CN114480221B - 一种短稳杆菌及其在甲醛降解上的应用 - Google Patents

一种短稳杆菌及其在甲醛降解上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种能够降解甲醛的短稳杆菌,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为:CGMCC No.24414,本发明的短稳杆菌能够高效降解污废水中的甲醛,耐受高达160mg/L的甲醛浓度,且在4%的盐度条件下仍可高效繁殖。

Description

一种短稳杆菌及其在甲醛降解上的应用
技术领域
本发明涉及一株短稳杆菌、包含该短稳杆菌的微生物菌剂以及该菌株和微生物菌剂在甲醛降解方面的应用,属于环境微生物技术领域。
背景技术
甲醛被广泛应用于树脂、塑料、造纸、人造纤维、防腐、皮革、胶合板等行业,在这些产品的工业生产过程中,会产生大量的含甲醛废水,含甲醛废水具有强烈的刺激性气味,能抑制微生物的活性或致微生物死亡;对水生生物产生毒害作用;对人及动物易产生呼吸道刺激,导致肝肺功能异常、免疫功能下降等,因此甲醛被世界卫生组织确定为致癌和致畸性物质。
传统的甲醛降解方法主要是依靠物理法和化学法,但存在处理效果不理想、运行管理繁琐、运行费用高、产生二次污染等问题,因此需要另外寻求途径解决。
生物法处理废水是利用微生物的新陈代谢,将有害的有机物降解为无害的无机物,该方法使用条件温和,无二次污染,且成本低廉。因此筛选分离具有较强降解甲醛作用的微生物菌株已成为近年来国内外的研究热点,目前筛选分离到的甲醛降解菌株多为细菌,还有少部分的真菌,降解效果总体来说是从低浓度到高浓度的筛选趋势,因而筛选能够高效降解甲醛的菌株成为甲醛生物处理的主要解决方式。
发明内容
本发明针对目前生物法处理甲醛的现状,提供一种能够在温和的环境条件下对甲醛进行降解,并且在甲醛降解的过程中不会产生新的污染物的短稳杆菌,包含其的微生物菌剂以及二者在降解甲醛方面的应用。
一种短稳杆菌(Empedobacter brevis)MDF-1,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为:CGMCC No.24414,保藏日期为:2022年2月21日,其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示,在没有特别说明的情况下,本发明中所述的短稳杆菌均是指短稳杆菌MDF-1菌株。
该菌株是从活性污泥中分离得到的,菌落表面光滑,菌落为圆形,呈黄色,革兰氏阴性菌,短杆菌。
本发明提供的短稳杆菌的有益效果是:
1)能够高效降解污废水中的甲醛,在甲醛浓度为40mg/L、30℃实验时,可在8小时内降解掉80%以上的甲醛;针对40-80mg/L的甲醛浓度,30℃、48h的甲醛降解率可达到100%;
2)能够耐受高浓度的甲醛,在甲醛浓度为160mg/L的条件下测试时,该菌株的活菌数仍可呈阳性增殖生长;
3)中度耐盐,在4%的盐度条件下仍可高效繁殖,30℃条件下活化24h后活菌数达到40亿/ml,在2%以下的盐度条件下生长是最优的。
本发明提供的短稳杆菌降解甲醛的机理为:
该菌株在生长代谢的过程中,应该会产生甲醛脱氢酶和甲酸脱氢酶,甲醛在甲醛脱氢酶作用下,逐渐被氧化成甲酸,然后在甲酸脱氢酶作用下,最终降解为水和二氧化碳。
本发明还要求保护包含上述短稳杆菌的微生物菌剂。
本发明短稳杆菌的发酵方法包括如下步骤:
(1)一级种子液培养:无菌条件下,取短稳杆菌接种于富集培养基中,于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h,得到一级种子培养液。
(2)二级种子液培养:无菌条件下,将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-5vol%的接种量接种于富集培养基中,于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h,得到二级种子培养液;
(3)发酵:待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后,将步骤(2)所得的二级种子培养液按照5-10vol%的接种量接种于发酵培养基中,控制温度为25-35℃,通气比为1:(1-2),转速150-300rpm的条件下发酵,发酵12-24h后得发酵液。
进一步,所述富集培养基的组成为:胰蛋白胨5-15g/L,酵母浸粉3-8g/L,氯化钠5-15g/L,溶剂为水,且pH=6.5-8。
进一步,所述发酵培养基的组成为:碳源20-50g/L、氮源10-30g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L,溶剂为水,且pH=6.5-8。
进一步,所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种。
进一步,所述氮源选自酵母浸粉、豆饼粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液的总体积之比。
在实际应用过程中,可根据实际的使用和存储需要来确定微生物菌剂产品的最终形态,当需要使用液态产品时,将发酵液稀释至所需要的浓度即可直接使用,当需要使用固态产品时,可将发酵液离心后获得菌泥,然后采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺制得固态菌粉。
本发明还要求保护使用短稳杆菌的活化液或包含短稳杆菌的微生物菌剂净化污废水的方法,包括向污废水中施加短稳杆菌的活化液或微生物菌剂的步骤,并且净化过程中控制温度为20-30℃。
进一步,污废水中甲醛的浓度为40-160mg/L,更优选40-120mg/L,最优选40-80mg/L。
进一步,污废水的盐度为4%以下,最优选2%以下。
进一步,短稳杆菌的活化液添加量为100ppm以上,优选100-1000ppm,最优选100-500ppm,微生物菌剂的固态菌粉添加量为0.1wt%以上,优选0.5wt%以上,最优选0.5-1.5wt%。
本发明还要求保护短稳杆菌和包含短稳杆菌的微生物菌剂在甲醛降解上的应用。
进一步,用于降解污废水中的甲醛。
进一步,污废水中甲醛的浓度为40-160mg/L,更优选40-120mg/L,最优选40-80mg/L。
进一步,污废水的盐度为4%以下,最优选2%以下。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1:短稳杆菌的筛选与分离
1、菌株的筛选与分离
采集济南市某工业污水处理站的活性污泥100ml加入到锥形瓶中,然后往锥形瓶中加入1ml的甲醛溶液,30℃、180rpm条件下振荡培养48h,过滤后得细菌富集液。
采用梯度稀释法将该细菌富集液稀释至10-4,分别吸取10-2、10-3和10-4稀释液各100μl至无机盐固体培养基(CaCl2 0.1g,NaCl 0.5g,(NH4)2SO4 1.5g,K2HPO4 1.5g,KH2PO40.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,琼脂15g/L,甲醛4mg/L,水1000ml)中,涂布均匀后倒置于30℃条件下培养,约24h长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上,30℃条件下培养约24h,然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到4株菌株,分别编号为:MDF-1、MDF-2、MDF-3和MDF-4。
2、效果评价
无菌环境中,将初筛得到的4株菌分别挑取1环接种于盛有100ml活化培养基(蛋白胨10g,酵母浸粉5g,氯化钠10g,自来水1000ml)的250ml三角瓶中,30℃、220rpm条件下培养24h进行活化,得活化液。
实验过程如下:
分别吸取0.1ml各菌株的活化液接种至盛有100ml评价废水的250ml三角瓶中,所用评价废水为含40mg/L甲醛的废水,30℃、220rpm条件下培养。设置1组对照组,用无菌水代替活化液作为对照组,各实验组分别设置3个平行,定期检测评价废水中甲醛的含量。
甲醛的检测方法按照HJ601-2011《水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法》执行,结果如表1所示。
表1.各菌株降解甲醛的效果
根据表1中的检测结果可知,与其他菌株相比,MDF-1菌株在降解甲醛方面表现出巨大的优势,24h甲醛降解率可达98%。
3、检测鉴定
MDF-1菌株的菌种斜面经过16S rDNA基因序列检测鉴定,鉴定结果为短稳杆菌Empedobacter brevis。该菌株的16S rDNA基因序列测定结果如SEQ ID No:1所示。
实施例2:短稳杆菌的环境耐受度实验
2.1微生物菌剂的制备
1)一级种子液培养:无菌条件下,取短稳杆菌接种于富集培养基中,富集培养基的组成为:胰蛋白胨5g/L,酵母浸粉3g/L,氯化钠5g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;于25℃、150rpm的条件下培养36h,得到一级种子培养液;
2)二级种子液培养:无菌条件下,将短稳杆菌的一级种子培养液按照5vol%的接种量接种于富集培养基中,于25℃、150rpm的条件下培养36h,得到二级种子培养液;
3)发酵:在发酵罐中装入总体积60%的发酵培养基,发酵培养基组成为:尿素10g/L、酵母浸粉10g/L、硫酸铵10g/L、醋酸钠10g/L、丁二酸钠10g/L、葡萄糖30g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;待发酵培养基消毒完毕后,将步骤(2)所得的短稳杆菌的二级种子培养液按照7vol%的接种量接种于发酵培养基中,控制温度为25℃,通气比为1:(1-2),转速150rpm的条件下发酵,发酵36h后得发酵液;
4)制备固体菌粉:将步骤(3)所得的发酵液离心后制成菌泥,向菌泥中添加30wt%的甘油做保护剂后冷冻干燥,后粉碎制得短稳杆菌菌粉,经测试,菌粉的活菌量为5000亿cfu/g。
2.2盐度耐受实验过程
配制一系列无碳培养基,培养基配方如下:胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,且pH=6.5-8,水1000ml,取100ml无碳培养基分装于250ml锥形瓶中,然后将不同质量的氯化钠加入到上述无碳培养基中,最终形成盐度梯度为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的培养基,然后将不同盐度的培养基在120℃条件下灭菌30min。
在无菌条件下,分别向各个培养基中加入0.4wt%的短稳杆菌菌粉,后置于30℃、220rpm条件下培养,24h后测其OD600值及活菌数,结果如表2所示。
表2短稳杆菌在不同盐度条件下培养24h后的OD600值和活菌数
培养基盐度 OD600 活菌数
0.5% 1.000 98亿/ml
1% 0.937 90亿/ml
2% 0.821 83亿/ml
3% 0.499 50亿/ml
4% 0.353 40亿/ml
5% 0.108 10亿/ml
表2中的结果表明,随着培养基盐度的增加,短稳杆菌的生长繁殖逐步变慢,在2%以下盐度时,盐度对其生长的影响微弱,在3-4%盐度条件下,盐度对其生长的作用开始显现,在盐度为5%的环境下,菌落数比较低,由此判断本发明菌株的最高耐盐度为4%。
2.3温度耐受实验过程
配制富集培养基,配方如下:胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,且pH=6.5-8,水1000ml,取100ml富集培养基分装于250ml锥形瓶中,然后在120℃、30min条件下灭菌。
在无菌条件下,分别向富集培养基中加入0.4wt%的短稳杆菌菌粉,后分别置于10℃、20℃、30℃、40℃,220rpm条件下培养,24h后测其OD600值及活菌数。每个实验组设置3个平行实验,具体实验安排如下:
实验组1:培养温度10℃;
实验组2:培养温度20℃;
实验组3:培养温度30℃;
实验组4:培养温度40℃;
表3短稳杆菌在不同温度下培养24h后的OD600值和活菌数
温度 OD600 活菌数
10℃ 0.071 2亿/ml
20℃ 0.657 80亿/ml
30℃ 0.939 102亿/ml
40℃ 0.134 10亿/ml
表3中的结果显示,短稳杆菌的适宜生长温度为20-30℃,在20℃以下的温度条件下,活性比较低,生长慢;当温度达到40℃时,高温抑制了该菌株的生长,因而判断本发明菌株生长的最适宜温度为30℃。
实施例3:短稳杆菌对甲醛的降解能力
3.1微生物菌剂的制备
1)一级种子液培养:无菌条件下,取短稳杆菌接种于富集培养基中,富集培养基的组成为:胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,氯化钠10g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;于30℃、200rpm的条件下培养24h,得到一级种子培养液;
2)二级种子液培养:无菌条件下,将短稳杆菌的一级种子培养液按照1vol%的接种量接种于富集培养基中,于30℃、200rpm的条件下培养24h,得到二级种子培养液;
3)发酵:在发酵罐中装入总体积60%的发酵培养基,发酵培养基组成为:蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、葡萄糖35g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;待发酵培养基消毒完毕后,将步骤(2)所得的短稳杆菌的二级种子培养液按照10vol%的接种量接种于发酵培养基中,控制温度为30℃,通气比为1:(1-2),转速200rpm的条件下发酵,发酵12h后得发酵液;
4)制备固体菌粉:将步骤(3)所得的发酵液离心后制成菌泥,向菌泥中添加30wt%的甘油做保护剂后冷冻干燥,后粉碎制得短稳杆菌菌粉,菌粉的活菌量为4500亿cfu/g。
3.2效果评价
将100ml的无菌水分装于250ml三角瓶中,分别再取10μl甲醛溶液(含甲醛36-38%)加入到上述的100ml无菌水中作为评价培养基,在无菌条件下,分别向评价培养基中加入质量比0.01%、0.05%、0.1%、0.5%的短稳杆菌菌粉,后置于30℃、220rpm条件下培养,每个实验组设置3个平行实验,并设置1个未添加短稳杆菌菌粉的空白对照,每隔2h检测评价培养基中的甲醛含量。具体实验安排如下:
空白组1:未加菌粉;
实验组2:短稳杆菌菌粉添加量0.01wt%;
实验组3:短稳杆菌菌粉添加量0.05wt%;
实验组4:短稳杆菌菌粉添加量0.1wt%;
实验组5:短稳杆菌菌粉添加量0.5wt%。
3.3评价结果
甲醛的检测方法按照HJ601-2011《水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法》执行,实验结果见表4。
表4不同添加量的短稳杆菌菌粉对甲醛的降解效果
从表4中的结果可知,在各实验组的评价培养基平均初始甲醛浓度约为40mg/L的条件下,向其中投加不同量的短稳杆菌菌粉后对甲醛的降解效果还是有所差异的,随着短稳杆菌菌粉投加量的增加以及时间的延长,甲醛降解效率逐步增加。
实验组4在2h内甲醛降解率达到80%,后再增加短稳杆菌菌粉的投加量(实验组5),甲醛降解的效果并未显著增加,因而认为短稳杆菌菌粉的最佳投加量为0.1wt%,此时在2h内甲醛降解率达到80%,8h内甲醛降解率达到98%。
实施例4:短稳杆菌对甲醛浓度的耐受实验
4.1微生物菌剂的制备
1)一级种子液培养:无菌条件下,取短稳杆菌接种于富集培养基中,富集培养基的组成为:胰蛋白胨15g/L,酵母浸粉8g/L,氯化钠15g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;于35℃、300rpm的条件下培养12h,得到一级种子培养液;
2)二级种子液培养:无菌条件下,将短稳杆菌的一级种子培养液按照2.5vol%的接种量接种于富集培养基中,于35℃、300rpm的条件下培养12h,得到二级种子培养液;
3)发酵:在发酵罐中装入总体积60%的发酵培养基,发酵培养基组成为:豆饼粉10g/L、蔗糖10g/L、淀粉10g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L,溶剂为水且pH=6.5-8;待发酵培养基消毒完毕后,将步骤(2)所得的短稳杆菌的二级种子培养液按照5vol%的接种量接种于发酵培养基中,控制温度为35℃,通气比为1:(1-2),转速300rpm的条件下发酵,发酵24h后得发酵液;
4)制备固体菌粉:将步骤(3)所得的菌株的发酵液离心后制成菌泥,向菌泥中添加30wt%的甘油做保护剂后冷冻干燥,后粉碎制得短稳杆菌菌粉,菌粉的活菌量为5400亿cfu/g。
4.2实验过程
配制无碳培养基,培养基配方如下:CaCl2 0.1g,NaCl 0.5g,(NH4)2SO4 1.5g,K2HPO4 1.5g,KH2PO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,水1000ml。取100ml的无碳培养基分装于250ml锥形瓶中,120℃下灭菌30min。
将不同量的甲醛溶液加入到无碳培养基中,最终形成甲醛的浓度梯度为40、80、120、160、200mg/L的评价培养基。
在无菌条件下,分别向各个评价培养基中加入0.1wt%的短稳杆菌菌粉,后置于30℃、220rpm条件下培养,每隔24h检测评价培养基中的甲醛含量。每个实验组均设置3个平行实验,具体实验安排如下:
实验组1:甲醛浓度40mg/L;
实验组2:甲醛浓度80mg/L;
实验组3:甲醛浓度120mg/L;
实验组4:甲醛浓度160mg/L;
实验组5:甲醛浓度200mg/L。
4.3实验结果
甲醛的检测方法按照HJ601-2011《水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法》执行,结果如表5所示。
表5短稳杆菌对不同浓度甲醛的降解实验效果
由表5中的结果可以看出,短稳杆菌可以在甲醛浓度为40-160mg/L的评价培养基中呈阳性增殖生长,由此判断本发明短稳杆菌的最高甲醛耐受浓度为160mg/L,在甲醛浓度为80mg/L以下时,降解效果最为显著,48h降解率可达100%。
实施例5:短稳杆菌在含甲醛的化工废水中的应用
取济南某化工厂废水,原水经芬顿高级氧化处理后进入SBR生化段,废水中甲醛含量为120mg/L,COD值为920mg/L,pH值约为7,将短稳杆菌菌粉(制备方法同实施例2)按照0.1wt%的投加量投加至化工厂废水中,30℃摇床培养,于不同时间段取样,测定剩余的甲醛含量。
甲醛的检测方法按照HJ601-2011《水质甲醛的测定乙酰丙酮分光光度法》执行,结果显示,6h甲醛浓度可降解至10mg/L以下,去除率90%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
<120> 一种短稳杆菌及其在甲醛降解上的应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1417
<212> DNA
<213> 短稳杆菌(Empedobacter brevis)
<400> 1
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taattcgatg atacgcgagg aaccttacca aggcttaaat gcataatgac agatctagaa 960
atagattttt cttcggacag aatgcaaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgccgtg 1020
aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc aacccctatc attagttgcc agcgtttaaa 1080
gacggggact ctaatgagac tgccggtgca aaccgcgagg aaggtgggga cgacgtcaag 1140
tcatcacggc ccttacgtct tgggctacac acgtgctaca atggtaagta cagagggcag 1200
ctacttggca acaagatgcg aatctcgaaa acttatctca gttcggattg gagtctgcaa 1260
ctcgactcta tgaagctgga atcgctagta atcgcatatc agccatgatg cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca agccatggaa gctgggggta cctgaagtcg 1380
gtgaccgtaa aaggagctgc ctagggtaaa cggattt 1417

Claims (13)

1.一种短稳杆菌(Empedobacter brevis),其特征在于,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.24414。
2.一种微生物菌剂,其特征在于,有效成分包含权利要求1所述的短稳杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,所述微生物菌剂为固态菌粉。
4.权利要求1所述短稳杆菌的发酵方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)一级种子液培养:无菌条件下,取短稳杆菌接种于富集培养基中,于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h,得到一级种子培养液;
(2)二级种子液培养:无菌条件下,将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-5vol%的接种量接种于富集培养基中,于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h,得到二级种子培养液;
(3)发酵:待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后,将步骤(2)所得的二级种子培养液按照5-10vol%的接种量接种于发酵培养基中,控制温度为25-35℃,通气比为1:(1-2),转速150-300rpm的条件下发酵,发酵12-24h后得发酵液。
5.根据权利要求4所述的发酵方法,其特征在于,
所述富集培养基的组成为:胰蛋白胨5-15g/L,酵母浸粉3-8g/L,氯化钠5-15g/L,溶剂为水,且pH=6.5-8;
所述发酵培养基的组成为:碳源20-50g/L、氮源10-30g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.5-1.5g/L,溶剂为水,且pH=6.5-8;
所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种;
所述氮源选自酵母浸粉、豆饼粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵或硝酸钾中的一种或多种。
6.一种净化污废水的方法,其特征在于,包含向污废水中施加权利要求1所述短稳杆菌的活化液或权利要求2或3所述的微生物菌剂的步骤,并且所述净化过程中控制温度为20-30℃。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述污废水中甲醛的浓度为40-160mg/L。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述污废水中甲醛的浓度为40-120mg/L。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述污废水中甲醛的浓度为40-80mg/L。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法,其特征在于,所述污废水的盐度为4%以下。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述污废水的盐度为2%以下。
12.权利要求1所述的短稳杆菌和权利要求2或3所述的微生物菌剂在甲醛降解上的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,所述短稳杆菌和微生物菌剂用于降解污废水中的甲醛。
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