，命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BWFA55，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期：2020年12月8日，保藏编号：GDMCC No:61354。
2.权利要求1所述地衣芽孢杆菌在杀灭有害藻类中的应用，其特征在于，所述有害藻类为水华鱼腥藻、铜绿微囊藻和水华束丝藻中的一种或多种。
3.一种菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述地衣芽孢杆菌的菌体或未处理菌液。
4.一种粉剂，其特征在于，由权利要求3所述菌剂制成。
5.水体净化的方法，其特征在于，将如权利要求1所述地衣芽孢杆菌、如权利要求3所述菌剂或如权利要求4所述粉剂添加至含有有害藻类的水域中，在温度条件28℃，光周期分别设置10~12h全黑暗、10~12h全光照的光循环环境下实现有害藻类的降解。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述全光照的光照强度为2000~3500lux。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述含有有害藻类的水域中，叶绿素a初始浓度为945.23~3803.62μg/L，pH值为7.0~7.5。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，调整权利要求1所述地衣芽孢杆菌的浓度至OD600为1.00±0.01，按照其与含有有害藻类的水域体积比为1:（5~100）进行接种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220719 Address after: 528200 unit 501, 5th floor, building 8, block a, Hantian science and Technology City, No. 17, Shenhai Road, Guicheng, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province Patentee after: Beverly Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd. Patentee after: BIO-FORM ENGINEERING CO.,LTD. Patentee after: Biwofeng ecological environment Co.,Ltd. Address before: 528200 unit 501, 5th floor, building 8, area a, Hantian science and Technology City, 17 Guicheng Shenhai Road, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province (for office use only) Patentee before: Beverly Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd. Patentee before: BIO-FORM ENGINEERING CO.,LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A strain of Bacillus licheniformis and its application Effective date of registration: 20231120 Granted publication date: 20210824 Pledgee: Guangdong Nanhai Rural Commercial Bank branch branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Beverly Biotechnology (Guangdong) Co.,Ltd.|BIO-FORM ENGINEERING CO.,LTD.|Biwofeng ecological environment Co.,Ltd. Registration number: Y2023980066506 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |