CN117467583B - 一株喹诺酮类抗生素降解菌、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一株喹诺酮类抗生素降解菌、菌剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株喹诺酮类抗生素降解菌、菌剂及其制备方法和应用。所述喹诺酮类抗生素降解菌分类命名为无色杆菌(Achromobacter sp.)，菌株名为JK7。本发明将所述降解菌制成菌悬液或菌剂，能够有效去除废水中的左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星等喹诺酮类抗生素污染，与物理吸附、化学降解等方法相比，本发明具有成本低、操作简易、对环境无损害、无二次污染等优点，是一种极具潜力的喹诺酮类抗生素去除方式。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种废水中喹诺酮类抗生素降解菌及其应用。
背景技术
喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的抗生素，因其抗菌谱广、杀菌力强、与其他抗菌药物不易出现交叉耐药性、价格低廉等特点，被广泛用于人类和畜牧、水产等养殖业领域中。然而喹诺酮类抗生素的大量使用，也引发了许多问题。现如今，喹诺酮类抗生素主要通过制药企业废水、医疗行业废弃物、畜牧业粪便及水产养殖用水等排放入自然环境，且由于喹诺酮类抗生素化学性质稳定，在水中较难降解，故其在环境中保留持久，并不断积累，这使得其在环境中的残留量不断增加。该类药物具有较强的生态毒性，其在环境中的富集会影响植物的生长和土壤的肥力。水体环境中富集的喹诺酮类抗生素可进入水生动物体内，进而引入食物链，最终影响人体。
与光降解、化学氧化降解、电离辐射降解等物理和化学方法降解去除喹诺酮类抗生素残留相比，微生物降解法存在显著优势：成本低、操作简易、对环境无损害、无二次污染等，使得微生物降解法成为一种极具潜力的喹诺酮类抗生素去除方式。近年来，有许多专家学者对该领域进行了研究，喹诺酮类抗生素的微生物降解逐渐成为关注点。目前对于喹诺酮类抗生素的微生物降解菌主要集中在环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和恩诺沙星，还未见对于左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星降解菌的报道。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种喹诺酮类抗生素降解菌，并进一步提出了基于该降解菌制备得到的菌剂。该菌株能有效去除废水中的喹诺酮类抗生素，选择性高，并且对盐度有较好的适应性。
具体地，本发明公开了一株喹诺酮类抗生素降解菌，所述喹诺酮类抗生素降解菌分类命名为无色杆菌(Achromobacter sp.)，菌株名为JK7，于2022年11月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，菌种保藏号为：CGMCC No.26069。
本发明进一步提出了一种喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂，其包含上述喹诺酮类抗生素降解菌。
本发明还提供了上述喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将所述喹诺酮类抗生素降解菌接种至LB固体培养基中进行活化培养；
（2）将活化后的菌株接种于LB液体培养基摇瓶中，于28～35℃、150～180r/min的恒温振荡器培养至对数期；然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，将收集的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中，作为种子液，种子液的密度为1~2×10^8cfu/mL；
（3）将种子液按照体积比5%～10%的接种量接种入发酵罐培养，发酵完成后将培养液在5000～6000r/min的转速下离心3～5min，弃去上清液，得到的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤1～3次，配制成OD600为0.5～1.5的菌悬液，即为喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂。
其中，所述步骤（1）、（2）中，LB液体培养基组分为：酵母提取粉4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 4~6g/L；LB液体培养基中加入体积比为1.5~2%的琼脂即为固体培养基，培养基均置于高压蒸汽灭菌锅（121℃）中灭菌30min后再使用。
步骤（3）中发酵罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母提取粉4~6g/L，K2HPO40.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO31.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。
本发明进一步提出了上述喹诺酮类抗生素降解菌或所述菌剂在降解废水中喹诺酮类抗生素的应用。
其中，所述喹诺酮类抗生素为左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星中的任意一种或多种。
所述喹诺酮类抗生素降解菌或所述菌剂的适宜处理条件为：废水中喹诺酮类抗生素的含量为100~500mg/L，所述废水的盐浓度为0g/L~60g/L，在该条件下处理效果较好。
本发明提出了一种喹诺酮类抗生素废水处理方法，包括如下步骤：
（1）在废水收集池收集废水，调节废水pH为6.8~7.0，并向废水中补充甲醇、氯化铵和磷酸二氢钾，调节废水中的COD、N和P的含量，使废水中COD：N：P的质量浓度比为200~300:5:1，混合均匀后引入SBR反应器中；
（2）向反应器中投加活性污泥，同时投加所述的菌剂，控制反应器中的溶解氧在3~4mg/L，pH为7.0~7.5，温度为25~35°C，进行生物强化降解，活性污泥和菌剂的投加量分别为SBR反应器有效体积的10~15%。
每个周期排水阶段测定出水水样中左氧氟沙星和COD浓度，来判断生化系统对废水中左氧氟沙星和COD的去除效果。
本发明还提供了用于实现上述降解过程的一种降解喹诺酮类抗生素废水的生物强化处理设备，所述生物强化处理装备包括SBR反应器，所述SBR反应器设置有搅拌器、曝气装置、菌剂投加单元和PLC自控系统，其中所述菌剂投加单元中设置有所述的菌剂；所述PLC自控系统用于检测系统温度和pH。
有益效果：本发明首次确定了具有降解典型喹诺酮类抗生素的无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7，所述无色杆菌在LB固体培养基上的菌落较小且平滑，呈透明、白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快；通过革兰氏染色，镜检观察，发现该菌株为革兰氏阴性菌。本发明提供的无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7具有较强的降解典型喹诺酮类抗生素的能力，尤其是降解左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星的能力，在浓度为100~500mg/L条件下，48h降解率可达95％以上，适用于环境中治理典型喹诺酮类抗生素的污染，能够达到环境修复的目的。
附图说明
图1是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7的菌落形态图；
图2是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7的系统发育树；
图3是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7对喹诺酮类抗生素的降解情况；
图4是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7对不同浓度的喹诺酮类抗生素的降解情况；
图5是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7在不同盐度下对喹诺酮类抗生素的降解情况；
图6是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7对不同喹诺酮类抗生素的降解情况；
图7是无色杆菌(Achromobacter sp.)JK7在SBR反应器中对喹诺酮类抗生素生物强化处理中的应用效果；
图8是本发明中SBR反应器示意图。
本发明公开的喹诺酮类抗生素降解菌分类命名为无色杆菌(Achromobacter sp.)，菌株名为JK7，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，菌种保藏号为：CGMCC No.26069。
实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
实施例1 降解菌株的分离、筛选与鉴定。
本发明的高效降解喹诺酮类抗生素的降解菌JK1分离自某化工园区污水处理厂的活性污泥。具体的菌株培养方法为：取污水处理厂生化池的活性污泥加入到含有100mg/L的左氧氟沙星的无机盐培养基中，30℃、160r/min条件下恒温振荡培养；5天后，以5%（V/V）的接种量转接到新鲜同一无机盐培养基中，连续富集转接培养4次，获得富集液。取1mL富集液用无菌水稀释至不同浓度梯度（10-2~10-6），取不同浓度梯度的稀释液0.2mL，涂布在R2A琼脂培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养，待长出菌落后，挑取单菌落进行划线分离纯化。将纯化出的菌株转接至LB固体培养基上4℃保存。
经分离纯化获得一株能高效降解喹诺酮类抗生素的菌株，命名为JK7。菌株JK7在LB固体培养基上的菌落较小且平滑，呈透明、白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快（图1）；通过革兰氏染色，镜检观察，发现该菌株为革兰氏阴性菌。
将菌株JK7的16S rRNA基因序列在GenBank数据库的NCBI核酸数据进行比对分析，进一步构建菌株JK7的系统发育树（图2），确定菌株为无色杆菌(Achromobacter sp.)，菌株名为JK7，于2022年11月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，菌种保藏号为：CGMCC No.26069。
无机盐培养基成分：NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 7.0，培养基121℃灭菌30min。
R2A培养基成分：葡萄糖0.5g/L、可溶性淀粉0.5g/L、酪蛋白0.5g/L、酵母提取粉0.5g/L、胰蛋白胨0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L、KH2PO40.3g/L、丙酮酸钠0.3g/L，pH 7.2，培养基中加入2%的琼脂，培养基121℃灭菌30min。
LB固体培养基组分为：酵母提取粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，加入1.5%的琼脂，pH 7.0，培养基121℃灭菌30min。
实施例2 菌株JK7对喹诺酮类抗生素的降解。
挑取实施例1中获得的降解菌株JK7单菌落接种于100mL LB液体培养基中，于30℃、160rpm条件下培养至OD600=1.0，所得菌液于4℃、8000g离心5min，收集菌体，用无菌水洗涤三次后，等体积重悬于无菌水中作为种子液。
将所得种子液以5%接种量接种至以左氧氟沙星为唯一碳源的无机盐培养基中，无机盐培养基中：左氧氟沙星的初始浓度为100mg/L、NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L，pH 7.0，在30℃、160r/min摇床中培养，每隔6h取样，测定OD600值及培养液中左氧氟沙星浓度，结果如图3所示。
由图3可知，菌株JK7能以左氧氟沙星作为唯一碳源生长，48h时对左氧氟沙星的降解率可达98.8％。
实施例3 菌株JK7对不同浓度喹诺酮类抗生素的降解。
配置无机盐液体培养基，使培养基中左氧氟沙星浓度分别100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L，取实施例2中菌株JK7的种子液，以5%的接种量接到含不同浓度左氧氟沙星的无机盐培养基中，在30℃、160r/min摇床中培养，48h后测定左氧氟沙星含量，结果如图4所示。
由图4可知，菌株JK7对浓度为100~500g/L左氧氟沙星的降解率均在95%以上，表明该菌株可有效降解废水中的左氧氟沙星。
实施例4 盐浓度对菌株JK7降解效果的影响。
调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L和60g/L，取实施例2中菌株JK7的种子液，以5%的接种量接到左氧氟沙星浓度为100g/L的无机盐培养基中，在30℃、160r/min摇床中培养48h后测定左氧氟沙星含量，结果如图5所示。
由图5可知，盐浓度在0~60g/L范围内菌株JK7对左氧氟沙星的降解率在90%以上；以上结果表明该菌株对废水盐浓度具有高耐受性。
实施例5 菌株JK7对不同喹诺酮类抗生素的降解。
取实施例2中菌株JK7的种子液，以5%的接种量接到含不同喹诺酮类抗生素（莫西沙星和依诺沙星）的无机盐培养基中，培养基中污染物的初始浓度分别为100mg/L、300mg/L、500mg/L，在30℃、160r/min摇床中培养48h后测定喹各诺酮类抗生素含量，结果如图6所示。
由图6可知，菌株JK7对浓度为100~500g/L莫西沙星和依诺沙星的降解率均在90%以上，表明该菌株可有效降解废水中的莫西沙星和依诺沙星。
实施例6 降解菌剂的制备。
将实施例1中获得的降解菌株JK7单菌落转接至LB固体培养基上于30℃条件下进行活化培养，将活化后的菌株JK7单菌落接种于LB液体培养基摇瓶中，于30℃、160～180r/min的恒温摇床中培养至对数期，然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，将收集的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中，作为种子液；将种子液按照体积比10%的接种量接种入发酵罐培养，发酵罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母提取粉5g/L，K2HPO41.0g/L，NaCl 5g/L，CaCO32g/L，MgSO40.2g/L，pH值7.2。然后通入无菌空气，无菌空气的通气量为0.45m3/min，于35℃、200r/min条件下发酵培养96h。发酵完成后培养液在6000r/min的转速下离心5min后，弃去上清液，菌体用磷酸盐缓冲液洗涤3次，配制成OD600为1.0的菌悬液即为微生物降解菌剂。
实施例7菌剂在SBR反应器中对降解喹诺酮类抗生素的应用。
为验证筛选出的高效降解喹诺酮类抗生素的降解菌JK1的实际应用效果，建立了2套SBR 反应器，其中一套作为空白对照组R1（对照组R1），另一套设计为主试验对象R2（试验组R2），如图8所示，每套反应器均设置有进水口、搅拌器、曝气装置、反应器、沉淀区、排水口和PLC自控系统，PLC自控系统用于检测系统温度和pH，控制温度为25~35℃，pH为7.0~7.5，R2反应器还设有菌剂投加单元，用于投加实施例6所得的菌剂。
下面以左氧氟沙星废水实际为例，采用上述的SBR反应器对左氧氟沙星进行处理。测得废水中左氧氟沙星浓度为420mg/L，COD为2300mg/L，活性污泥取自江苏某化工企业污水处理厂曝气池。处理方法如下：
（1）在废水收集池收集废水，通过盐酸或氢氧化钠调节pH为7.0左右，并向废水中补充甲醇、氯化铵和磷酸二氢钾，调节废水中的COD、N和P的含量，使废水中COD：N：P的浓度比为250:5:1，混合均匀后分别引入两个SBR反应器中；
（2）反应器R1中只接种活性污泥（30%体积比），反应器R2中同时接种活性污泥（20%体积比）和菌剂（10%体积比）。控制两个反应器水力停留时间均为8h，包括反硝化阶段1h、硝化阶段5h、沉淀阶段1.5h、排水阶段0.5h，进行生物强化降解；
（3）每个周期排水阶段测定出水水样中左氧氟沙星和COD浓度，来判断生化系统对废水中左氧氟沙星和COD的去除效果。
由图7可以看出，在本发明生物强化SBR反应器运行15天内，反应器最终出水的左氧氟沙星的浓度在20mg/L以下，降解率稳定在95%以上，COD降解率稳定在85%以上。明显优于对照组处理效果（左氧氟沙星降解率为30%左右，COD降解率为40%左右）。降解菌剂JK7对左氧氟沙星的降解稳定，能够维持SBR系统稳定高效的运行，在处理喹诺酮类抗生素的工业废水中具有很好的开发应用价值。
本发明提供了一种处理喹诺酮类抗生素废水的处理思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (9)
1.一株喹诺酮类抗生素降解菌，其特征在于，所述喹诺酮类抗生素降解菌分类命名为无色杆菌(Achromobacter sp.)，菌株名为JK7，于2022年11月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26069。
2.一种喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的喹诺酮类抗生素降解菌。
3.权利要求2所述的喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述的喹诺酮类抗生素降解菌接种至LB固体培养基中进行活化培养；
（2）将活化后的菌株接种于LB液体培养基摇瓶中，于28～35℃、150～180r/min的恒温振荡器培养至对数期；然后离心收集菌体细胞，菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，将收集的细菌细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中作为种子液，种子液的密度为1~2×10^8cfu/mL；
（3）将种子液按照体积比5%～10%的接种量接种入发酵罐培养，发酵完成后将培养液离心，弃去上清液，得到的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤1～3次，配制成OD600为0.5～1.5的菌悬液，即为喹诺酮类抗生素降解菌生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）中，LB液体培养基组分为：酵母提取粉4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 4~6g/L；LB液体培养基中加入体积比为1.5~2%的琼脂即为固体培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中发酵罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母提取粉4~6g/L，K2HPO4 0.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO3 1.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，pH值7.2~7.5；发酵培养条件为：无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h。
6.权利要求1所述的喹诺酮类抗生素降解菌或权利要求2所述的菌剂在降解废水中喹诺酮类抗生素的应用，其中，所述喹诺酮类抗生素为左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星中的任意一种或多种。
7.根据权利要求6所述的应用，所述废水中喹诺酮类抗生素的含量为100~500mg/L，所述废水的盐浓度为0g/L~60g/L。
8.一种喹诺酮类抗生素废水处理方法，所述喹诺酮类抗生素为左氧氟沙星、莫西沙星和依诺沙星中的任意一种或多种，其特征在于，包括如下步骤：
（1）在废水收集池收集废水，调节废水pH为6.8~7.0，并向废水中补充甲醇、氯化铵和磷酸二氢钾，调节废水中的COD、N和P的含量，使废水中COD：N：P的质量浓度比为200~300:5:1，混合均匀后引入SBR反应器中；
（2）向反应器中投加活性污泥，同时投加权利要求2所述的菌剂，控制SBR反应器中的溶解氧在3~4mg/L，pH为7.0~7.5，温度为25~35°C，进行生物强化降解，活性污泥和菌剂的投加量分别为SBR反应器有效体积的10~15%。
9.一种降解喹诺酮类抗生素废水的生物强化处理设备，其特征在于，所述生物强化处理装备包括SBR反应器，所述SBR反应器设置有搅拌器、曝气装置、菌剂投加单元和PLC自控系统，其中所述菌剂投加单元中设置有权利要求2所述的菌剂；所述PLC自控系统用于检测系统温度和pH。
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| GR01 | Patent grant | ||
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