CN117866793A - 兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌fhy-17及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY‑17及其应用，所述土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY‑17保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2023434，保藏日期2023年03月30日。该菌株能降解多种常见有机污染物，对于该菌株用于工业污染废气废水有机污染物治理具有一定的实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17及其应用。
背景技术
二氯乙烯(DCE)是一种重要的化工原料，作为溶剂、金属表面处理剂、医药等被广泛使用，它可以通过工业废水、废气排放、土壤污染、垃圾填埋场等途径进入环境中。DCE可以通过皮肤吸收、吸入和食入等途径进入人体，会对中枢神经系统、肝脏、肾脏、心脏和呼吸系统等造成严重损害。2021年10月生态环境部将DCE纳入了《新污染物治理行动方案(征求意见稿)》，因此DCE去除技术的开发迫在眉睫。
生物净化技术因具有去除效率高、处理成本低、二次污染小等优势，被广泛应用于污染物的降解和净化。而生物治理DCE的关键是获得具有高效降解DCE能力的菌株。但由于DCE极差的溶解度以及碳-氯原子之间的高键能，仅有少量的DCE降解细菌被分离出，主要包括假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillaceae)、梭杆菌(Fusobacterium)和潘多拉菌(Pandoraea)等，且降解效率还有待进一步提高。目前从环境中分离筛选高效的DCE降解菌，仍然是消除环境中氯代有机污染物的重要方法之一。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供了一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌，微生物分类命名为土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17，已在2023年03月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，邮政编码为430072；保藏编号为CCTCC NO:M 2023434；所述FHY-17的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一株以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17为活性成分的菌悬液及菌悬液的制备方法。
所述菌悬液以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17经固体培养、种子培养、液体培养后制成。
所述菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
(1)固体培养：将兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17接种至斜面培养基上，在20～40℃下培养2～4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0，琼脂18～20g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0。
第三方面，本发明提供了一种以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17为活性成分的菌悬液在降解二氯乙烯中的应用及其具体方法。
具体方法为：将所述菌悬液接种至0～1％盐浓度的第一DCE液体选择培养基中，以二氯乙烯为唯一碳源，在25～35℃的条件下培养，实现对二氯乙烯的降解；所述第一DCE液体选择培养基的终浓度组成为：DCE 1～35mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0～9.0；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
进一步地，具体方法为：将所述菌悬液接种至0.62％盐浓度的第一DCE液体选择培养基中，以二氯乙烯为唯一碳源，在35℃的条件下培养，实现对二氯乙烯的降解；所述第一DCE液体选择培养基的终浓度组成为：DCE 1～35mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.5；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl288mg/L，KI10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
第四方面，本发明还提供了一种以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17为活性成分的菌悬液在降解二氯甲烷、二氯丙烷、苯、氯苯、五氯苯或六氯苯中的应用。
本发明的有益效果是：菌株FHY-17能降解初始浓度0～35mg/L的DCE，最终降解产物为CO2、H2O和细胞生物量，平均矿化率为78.45％，平均细胞产率为0.1657mg cells/mgDCE，氯离子平均释放率为87.16％。该降解菌的发现对化学合成、制药行业废水废气中DCE的高效净化具有重要意义。该菌株还可降解其他同类工业常见有机污染物，比如二氯甲烷、二氯丙烷、苯、氯苯、五氯苯和六氯苯等。菌株FHY-17取自废气处理单元，对于氯代有机物，尤其是DCE具有较好地降解效果，可以较为完全地把DCE转化为CO2、H2O、细胞生物量等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解苯、氯苯等工业常见的污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为土壤短芽孢杆菌FHY-17的平板图；
图2为土壤短芽孢杆菌FHY-17的扫描电镜图；
图3为土壤短芽孢杆菌FHY-17的系统发育树图；
图4为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同浓度的DCE下的DCE浓度、细胞生物量随降解时间的变化图，其中，图4(a)为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同浓度的DCE下的DCE浓度随降解时间的变化图，图4(b)为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同浓度的DCE下的细胞生物量随降解时间的变化图；
图5为土壤短芽孢杆菌FHY-17在降解不同浓度DCE下CO2生成量、Cl-释放量及细胞生物量的变化图；
图6为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同转速下的DCE浓度、细胞生物量随降解时间的变化图，其中，图6(a)为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同转速下的DCE浓度随降解时间的变化图，图6(b)为土壤短芽孢杆菌FHY-17在不同转速下的细胞生物量随降解时间的变化图；
图7为土壤短芽孢杆菌FHY-17对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图，其中，图7(a)为24h时对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图，图7(b)为72h时对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加明白清楚，结合附图和实施例，对本发明进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均在本发明保护范围。
下面未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照厂家所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
本发明提供了一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌，微生物分类命名为土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17，已在2023年03月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2023434；所述FHY-17的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
土壤短芽孢杆菌是一种环境中常见的菌株，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用土壤短芽孢杆菌降解DCE的报道。该降解菌的发现对于工业废水废气中DCE等氯代有机污染物的净化具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17的分离、纯化及鉴定
1.土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17的分离及纯化
土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17是从浙江台州某橡胶厂废气处理装置的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌，具体步骤如下：
(1)采样：从浙江台州某橡胶厂废气处理装置的活性污泥中别多点采样，作为筛选兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17的原材料；
(2)菌株分离：取适量废气处理装置中活性污泥，蒸馏水冲洗5次后，空曝24h以去除残留有机物；配置第二DCE液体选择培养基对活性污泥进行定向驯化，往第二DCE液体选择培养基加入体积分数为5％的驯化污泥，于30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养，3d后以体积分数为10％的量转接到新的第二DCE液体选择培养基振荡培养，直到单菌落的出现，挑取单菌落接入第二DCE固体选择培养基，获取生长快、菌落规则和性状稳定的单菌落，记为菌株FHY-17。
本实施例中，所述第二DCE液体选择培养基的终浓度组成为：DCE 50mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0。所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
所述第二DCE固定选择培养基的终浓度组成为：DCE 50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O11mg/L，琼脂20g/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0。
2.菌株FHY-17的鉴定
a、菌株FHY-17的生理生化特征
对所获得的菌株FHY-17进行形态观察和生理生化鉴定，菌落呈黄色，边缘整齐，光滑湿润；扫描电镜下观察该菌体的形态为长杆菌，无鞭毛，革兰氏染色阳性，可生成芽孢，淀粉水解和吲哚试验阳性，可利用蔗糖和乳糖。菌株FHY-17如图1所示；扫描电镜下观察该菌体的形态为长杆菌，如图2所示。
b、菌株FHY-17的16S rRNA序列分析
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株FHY-17为Brevibacillusagri。
测序结果为：
gggagtggcggtgctatacatgcaagtcgagcgagtcccttcgggggctagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcctctcagactgggataacatagggaaacttatgctaataccggataggtttttggatcgcatgatctgaaaagaaaagatggcttttcgctatcactgggagatgggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaattttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgaacgatgaaggtcttcggattgtaaagttctgttgtcagggacgaacacgtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctgacgagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggctatgtaagtctggtgttaaagcccggggctcaaccccggttcgcatcggaaactgtgtagcttgagtgcagaagaggaaagcggtattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctagtgtttggggggtttcaataccctcagtgccgcagctaacgcaataagcactccgcctggggagtacgctcgcaagagtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccacgtcttgacatcccgctgaccgctctggagacagagcttcccttc
采用细菌DNA提取试剂盒(OMEGA，货号D3350)提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。采用细菌通用引物27F(正向引物27F，5AGAGTTTGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(反向引物1492R5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)PCR扩增16S rRNA。
采用TOYOBO公司的高保真PCR聚合酶产品KOD OneTM PCR Master Mix(货号KMM-101)进行PCR实验。反应体系如表1所示：
表1：反应体系
将菌株FHY-17的16S rRNA序列测试，菌株FHY-17的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
将菌株FHY-17的16S rRNA序列上传到同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Brevibacillus agri，与Brevibacillus agri DSM 6348同源性最高，达到99.72％。图3为菌株FHY-17的系统发育树图。
基于测序结果和生理生化试验结果，确定菌株FHY-17属于Brevibacillus agri。因此，将菌株FHY-17命名为土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023434，保藏日期2023年03月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编地址：430072。
实施例2：以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17为活性成分的菌悬液的制备过程
所述菌悬液的制备过程：
(1)固体培养：将兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17接种至斜面培养基上，在30℃下培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为7.0，琼脂18g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在30℃下培养18h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为7.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在30℃下培养18h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为7.0。
实施例3：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17降解DCE环境因子的响应面优化实验
1.响应面试验设计及DCE降解速率预测模型的获得
考察了培养液pH、培养温度和培养液盐浓度3个因素对DCE生物降解效果的影响，利用Design Expert软件进行三因素三水平的响应面实验设计，预测土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17在不同培养条件下对DCE的降解速率。
利用Design Expert软件进行三因素三水平试验设计，其中，三因素分别为X1：培养液pH、X2：培养温度和X3：培养液盐浓度；Code值：-1、0、1分别对应于培养液pH＝6、培养液pH＝7、培养液pH＝8或培养温度＝20℃、培养温度＝30℃、培养温度＝40℃或培养液盐浓度＝0％、培养液盐浓度＝0.5％、培养液盐浓度＝1.0％。
设计实验响应值及预测值如表2所示。
表2：设计实验响应值及预测值
按表2配制不同培养液pH、不同培养温度和不同培养液盐浓度的第一DCE液体选择培养基，分装于250mL血清瓶中，装液量为50mL，121℃灭菌20min。待第一DCE液体选择培养基冷却后，分别加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液接种至不同培养液pH、不同培养温度和不同培养液盐浓度的第一DCE液体选择培养基中。
本实施例中，所述第一DCE液体选择培养基为DCE 30mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
以DCE为唯一碳源，初始浓度为30mg/L，密封后置于不同培养温度的摇床振荡培养。另取装有相同培养液的血清瓶，灭菌后加入DCE但不加入FHY-17菌悬液作为空白对照。培养24h后，分析培养液中DCE残留浓度，同时测定生物量。根据测得的降解速率，利用Design Expert软件对其进行二次多元回归，拟合得到预测模型为：
其中，Y为DCE的降解速率，单位为mg/(L*h)。预测模型的相关系数R2＝0.9912，说明该预测模型所预测的降解速率与实际降解速率具有较好相关性，可用于预测不同培养条件下菌株对DCE的降解速率。
2.土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17降解DCE的最佳环境因子
利用Design Expert软件对获得的预测模型进行分析，令其一阶偏导数为零，获得土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17降解DCE速率达到最大值时的环境因子组合：培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.62％，此时预测模型所预测的降解速率为0.867mg/(L*h)。菌株FHY-17在上述培养条件下对DCE实际降解速率为0.859mg/(L*h)，与预测值较为接近。
具体实验过程如下：
取800mL的培养液pH为7.5的第一DCE液体选择培养基，加入NaCl使盐浓度达到0.62％，调节培养液的pH至7.5，分装至4个250mL的血清瓶中，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中3个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液，以初始浓度为20mg/L的DCE为唯一碳源。剩余1个血清瓶只加入20mg/L的DCE而不加入菌悬液作为空白对照。置于35℃的恒温摇床上振荡培养，24h后分析残留DCE浓度同时测定生物量，得到菌株FHY-17的降解速率。
在培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.62％的条件下，土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对DCE的实际降解速率为0.858、0.867和0.852mg/(L*h)，平均降解速率为0.859mg/(L*h)，接近于模型预测值，表明此环境因子组合为土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17降解DCE的最佳环境因子条件。
实施例4：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对不同浓度的DCE的降解性能检测
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.62％的条件下，考察土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对浓度为1～40mg/L的DCE的降解性能。实验结果表明，菌株FHY-17在120h内能完全降解1～35mg/L DCE，无法降解初始浓度大于35mg/L的DCE。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.62％的第三DCE液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入200mL的第三DCE液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中8个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液，同时分别加入5、10、15、20、25、30、35和40mg/L的DCE作为唯一碳源，另取8个血清瓶作为空白对照(只加入DCE而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，定时测定培养液中残留的DCE浓度及生物量，绘制菌株FHY-17对于不同初始浓度DCE的降解曲线和生物量变化曲线。
本实施例中，所述第三DCE液体选择培养基为DCE 1～40mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O11mg/L，微量元素，溶剂为水；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl288mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
实验结果如图4(a)和图4(b)所示，菌株FHY-17能完全降解初始浓度低于35mg/L的DCE，并且在这范围内随着浓度的增加，其生物量也显著增加，表明低浓度的DCE可以被FHY-17作为碳源利用。当初始DCE浓度大于35mg/L时，菌株FHY-17对DCE的降解作用比较缓慢，这可能是由于菌株在高浓度DCE条件下产生的一些有毒代谢产物，对菌株活性造成了严重的抑制作用。
实施例5：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对DCE的矿化率、氯离子释放率和细胞产率分析
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.62％的条件下，考察土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对浓度为1～35mg/L的DCE的矿化率、氯离子释放率和平均产率系数。实验结果表明，菌株FHY-17可以把DCE转化为CO2、H2O和细胞生物量，平均矿化率为78.45％，氯离子平均释放率为87.16％，平均细胞产率为0.1657mg cells/mg DCE。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.62％的第一DCE液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第一DCE液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中14个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液，同时分别加入5、10、15、20、25、30和35mg/L的DCE作为唯一碳源(每个浓度2个血清瓶)，另取7个血清瓶作为空白对照(只加入DCE而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，定时测定培养液中DCE浓度、氯离子浓度、细胞生物量及CO2浓度。绘制菌株FHY-17对不同DCE浓度的矿化及脱氯曲线，拟合得到平均矿化率和氯离子平均释放率，并结合细胞增殖量，绘制细胞生物量和氯离子释放量、CO2的生成量之间的关系曲线，计算平均细胞产率。
实验结果如图5所示，氯离子的脱除量与DCE的浓度呈线性关系，其拟合直线方程为y＝0.6195x，相关系数R2＝0.9937，表明菌株FHY-17每利用1mg的DCE，能产生0.6053mg的氯离子，理论上每利用1mg的DCE能产生0.7107mg的氯离子，因此氯离子的平均释放率为87.16％。
CO2的生成量与DCE的降解量之间也呈线性关系，其拟合直线方程为y＝0.7122x，相关系数R2＝0.9941，说明菌株FHY-17完全矿化1mg的DCE可以产生0.7122mg的CO2；理论上DCE完全氧化产生H2O和CO2，完全矿化1mg的DCE可以0.9078mg的CO2；因此菌株FHY-17的平均矿化率为78.45％。
菌株FHY-17在降解DCE的过程中，能利用有机碳合成自身细胞物。细胞增殖量和DCE降解量之间的线性关系为y＝0.1657x，相关系数R2＝0.9912，表明菌株FHY-17每降解1mg DCE能合成0.1657的自身细胞生物量。
实施例6：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17在厌氧及好氧条件下的性能分析
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.62％的条件下，考察土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对在不同溶解氧条件下对初始DCE浓度为20mg/L的降解率与生物量的生成。实验结果表明，菌株FHY-17在厌氧及好氧条件下均可以在48h将20mg/L DCE全部去除，且细胞生物量随氧溶解度的升高而升高，表明菌株FHY-17对DCE具备兼性好氧的降解特性。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.62％的第一DCE液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第一DCE液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中14个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液，分别加入20mg/L的DCE作为唯一碳源；另取7个血清瓶作为空白对照(只加入DCE而不加入菌悬液)。上述血清瓶密封后35℃振荡培养，其中，第一组血清瓶厌氧处理后橡胶塞密封处理，另外六组血清瓶纱布密封，并设置摇床转速分别为0，30，50，80、100和150rpm，定时测定培养液中DCE浓度和细胞生物量。
实验结果如图6(a)和6(b)所示，在不同氧气浓度下，20mg/L的DCE均可以在48h被菌株(Brevibacillus agri)FHY-17全部降解，其中随着摇床转速的提高，其降解速率也随着加快，生物量也随着升高，在摇床转速为150rpm时DCE的降解速率为1.1876mg/(L*h)，生物量为3.4916mg/(L*h),明显高于厌氧条件下的降解速率0.7423mg/(L*h)与生物量2.1430mg/(L*h)，表明菌株(Brevibacillus agri)FHY-17是一株兼性好氧的DCE降解菌株。
实施例7：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对工业常见有机污染物降解性能分析
分别以二氯甲烷、二氯丙烷、苯、氯苯、五氯苯和六氯苯这些工业中常见有机污染物作为唯一碳源，考察土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)FHY-17对这些工业中常见有机污染物的降解能力。实验结果表明，菌株FHY-17能不同程度地降解上述有机污染物，24h内能完全地降解氯苯、五氯苯和六氯苯，48h内能部分降解二氯甲烷、二氯丙烷、苯。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.62％的第一DCE液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第一DCE液体选择培养基，121℃灭菌20min。取其中6个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量为0.82mg/L的菌悬液，同时分别以初始浓度均为30mg/L的二氯甲烷、二氯丙烷、苯、氯苯、五氯苯或六氯苯作为唯一碳源，另取6个血清瓶作为空白对照(只加入DCE而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，分别于24h和72h分析液相中残留的有机物浓度，测定相应的生物量，绘制不同有机污染物的降解率与菌株FHY-17的细胞生长量。
如图7(a)所示，当培养时间为24h时，菌株FHY-17能完全降解氯苯、五氯苯和六氯苯，降解率均达到了100％，而此时菌株对于二氯甲烷、二氯丙烷、苯的降解率为27.5％、21.2％和33.4％。如图7(b)所示，当培养时间为48h时，菌株FHY-17对于二氯甲烷、二氯丙烷和苯的降解率分别达到了36.3％、49.1％、和58.7％。以上试验结果说明，菌株(Brevibacillus agri)FHY-17能降解多种常见有机污染物，对于该菌株用于工业污染废气废水有机污染物治理具有一定的实际意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (7)
1.一株兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌，其特征在于，微生物分类命名为土壤短芽孢杆菌Brevibacillus agri FHY-17，已在2023年03月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2023434；所述FHY-17的16S rRNA序列如SEQID NO.1所示。
2.一种以权利要求1所述土壤短芽孢杆菌为活性成分的菌悬液，其特征在于，所述菌悬液以兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17经固体培养、种子培养、液体培养后制成。
3.一种权利要求2所述菌悬液的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)固体培养：将兼性好氧具有二氯乙烯降解能力的土壤短芽孢杆菌FHY-17接种至斜面培养基上，在20～40℃下培养2～4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0，琼脂18～20g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯乙烯50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0。
4.一种权利要求2所述菌悬液在降解二氯乙烯中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体为：将所述菌悬液接种至0～1％盐浓度的第一DCE液体选择培养基中，以二氯乙烯为唯一碳源，在25～35℃的条件下培养，实现对二氯乙烯的降解；所述第一DCE液体选择培养基的终浓度组成为：DCE 1～35mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0～9.0；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体为：将所述菌悬液接种至0.62％盐浓度的第一DCE液体选择培养基中，以二氯乙烯为唯一碳源，在35℃的条件下培养，实现对二氯乙烯的降解；所述第一DCE液体选择培养基的终浓度组成为：DCE 1～35mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.5；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
7.一种权利要求2所述菌悬液在降解二氯甲烷、二氯丙烷、苯、氯苯、五氯苯或六氯苯中的应用。
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