CN115975874A - 一株克氏假单胞菌及其在污废水净化领域的应用 - Google Patents

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CN115975874A CN202211489307.3A CN202211489307A CN115975874A CN 115975874 A CN115975874 A CN 115975874A CN 202211489307 A CN202211489307 A CN 202211489307A CN 115975874 A CN115975874 A CN 115975874A
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刘圣鹏
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Abstract

本发明涉及一株克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)phe001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物所，保藏号为CGMCC No.25227，保藏日期为2022年7月4日。该菌株能够高效降解水体中的苯酚，在苯酚浓度为500mg/L时，30℃条件下，可在2d达到85％以上的降解率；且该菌株能够提高生化系统的苯酚耐受度，增强系统的抗冲击力。

Description

一株克氏假单胞菌及其在污废水净化领域的应用
技术领域
本发明涉及一株克氏假单胞菌、包含该克氏假单胞菌的微生物菌剂及其在污废水净化领域的应用，属于环境微生物技术领域。
背景技术
苯酚废水主要来源于焦化、煤气、炼油和以苯酚或酚醛为原料的化工、冶炼和制药等生产过程。此类废水来源广、组成复杂、毒性大，人或动物吸入高浓度蒸气可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等，同时也会抑制中枢神经或损伤肝、肾功能。
苯酚已被国家水污染控制中心列为重点消除的污染物，酚类污染已经威胁着人类和动物的安全，目前对于此类废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法，其中物理、化学法存在能耗大、成本高且容易引起二次污染等不足，而生物强化法则利用微生物的新陈代谢作用将废水中的酚类物质代谢转化为无毒的有机物或无机物，利用微生物体内的酶来分解酚以合成自身的有机质，使污水得到净化，这种方法不仅危害少，而且成本低廉，因此在苯酚污染的治理中起到越来越重要的作用。
目前的苯酚降解菌株大多存在降解效率低或者苯酚耐受度低的问题，因此获取高降解效率、高耐受度的菌株是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明针对现有的苯酚降解菌株在处理含苯酚废水的过程中所存在的降解效率低、苯酚耐受度低的问题，提供一株克氏假单胞菌、包含其的微生物菌剂及其在污废水的净化领域的应用。
一株克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)phe001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物所，保藏号为CGMCC No.25227，保藏日期为2022年7月4日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的克氏假单胞菌均是指克氏假单胞菌phe001菌株。
本发明的克氏假单胞菌自活性污泥中筛选分离获得，属假单胞菌、革兰氏阴性菌，在营养琼脂平板上30℃培养24h，形成乳白色且表面光滑的圆形菌落。
本发明提供的克氏假单胞菌的有益效果是：
(1)该菌株能够高效降解水体中的苯酚，在苯酚浓度为500mg/L时，30℃条件下，可在2d达到85％以上的降解率；
(2)该菌株可以耐受高浓度的苯酚，在苯酚浓度达到1000mg/L时，30℃条件下，可在8d实现85％以上的降解率；
(3)该菌株能够提高生化系统的苯酚耐受度，增强系统的抗冲击力。
本发明的克氏假单胞菌能够降解苯酚污染物的作用机理如下：
微生物菌株对酚类的降解本质上是酶促反应的过程，具体可分为羟化酶途径和羧化途径，其中好氧过程为羟化酶途径，苯酚首先经苯酚羟化酶转化为邻苯二酚，这是整个苯酚代谢途径的限速反应，由此决定了苯酚降解的动力学属性，邻苯二酚经邻位或间位途径开环裂解为三羧酸产物，进入物质和能量代谢，以此来降解苯酚。
本发明的克氏假单胞菌的发酵方法包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下，将克氏假单胞菌接种于营养培养基中，置于25-35℃、180-300r/min条件下培养20-36小时，获得一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-10vol％的比例接种于营养培养基中，置于25-35℃、180-300r/min条件下培养20-36小时，获得二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-10vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速180-300r/min，于通气比1：(1-2)的条件下发酵，发酵过程中调节pH为6.5-7.5，待20-36h后停止发酵，得发酵液。
进一步，所述营养培养基的组成为：胰蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉3-8g/L，氯化钠5-15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8.0；
进一步，所述发酵培养基的组成为：碳源10-50g/L、氮源5-15g/L、K+1.0-1.5g/L、Mg2+0.02-0.5g/L、Ca2+0.1-0.5g/L、Mn2+0.01-0.5g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
进一步，所述碳源选自葡萄糖、酒石酸钾钠、蔗糖、淀粉、琥珀酸或柠檬酸钠中的一种或多种。
进一步，所述氮源选自硝酸钾、磷酸氢二铵、尿素、酵母粉、蛋白胨或氯化铵中的一种或多种。
优选的，培养基中所涉及到的离子、盐等等都可来源于无机化合物中，所述K+的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg2+的来源为硫酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述Ca2+的来源为氯化钙、碳酸钙中的一种或多种，所述Mn2+的来源为硫酸锰。
本发明还要求保护使用上述的克氏假单胞菌的活化液和包含克氏假单胞菌的微生物菌剂净化污废水的方法，包括向污废水中接种克氏假单胞菌株的活化液或包含克氏假单胞菌的微生物菌剂的步骤。
优选的，克氏假单胞菌的活化液和包含克氏假单胞菌的微生物菌剂的接种量为500ppm以上，更优选500-10000ppm，进一步优选100-5000ppm，最优选500-1000ppm。
优选的，污废水的盐度为2％以下，优选1％以下。
本发明还要求保护上述的克氏假单胞菌和微生物菌剂在污废水净化领域的应用，优选的，所述克氏假单胞菌和微生物菌剂用于降解污废水中的挥发酚，最优选的，所述克氏假单胞菌和微生物菌剂用于降解水中的苯酚。
优选的，所述污废水中苯酚的浓度为1000mg/L以下，优选500mg/L以下。
在实际应用过程中，可根据实际的使用和存储需要来确定最终的克氏假单胞菌产品的形态，当需要使用液态产品时，将发酵液稀释至所需要的浓度即可直接使用，当需要使用固态产品时，可将发酵液离心后获得菌泥，然后采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺制得固态菌粉。
附图说明
图1为克氏假单胞菌的菌落形态照片；
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1.克氏假单胞菌的分离纯化与鉴定
1、克氏假单胞菌的筛选与分离
选取潍坊某化工厂污水站的好氧段活性污泥进行菌株富集筛选，取10mL活性污泥添加至100mL含有200ppm苯酚为唯一碳源的富集液中，30℃、200r/min摇床震荡培养，3d后取10mL富集液转接至下一轮含有500ppm苯酚为唯一碳源的富集液中，培养4d后，得到富集液。
对富集液进行梯度稀释，将稀释至10-5、10-6、10-7浓度下的富集液进行菌株涂布分离，平板采用以苯酚为唯一碳源的固体无机盐选择培养基(磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠0.2g/L、硝酸钾1g/L、氯化铵1g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、一水合硫酸锰0.01g/L、琼脂20g/L、苯酚250mg/L)，稀释涂布后将平板倒置于30℃培养箱中静置培养24h，挑取单菌落在营养琼脂平板上进行纯化，纯化后的单菌转至营养斜面培养基上，30℃条件下培养24h，然后转至4℃冰箱中备用。
对筛得的单菌进行高通量测序鉴定，筛除致病菌后，最终得到三株菌，分别命名为Phe001、Phe002和Phe003。
2、菌株初筛
(1)活化液制备：无菌环境下，分别挑取三株菌的斜面菌种接种至装有50mL营养培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝7.0)的100mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃、200r/min的摇床中培养24h得活化液；
(2)将评价培养基(磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠0.2g/L、氯化钙0.2g/L、硝酸钾1g/L、氯化铵1g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、一水合硫酸锰0.01g/L、琼脂20g/L)分装至250mL的三角瓶中，每瓶装95mL培养基，于121℃条件下灭菌20min。灭菌完成待无机盐冷却后均向其中添加5mL事先配置好的10g/L苯酚溶液，使每个三角瓶中的苯酚浓度均在500mg/L左右；
(3)评价方法：分别向评价培养基中投加三种菌株的活化液0.5mL，每组实验设置三个平行，空白组改为投加0.5mL的营养培养基，定期取样离心检测其中苯酚的含量，苯酚的测定采用4-氨基安替比林分光光度法(HJ503-2009)，苯酚降解效果如表1所示。
表1各菌株的苯酚降解效果
Figure BDA0003962864120000051
Figure BDA0003962864120000061
由表1可知，菌株Phe001和Phe002均有苯酚降解效果，相较于Phe002而言，菌株Phe001有着更突出的优势，可实现2d苯酚降解效率达85％，故选择Phe001为研究对象。
3、鉴定
将菌株Phe001纯化后经16S rDNA基因序列鉴定，其鉴定结果为克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)，序列结果如下SEQ ID No:1所示。
实施例2：菌株特点探究
活化液制备：无菌环境下，挑取克氏假单胞菌斜面菌种接种至装有50mL营养培养基的100mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃、200r/min的摇床中培养24h得克氏假单胞菌的活化液，备用。
2.1温度耐受实验
实验用培养基配置，称取胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g，溶解于1000mL蒸馏水中，pH调节至6.5-8.0，各取100mL分装于250mL三角瓶中，于121℃条件下灭菌20min，待用。
无菌条件下向实验培养基中接种1％的克氏假单胞菌活化液，将反应系统分别置于转速为200r/min、不同温度(10℃、20℃、30℃、40℃)条件下培养，每组实验条件下设置3个平行组，48h后取样检测其OD600值取平均值，确定其生长情况。
表2不同温度下克氏假单胞菌生长状况
Figure BDA0003962864120000062
Figure BDA0003962864120000071
由表2可知，克氏假单胞菌在温度为20-30℃时，生长状态最佳，当低于或高于这个温度后，菌体生长明显受到抑制，同时也可看出该菌最佳生长温度为30℃。
2.2盐度耐受实验
实验用培养基配置，称取胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、以及不同浓度梯度的氯化钠(0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％)，溶解于1000mL蒸馏水中，pH调节至6.5-8.0，各取100mL分装于250mL三角瓶中，于121℃条件下灭菌20min，待用。
无菌条件下，向实验培养基中接种1％的克氏假单胞菌活化液，将反应系统分别置于30℃、200r/min条件下培养，每组实验条件下设置3个平行组，48h后取样检测其OD600值取平均值，确定其生长情况。
表3不同盐度条件下克氏假单胞菌的生长状况
盐度 <![CDATA[OD<sub>600</sub>]]>
0.5％ 2.89
1.0％ 2.09
2.0％ 1.46
3.0％ 0.81
4.0％ 0.31
5.0％ 0.24
由表3可知，随着盐度的增加，克氏假单胞菌的生长受到抑制，且随盐度的增加抑制作用也在增加，当盐度超过2.0％时，几乎完全抑制其生长，盐度在0.5—1.0％之间比较适合克氏假单胞菌生长。
2.3pH耐受实验
实验用培养基配置，称取胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g/L，溶解于1000mL蒸馏水，pH调节至6.5-8.0，各取100mL分装于250mL三角瓶中，于121℃条件下灭菌20min，待培养基冷却后无菌条件下调节培养基pH设置梯度为5.5、6.5、7.5和8.5。
无菌条件下，向各个实验培养基中接种1％的克氏假单胞菌活化液，将反应系统分别置于30℃、200r/min条件下培养，每组实验条件下设置3个平行组，48h后取样检测其OD600值取平均值，确定其生长情况。
表4不同pH条件下克氏假单胞菌的生长状况
pH <![CDATA[OD<sub>600</sub>]]>
5.5 2.53
6.5 2.63
7.5 2.53
8.5 2.28
由表4可知，pH在5.5-8.5之间变化时对克氏假单胞菌影响较小。随着pH的增加，OD600值先增加再减少，最适pH为6.5。
实施例3：实验室模拟废水小试测试
3.1微生物菌剂制备
(1)一级种子培养：无菌条件下，取一环克氏假单胞菌接种于营养培养基中，后置于25-35℃、200r/min条件下培养24h，获得一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下，以5％接种量将步骤(1)所得一级种子液接种到营养培养基中，后置于25-35℃、200r/min条件下培养24h，获得二级种子培养液；
(3)发酵：发酵培养基组成为葡萄糖10g/L、酵母粉6.5g/L、K+1.0-1.5g/L、Mg2+0.02-0.5g/L、Ca2+0.1-0.5g/L、Mn2+0.01-0.5g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8；发酵培养基灌装量占发酵罐总体积的70％，待灭菌完成，将步骤(2)所得二级种子培养液以1％的接种量接种至发酵罐中，控制发酵过程温度为30℃、转速150r/min，于通气比1：(1-2)的条件下发酵，发酵过程中调节pH为6.5-7.5，待24h停止发酵，得发酵液；
(4)固体菌粉制备：将步骤(3)所得的发酵液离心后制成菌泥，向菌泥中添加10％奶粉、2％甘油和3％海藻糖做保护剂，进行冷冻干燥，后粉碎制得克氏假单胞菌菌粉，经测试，菌粉的活菌量为2000亿cfu/g。
3.2苯酚耐受度评价
(1)将评价培养基(磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠0.2g/L、氯化钙0.2g/L、硝酸钾1g/L、氯化铵1g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、一水合硫酸锰0.01g/L)分装至250mL三角瓶中，每瓶装100mL，于121℃条件下灭菌20min，灭菌完成冷却后，向其中投加不同量的事先配置好的20g/L苯酚溶液，使苯酚成不同浓度梯度(500mg/L、1000mg/L、1500mg/L)，备用。
(2)评价方法：向评价培养基中投加克氏假单胞菌菌粉，投加量设置为500mg/L，每组实验设置3个平行组，将反应系统置于30℃、200r/min条件下，每天检测苯酚的剩余量，苯酚检测采用水质挥发酚的测定4-氨基安替比林分光光度法(HJ503-2009)。
具体实验安排如下：
实验组1：苯酚500mg/L；
实验组2：苯酚1000mg/L；
实验组3：苯酚1500mg/L；
实验结果如表5所示：
表5克氏假单胞菌对不同浓度苯酚的降解效果
苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L)
时间 0d 1d 2d 3d 7d
实验组1 510.3 401.3 70.3 34.8 ——
实验组2 1115.8 1109.7 1052.7 629.2 91.6
实验组3 1637.8 1571.4 1569.1 1492.2 1428.9
由表5可知，克氏假单胞菌对苯酚的耐受度可到达1000mg/L，且对1000mg/L之内的苯酚具有较好的降解效果，3天可将500mg/L的苯酚降解至35mg/L之内降解效率达90％以上，7天内可将1000mg/L的苯酚降解至100mg/L内降解率达到90％以上。
3.3接种量评价
(1)将评价培养基(磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠0.2g/L、氯化钙0.2g/L、硝酸钾1g/L、氯化铵1g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L、一水合硫酸锰0.01g/L)分装至250mL三角瓶中，每瓶装95mL，于121℃条件下灭菌20min，灭菌完成冷却后均投加5mL事先配置好的10g/L苯酚溶液，使苯酚浓度在500mg/L左右，备用。
(2)向反应系统中投加不同量的克氏假单胞菌菌粉(200mg/L、500mg/L、800mg/L)，每个菌剂浓度设置三个平行，将反应系统置于30℃、200r/min条件下，每天检测苯酚的剩余量，苯酚检测采用水质挥发酚的测定4-氨基安替比林分光光度法(HJ503-2009)。
具体实验安排如下：
对照组：克氏假单胞菌0mg/L
实验组1：克氏假单胞菌粉200mg/L；
实验组2：克氏假单胞菌粉500mg/L；
实验组3：克氏假单胞菌粉800mg/L；
实验结果如表6所示：
表6克氏假单胞菌接种量对苯酚降解效果的影响
苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L)
时间 0d 1d 2d 3d
对照组 518.2 516.6 516.5 514.9
实验组1 515.3 478.1 79.6 60.1
实验组2 514.3 469.3 60.1 49.1
实验组3 515.5 461.1 54.3 44.3
由表6可知，当苯酚浓度在500mg/L时，随着克氏假单胞菌接种量的增加，苯酚降解效率逐渐增加，综合经济性考虑，投加量设置为500mg/L时为最佳。
实施例4：实际废水中的应用实验
4.1实验用品
(1)实验用水：山东某化工企业气浮出水
(2)实验用菌剂：克氏假单胞菌冻干菌粉
4.2评价方法
取实验用水100mL置于250mL三角瓶中，向其中投加克氏假单胞菌菌粉，投加量设置为500mg/L，设置3个平行组，另取1组不投加菌剂作为空白对照，将反应系统置于30℃、200r/min条件下评价，每天检测苯酚的剩余量，苯酚检测采用水质挥发酚的测定4-氨基安替比林分光光度法(HJ503-2009)。
4.3实验结果
表7克氏假单胞菌对实际废水中苯酚的降解效果
空白组 实验组
时间(d) 苯酚(mg/L) 苯酚(mg/L)
0 468.8 468.8
1 474.49 396.85
2 390.63 229.67
3 380.23 80.45
4 360.88 12.45
由表7可知，克氏假单胞菌菌粉投加4天后，水样中的苯酚降至15mg/L以下，苯酚的去除率可达95％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株克氏假单胞菌(Pseudomonas knackmussii)，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物所，保藏号为CGMCC No.25227。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，有效成分包含权利要求1所述的克氏假单胞菌。
3.权利要求1所述克氏假单胞菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子液培养：无菌条件下，将克氏假单胞菌接种于营养培养基中，置于25-35℃、180-300r/min条件下培养20-36小时，获得一级种子培养液；(2)二级种子液培养：无菌条件下，将步骤(1)所得的一级种子培养液按照1-10vol％的比例接种于营养培养基中，置于25-35℃、180-300r/min条件下培养20-36小时，获得二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵培养基消毒完毕后，将步骤(2)所得的二级种子培养液按照1-10vol％的比例接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃、转速180-300r/min，于通气比1：(1-2)的条件下发酵，发酵过程中调节pH为6.5-7.5，待20-36h后停止发酵，得发酵液。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述营养培养基的组成为：胰蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉3-8g/L，氯化钠5-15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8.0；
所述发酵培养基的组成为：碳源10-50g/L、氮源5-15g/L、K+1.0-1.5g/L、Mg2+0.02-0.5g/L、Ca2+0.1-0.5g/L、Mn2+0.01-0.5g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、酒石酸钾钠、蔗糖、淀粉、琥珀酸或柠檬酸钠中的一种或多种；
所述氮源选自硝酸钾、磷酸氢二铵、尿素、酵母粉、蛋白胨或氯化铵中的一种或多种。
6.一种净化污废水的方法，其特征在于，包括向污废水中接种权利要求1所述的克氏假单胞菌的活化液或权利要求2所述微生物菌剂的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述污废水中苯酚的浓度为1000mg/L以下，更优选500mg/L以下。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述污废水的盐度为2％以下，优选1％以下。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述克氏假单胞菌的活化液和微生物菌剂的接种量为500ppm以上，更优选500-10000ppm，进一步优选100-5000ppm，最优选500-1000ppm。
10.权利要求1所述的克氏假单胞菌和权利要求2所述的微生物菌剂在污废水净化领域的应用，优选的，所述克氏假单胞菌和微生物菌剂用于降解污废水中的挥发酚，最优选的，所述克氏假单胞菌和微生物菌剂用于降解污废水中的苯酚。
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