CN108130287B - 一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法 - Google Patents

一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种黄杆菌及黄杆菌分泌物的制备方法和应用，涉及微生物技术领域。其中，黄杆菌的保藏编号为M2017262。利用黄杆菌的分泌物具有溶藻活性，可以对赤潮中的藻类起到抑藻和杀藻的作用，为治理赤潮起到良好的作用。

Description

一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种黄杆菌及黄杆菌分泌物的制备方法和应用。
背景技术
赤潮是全球范围内严重的海洋生态环境灾害，已经引起社会各界的广泛关注，由于近年来，沿海污染加剧，导致近海海域发生富营养化，导致赤潮频繁爆发当赤潮藻类大量繁殖时，藻的光合作用消耗了大量的CO2，导致水体的酸碱度发生改变，影响了海洋生物的正常生命活动，同时，由于赤潮生物覆盖在水上层，使阳光很难到达水体深处，降低水体的透明度，导致底层的水草、珊瑚礁及以水草为主食的海洋动物死亡，生物多样性锐减。因此，海域一旦发生富营养化，海洋生态系统的生物种群会发生大变化，生态平衡便被打乱。特别是某些有毒赤潮藻种的爆发，不仅仅会毒害海洋生物，还会对人类健康造成危害，并造成巨大的经济损失。因此，急需研究出一种区别于传统的物理法和化学法的新型而高效的控制赤潮的方法，才能解决当前的赤潮问题。
与传统的物理方法和化学方法相比较，利用生物特别是某些具有杀藻作用的微生物控制赤潮的方法具有高效、安全等优点，得到学术界越来越多的关注和研究。利用海洋中具有杀藻作用的微生物可使海洋生态环境保持动态平衡，并能实现对赤潮的预防和控制的目的。其中溶藻细菌作为一类能够通过直接或间接方式来实现对藻类的灭活或溶解被越来越多的学者所关注，许多研究表明有害藻类的生长和消亡与自然水体中存在的某些溶藻细菌有关。溶藻细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，能有效维持藻华的生物量平衡。
溶藻细菌(Algae-lysing bacteria)是专指那些能通过直接或者间接的方式，使藻类生长受到抑制或者杀灭藻细胞、裂解藻细胞的细菌统称。溶藻细菌的作用方式分两种：一种是通过直接与宿主藻接触或者进入宿主藻细胞体内杀灭藻细胞，另一种是通过分泌某些胞外活性物质或者活性酶等使藻细胞死亡的间接溶藻方式。但目前，溶藻细菌的数量较少，不足以达到治理赤潮的目的。
发明内容
本发明提供一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法，旨在解决溶藻细菌数量少，不足以治理赤潮的问题。
本发明提供一种黄杆菌，所述黄杆菌的保藏编号为M2017262。
本发明提供一种黄杆菌的分泌物，所述分泌物应用于抑藻或杀藻。
本发明提供一种黄杆菌的分泌物的制备方法，该方法包括：
将黄杆菌菌种接种到无菌液体培养基中，在23～26℃，摇床速率为150～200rpm的条件下培养至少48h。
收集黄杆菌的发酵液，离心，收集上清液，过滤菌体，再在121℃的条件下灭菌至少20min，加入无水乙醇，在2～5℃的条件下静止6～10h，离心，收集上清液，蒸干；
将蒸干的物质溶于去离子水中，并置于截留相对分子量为100的透析袋中，搅拌上清液，调节上清液的pH至7。
将上清液缓慢加入到阳离子交换柱，并用柱体积的至少2倍的去离子水进行洗脱，再用柱体积至少2倍的氨水洗脱，收集氨水洗脱相，蒸干，得到分泌物，其中，氨水的质量分数为5～6％。
本发明提供一种黄杆菌、分泌物的应用及制备方法，利用黄杆菌的分泌物具有溶藻活性，可以对赤潮中的藻类起到抑藻和杀藻的作用，为治理赤潮起到良好的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
图1是本发明提供的血红哈卡藻细胞数量直方图；
图2是本发明提供的血红哈卡藻细胞产量直方图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种黄杆菌Arenibacter sp.6A1，已于2017年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称：CCTCC，地址湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为M2017262，命名为6A1。该菌株的该菌落直径2～3mm，菌落黄色，湿润，透明，边缘平整。该菌株的16S rDNA序列为：
GGGCAGCGGGGATAAGCTTGCTTATCTGCCGGCGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTGTACTAGGGAATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATGCCCTATAGTATATCGTTATGGCATCATAATGATATTAAAGGTTACGGTACAAGATGACTATGCGTCCCATTAGTTGGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGACTGCGATGGGTAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGGGAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAACAAGGGGCACGTGTGCCCTTCTGACGGTACCGTAAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCCATTAAGTCAGGGGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCCCTTGATACTGGTGGTCTTGAGTTATAGTGAAGTGGCTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGGTCACTAACTATACACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGGCGCAAGCCTGAGCGGCCAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGTCTGACAG CTTTAGAGATAGAGTTTTCTTCGGACAGATTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGCCGTTAGTTGCCAGCATGT。
本发明提供一种黄杆菌的分泌物，应用于抑藻或杀藻。
本发明提供一种黄杆菌的分泌物的制备方法，该方法包括：
步骤一、将黄杆菌在培养基中进行培养至少24h，对培养基离心，取上清液，过滤，对过滤后的清液在110～120℃的条件下灭菌；
优选地，培养时间为24～72h。灭菌温度为121℃。所述培养基的配方为：5～6g/L蛋白胨，1～1.5g/L酵母提取物，0.1～0.2g/L磷酸高铁及10-12g/L琼脂粉，其中，溶剂为陈海水。培养基的PH值为7.6-7.8。
步骤二、除去灭菌后的清液中的多糖，脱盐，分离，蒸干，得到分泌物。
进一步地，步骤二具体包括：
将黄杆菌菌种接种到无菌液体培养基中，在23～26℃，摇床速率为150～200rpm的条件下培养至少48h。
收集黄杆菌的发酵液，离心，收集上清液，过滤菌体，再在121℃的条件下灭菌至少20min，加入无水乙醇，在2～5℃的条件下静止6～10h，离心，收集上清液，蒸干；
将蒸干的物质溶于去离子水中，并置于截留相对分子量为100的透析袋中，搅拌上清液，调节上清液的pH至7。
将上清液缓慢加入到阳离子交换柱，并用柱体积的至少2倍的去离子水进行洗脱，再用柱体积至少2倍的氨水洗脱，收集氨水洗脱相，蒸干，得到分泌物。
具体地，氨水的质量分数为5～6％。
实施例
1、黄杆菌的分离
1)利用培养基对血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)在22℃，光照强度为3000Lx条件下连续光照，培养30天，得到的藻细胞浓度为2×104cells/mL的藻液。
其中，培养基的组分为5mg的NaH2PO4.H2O，75mg的NaNO3，0.22mg的ZnSO4.7H2O，0.01mg的CoCl2.6H2O，0.18mg的MnCl2.4H2O，0.006mg的NaMoO4.2H2O，4.36mg的Na2EDTA.2H2O，3.15mg的FeCl2.6H2O，0.01mg的CuSO4.5H2O，0.1mg的维生素B1，0.5ug的维生素B12，0.1ug的Biotin(H)溶于陈海水中定容为1L。血红哈卡藻由暨南大学海洋藻种室提供。
2)利用高温灭菌的蓝盖玻璃瓶从赤潮爆发的深圳东山海域采集水样，并在2h内转移到4℃的冰箱中保存。使用孔径为0.22um水系醋酸纤维的滤膜过滤，将滤液中的细菌收集至滤膜上，并放入100mL步骤1)培养的藻液中，按步骤1)的条件培养一周。
其中，2216E培养基的配方为：5g蛋白胨(Peptone)，1g酵母提取物(YeastExtract)，0.1g磷酸高铁，10-12g琼脂粉(固体培养基)，用1M盐酸调PH 7.6-7.8，陈海水定容到1L。滤膜为天津津腾。
3)将培养后的2216E培养基和藻液分别进行梯度稀释为：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9倍，涂布于2216E平板上，并在25℃的条件下培养24h，经三次划线分离，得到溶藻菌的菌株。将该菌株在2216E培养基中培养，甘油保种后置于-80℃的条件下保存。
2、黄杆菌的鉴定
提取溶藻弧菌的基因组DNA，进行测序，得到黄杆菌的16S rDNA序列：
GGGCAGCGGGGATAAGCTTGCTTATCTGCCGGCGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTGCCTTGTACTAGGGAATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAATGCCCTATAGTATATCGTTATGGCATCATAATGATATTAAAGGTTACGGTACAAGATGACTATGCGTCCCATTAGTTGGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGACTGCGATGGGTAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGGCGGGAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTATACGGGAAGAACAAGGGGCACGTGTGCCCTTCTGACGGTACCGTAAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCCATTAAGTCAGGGGTGAAAGTTTGCGGCTCAACCGTAAAATTGCCCTTGATACTGGTGGTCTTGAGTTATAGTGAAGTGGCTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGGTCACTAACTATACACTGACGCTGATGGACGAAAGCGT GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGGCGCAAGCCTGAGCGGCCAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGTCTGACAGCTTTAGAGATAGAGTTTTCTTCGGACAGATTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGCCGTTAGTTGCCAGCATGT。
由上述16S rDNA序列可知，该菌属名为Flavobacterium(黄杆菌)，种名为Arenibacter sp.。其中，16S rDNA序列已提交GeneBank,序列编号MG396982。黄杆菌菌落具有如下形态特征，菌落直径2～3mm，菌落黄色，湿润，透明，边缘平整。
3、黄杆菌的分泌物的制备方法
1)扩大培养
将黄杆菌菌种按照体积比0.1％接种到100mL的无菌液体培养基2216E中，在25℃，摇床速率为180rpm的条件下培养48h。
2)预处理
收集黄杆菌的发酵液，利用高速离心机将菌液以10000×g离心2min，收集上清液，并用孔径为0.22um的水系醋酸纤维滤膜过滤菌体，再用高温高压灭菌锅在121℃的条件下灭菌20min。
3)除去上清液的多糖
将2)中灭菌后的发酵液与无水乙醇(预先在-20℃放置5h)以1:3迅速剧烈混匀，在4℃的条件下静止8h，利用高速离心机将菌液以10000×g离心2min，收集上清液，并通过旋转蒸发仪将无水乙醇和水蒸干。
4)脱盐处理
将3)中蒸干的物质(3.05g)重新溶解在100mL去离子水中，将溶液置于截留相对分子量为100的透析袋中，并放置于盛放4L去离子水的玻璃烧杯中进行搅拌，每1h换一次去离子水，连续更换7次，收集透析袋中的上清液，调节上清液的pH至7。
5)阳离子交换树脂分离
将处理后的上清液缓慢加入到阳离子交换柱(预先对阳离子交换柱内的阳离子交换树脂(Amberlite GC-50-type 1)用清水清洗，再用酸液和碱液浸泡，淋洗，最后用清水冲洗至中性后用5.6％的氨水浸泡树脂)，利用柱体积的3倍去离子水进行洗脱一次，再用柱体积3倍的的5.6％氨水洗脱一次，收集氨水洗脱相，并将收集到的液体蒸干，得到分泌物。
4、溶藻活性测试
1)通过浮游生物框对血红哈卡藻液进行计数，将藻液分成两份，将上述得到的分泌物(6A1)加入到其中一份藻液中，另外一份不加任何物质(空白实验)，每隔1小时，分别检测藻液的浓度以及利用Water-Pam水体荧光仪测量藻液光合系统，得到如图1和图2所述的直方图。可以看出，随着时间的延长，黄杆菌的分泌物对血红哈卡藻液起到了抑制作用。且随着作用时间的延长细胞产量越来越低，说明对血红哈卡藻液的抑制作用越来越强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株Arenibacter sp.6A1菌株，其特征在于，所述菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年5月15日，保藏编号为CCTCC NO：M2017262，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，所述菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示，在GenBank上的序列编号为MG396982，所述菌株为黄杆菌科Arenibacter属。
2.一种如权利要求1所述的菌株的分泌物，其特征在于，所述分泌物能用于抑藻或杀藻；
所述分泌物的制备方法包括：
将6A1菌株在培养基中进行培养至少24h，对培养基离心，取上清液，过滤，对过滤后的上清液在110～120℃的条件下灭菌；
除去灭菌后的上清液中的多糖，脱盐，分离，蒸干，得到分泌物；
所述分泌物的制备方法还包括：
将6A1菌株菌种接种到无菌液体培养基中，在23～26℃，摇床速率为150～200rpm的条件下培养至少48h；
收集6A1菌株的发酵液，离心，收集上清液，过滤菌体，再在121℃的条件下灭菌至少20min，加入无水乙醇，在2～5℃的条件下静置6～10h，离心，收集上清液，蒸干；
将蒸干的物质溶于去离子水中，并置于截留相对分子量为100的透析袋中，搅拌上清液，调节上清液的pH至7；
将上清液缓慢加入到阳离子交换柱，并用柱体积的至少2倍的去离子水进行洗脱，再用柱体积至少2倍的氨水洗脱，收集氨水洗脱相，蒸干，得到分泌物，其中，氨水的质量分数为5～6％。
3.根据权利要求2所述的分泌物，其特征在于，所述培养基的配方为：5～6g/L蛋白胨，1～1.5g/L酵母提取物，0.1～0.2g/L磷酸高铁及10－12g/L琼脂粉，其中，溶剂为陈海水。
4.根据权利要求3所述的分泌物，其特征在于，所述培养基的pH值为7.6－7.8。
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