CN116396902A - 一株具有溶藻能力的杀鱼假交替单胞菌及其对赤潮异弯藻赤潮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其对赤潮异弯藻赤潮的应用，用于控制赤潮异弯藻赤潮。假交替单胞菌LD‑B001菌液及上清物质有很好的溶藻活性，产生的溶藻有效成分具有较好的热稳定性和pH稳定性。假交替单胞菌LD‑B001来源于赤潮异弯藻赤潮环境中又应用于赤潮异弯藻赤潮环境，具有与该环境的良好兼容性，不会造成残留污染。假交替单胞菌LD‑B001的发酵液和有效溶藻成分以及以它们为核心的制剂，均有望可以用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于赤潮异弯藻赤潮的控制。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有溶藻能力的杀鱼假交替单胞菌及其对赤潮异弯藻赤潮的应用。
背景技术
近年来，随着水体富营养化、全球气候变暖等现象加剧，有害赤潮的暴发的规模和频次呈逐年增加趋势，这类生态异常现象，不经破坏海洋生态系统平衡，还对养殖业和旅游业造成较大的经济损失。赤潮异弯藻是形成有害藻华的主要物种之一，在世界多个海域均有该物种的分布，该物种之所以引起高度关注，主要因为其藻华发生时会造成鲑鱼、黄尾鱼等养殖鱼类大面积死亡。因此，开展赤潮异弯藻的藻华防控相关工作尤为重要。
目前，有害藻华防治，主要从物理、化学、生物等方面展开，相比于目前赤潮治理常用的化学法和物理法，生物法因其具有经济有效且不会对环境造成污染的优点吸引了越来越多人的关注。生物防治技术主要通过生物之间的营养竞争关系来实现控藻，利用在海洋微藻环境中与其共同生长的生物对赤潮藻的生长进行控制，这些生物主要包括一些水生植物、水生动物和海洋微生物等。其中，溶藻菌被认为是目前最具潜力的溶藻方法，它可以通过直接或间接作用使藻类的生长受到抑制，甚至使藻细胞裂解，表现出杀藻效应，溶藻菌的提出为生物防治方法提供了新的思路，由于其原理是利用水生生物自身竞争优势、捕食规则或其分泌的天然产物对赤潮藻进行有效的控制，没有向环境中引入其他化学物质，环境友好且控藻效率较高，具有一定的应用前景。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)LD-B001，该菌株已于2021年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.23584，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，联系电话：010-64807355。
本发明所提供的杀鱼假交替单胞菌LD-B001在防治藻类中的应用，其中所述的藻类选自甲藻类，优选为伊姆裸甲藻或赤潮异弯藻。
本发明提供一种包含杀鱼假交替单胞菌LD-B001的溶藻菌剂，所述溶藻菌剂包含杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液和/或胞外分泌物。
优选的，所述杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液OD600为1-2.2。
优选地，所述胞外分泌物的制备方法为：将LD-B001菌株接种于2216E液体培养基中培养24小时，菌液经过4000rpm离心10min后再用0.22μm孔径的膜过滤得到无菌培养液。
本发明还提供了所述杀鱼假交替单胞菌LD-B001的培养方法，包括以下步骤：
1)斜面培养：将杀鱼假交替单胞菌LD-B001的菌种接种于2216E固体斜面培养基上培养；
2)初级培养：用接种环挑取固体斜面培养基上的杀鱼假交替单胞菌LD-B001单菌落于2216E液体培养基中，获得初级培养菌液；
3)菌液：将初级培养菌液接种于2216E液体培养基中进一步扩大培养。培养0-12h获得对数期菌液，培养12-52h获得稳定期菌液、培养52-72h获得衰退期菌液。
优选地，所述步骤1)斜面培养条件为：在28℃条件下培养24小时，于4℃下保存。
优选地，所述2216E固体培养基为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L、琼脂20g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min。
优选地，所述步骤2)初级培养条件为：28℃下，摇床180rpm培养，培养至对数期。
优选地，所述2216E液体培养基为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min。
优选地，所述步骤3)的培养条件为：以10％的接种量将初级培养菌液接种于2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm。
本发明的有益效果：
(1)杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液及上清物质有很好的溶藻活性。
(2)杀鱼假交替单胞菌LD-B001产生的溶藻有效成分具有较好的pH稳定性。
(3)杀鱼假交替单胞菌LD-B001来源于赤潮异弯藻赤潮环境中又应用于赤潮异弯藻赤潮环境，具有与该环境的良好兼容性，不会造成残留污染。
附图说明
图1.显微镜下赤潮异弯藻的细胞形态，A：LD-B001处理前，B：LD-B001处理后
图2.不同浓度的菌液在48h内对赤潮异弯藻的溶藻效果
图3.LD-B001溶藻部位的研究
图4.LD-B001对代表性微藻的溶藻效果
图5.LD-B001的溶藻物质的酸耐受性
图6.LD-B001对养殖池塘中赤潮异弯藻的溶藻效果
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明包括以下步骤：
1、溶藻菌菌株的筛选
从连云港连岛赤潮异弯藻赤潮发生海域采集水样，取水样稀释后涂布2216E固体培养基，28℃培养48h，挑选不同菌落形态的菌株于2216E液体培养基，28℃，200r/min，富集培养后将菌液添加处于对数期的赤潮异弯藻藻液中(体积比1：100)在24孔板中进行混合培养。通过显微观察法和藻细胞计数法，判断是否具有溶藻作用，将具有溶藻活性的菌液在2216E固培养基上三区划线，分离纯化后得到单菌落，比较所筛选到的菌株的培养液的溶藻活性，选出其中活性最强的菌株，命名为LD-B001，并进一步研究。
用倒置显微镜观察藻细胞形态变化及其存活情况，并通过藻细胞计数计算溶藻率。溶藻率计算公式：溶藻率(％)＝(Nc-Nt)/Nc×100％，其中Nc和Nt分别代表对照组和实验组藻细胞浓度。藻细胞计数均采用赛吉计数(Sedgewick-Rafter)法在显微镜下测定藻细胞浓度。藻细胞浓度(cells/mL)＝N×稀释倍数×50，其中N为显微镜下观察藻细胞数的三次平均值。
2216E固体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L、琼脂20g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min；
2216E液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min。
2、菌种鉴定及命名
用DNA提取试剂盒提取菌株的基因组，选用扩增原核微生物16S rDNA序列的通用引物进行扩增，再转录成16srRNA基因序列。
通过16srRNA基因序列分析对菌株LD-B001进行鉴定，经16S rRNA基因序列分析和同源性比较，确定该菌株为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)。该菌株已于2021年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.23584，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，联系电话：010-64807355。。
该菌种的16S rRNA基因在GenBank中的登录号是OL305667。
3、杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)LD-B001的培养：
1)斜面培养：将杀鱼假交替单胞菌LD-B001的菌种接种于2216E固体斜面培养基上，在28℃条件下培养24小时，于4℃下保存；
2)初级培养：用接种环挑取固体斜面培养基上的杀鱼假交替单胞菌LD-B001单菌落于10mL 2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm培养，培养至对数期(OD600：0.6-0.7)获得初级培养菌液；
3)菌液：将1mL初级培养菌液接种于100mL 2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm进一步扩大培养。培养0-12h获得对数期(OD600：0-1.69)菌液，培养12-52h获得稳定期(OD600：1.69-2.22)菌液、培养52-72h获得衰退期(OD600：2.22-1.82)菌液。
4、LD-B001溶藻活性及溶藻方式研究
取培养48h得到的杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液(OD600：2.20)，向赤潮异弯藻藻液中加入藻液体积的0.5％、1％、2％和5％的LD-B001的菌液，分别在共培养0h、6h、24h和48h后取样，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率，每组实验设置3个生物学重复。如图2所示，不同浓度的菌液在48h内对赤潮异弯藻均有溶藻效果(0.5％，1％、2％和5％)，其中0.5％浓度的杀藻率为70.9％，1％浓度的溶藻率可达100％左右，随着菌液添加量的增加，溶藻率增加。
比较LD-B001无菌滤液、菌体细胞和菌液的溶藻活性，研究确定该菌株的溶藻方式。
按照2％的体积比将杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液和赤潮异弯藻藻液共培养；
将LD-B001菌株接种于2216E液体培养基中培养24小时，菌液经过4000rpm离心10min后再用0.22μm孔径的膜过滤得到无菌培养液；按照2％的体积比将无菌培养液添加至赤潮异弯藻藻液中共培养；
将离心获得的菌细胞经灭菌后的天然海水冲洗两次得到菌体细胞。再次加入无菌海水制备菌悬液，按照2％的体积比将菌悬液(1.92×108cfu/mL)添加至赤潮异弯藻藻液中共培养；
如图3所示，杀鱼假交替单胞菌LD-B001通过细胞分泌物溶藻。
通过对代表性伊姆裸甲藻、赤潮异弯藻和中肋骨条藻进行溶藻实验，初步确定菌株LD-B001的溶藻是否特异。如图4所示，杀鱼假交替单胞菌LD-B001对代表性微藻的溶藻效果存在差异，对甲藻(伊姆裸甲藻)具有较强的溶藻效果，对硅藻(中肋骨条藻)无明显溶藻效果
通过改变杀鱼假交替单胞菌LD-B001产生的较强溶藻作用的溶藻物质的pH测试其溶藻作用。如图5所示，杀鱼假交替单胞菌LD-B001产生的溶藻物质有较好的酸耐受性。
所用藻种伊姆裸甲藻、赤潮异弯藻、采用f/2-Si培养基培养，中肋骨条藻采用f/2培养基培养。培养温度20℃，光照强度100±10μEm-2s-1，光暗周期为14：10h，此时以上所有藻种的细胞密度均为8000cells/mL。在正式开展溶藻实验之前，所有藻种都利用终浓度为200mg/L的氨苄、100mg/L的卡那霉素和100mg/L的链霉素进行预处理，以降低培养体系中细菌污染对实验结果的影响。
f/2培养基配方：75mg/LNaNO3、5mg/LNaH2PO4·H2O、20mg/LNa2SiO3·9H2O、4.36mg/LNa2EDTA、3.16mg/LFeCl3·6H2O、0.01mg/LCuSO4·5H2O、0.023mg/LZnSO4·7H2O、0.012mg/LCoCl2·6H2O、0.18mg/LMnCl2·4H2O、0.07mg/LNa2MoO4·2H2O、0.1μg/L维生素B1、0.5μg/L维生素B12、0.5μg/L生物素。以上成分溶解于无菌天然海水，在121℃下高温蒸汽灭菌20分钟。f/2-Si培养基配方：无20mg/LNa2SiO3·9H2O成分，其他与f/2培养基一致。
5、LD-B001在养殖塘赤潮异弯藻赤潮控制中的应用
通过研究LD-B001对养殖塘中赤潮异弯藻赤潮发生时的水样进行溶藻活性实验，分析溶藻效果。如图6所示，杀鱼假交替单胞菌LD-B001针对养殖池塘中赤潮异弯藻的溶藻效果明显。
基于上述特点，杀鱼假交替单胞菌LD-B001的发酵液和有效溶藻成分以及以它们为核心的制剂，均有望可以用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于赤潮异弯藻赤潮的控制。
Claims (10)
1.一种杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonaspiscicida)LD-B001，该菌株已于2021年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.23584，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的杀鱼假交替单胞菌LD-B001在防治藻类中的应用，其中所述的藻类选自甲藻类，优选为伊姆裸甲藻或赤潮异弯藻。
3.一种包含权利要求1所述的杀鱼假交替单胞菌LD-B001的溶藻菌剂，所述溶藻菌剂包含杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液和/或胞外分泌物。
4.根据权利要求3所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述杀鱼假交替单胞菌LD-B001菌液OD600为1-2.2。
5.根据权利要求3所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述胞外分泌物的制备方法为：将LD-B001菌株接种于2216E液体培养基中培养24小时，菌液经过4000rpm离心10min后再用0.22μm孔径的膜过滤得到无菌培养液。
6.根据权利要求1所述杀鱼假交替单胞菌LD-B001的培养方法，包括以下步骤：
1)斜面培养：将杀鱼假交替单胞菌LD-B001的菌种接种于2216E固体斜面培养基上培养；
2)初级培养：用接种环挑取固体斜面培养基上的杀鱼假交替单胞菌LD-B001单菌落于2216E液体培养基中，获得初级培养菌液；
3)菌液：将初级培养菌液接种于2216E液体培养基中进一步扩大培养；培养0-12h获得对数期菌液，培养12-52h获得稳定期菌液、培养52-72h获得衰退期菌液。
7.根据权利要求6所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述步骤1)斜面培养条件为：在28℃条件下培养24小时，于4℃下保存。
8.根据权利要求6所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述步骤2)初级培养条件为：28℃下，摇床180rpm培养，培养至对数期。
9.根据权利要求6所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述步骤3)的培养条件为：以10％的接种量将初级培养菌液接种于2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm。
10.根据权利要求6所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述2216E固体培养基为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L、琼脂20g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min；优选地，所述2216E液体培养基为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L，于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min。
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