CN116925978A - 具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌fhy-2及其应用 - Google Patents
具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌fhy-2及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY‑2及其应用，所述赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY‑2保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2023864，保藏日期2023年05月30日。该菌株的发现对于工业污染废气废水有机污染物治理具有一定的实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2及其应用。
背景技术
二氯甲烷(DCM)，也称为甲基氯仿或氯甲烷，无色液体，具有刺激性气味，是一种重要的化工原料，主要用于工业和实验室中的溶剂、萃取剂和制冷剂等。它可以通过工业废水、废气排放、土壤污染、垃圾填埋场等途径进入环境中，进而导致了严重的环境污染问题。DCM可以通过皮肤吸收、吸入和食入等途径进入人体，会对中枢神经系统、肝脏、肾脏、心脏和呼吸系统等造成严重损害。2021年10月生态环境部将DCM纳入了《新污染物治理行动方案(征求意见稿)》，因此，DCM去除技术的开发迫在眉睫。
生物净化技术因具有去除效率高、处理成本低、二次污染小等优势，被广泛应用于污染物的降解和净化。而生物治理DCM的关键是获得具有高效降解DCM能力的菌株。但由于DCM极差的溶解度以及碳-氯原子之间的高键能，仅有少量的DCM降解细菌被分离出，主要包括假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillaceae)、梭杆菌(Fusobacterium)和潘多拉菌(Pandoraea)等，且降解效率还有待进一步提高。目前，从环境中分离筛选高效DCM降解菌仍然是消除环境中氯代有机污染物的重要方法之一。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供了一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌，微生物分类命名为赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2，已在2023年05月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，邮政编码为430072；保藏编号为CCTCC NO:M2023864；所述FHY-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供了一株以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2为活性成分的菌悬液及菌悬液的制备方法。
所述菌悬液以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2经固体培养、种子培养、液体培养后制成。
所述菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
(1)固体培养：将具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2接种至斜面培养基上，在20～40℃下培养2～4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0，琼脂18～20g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO41500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0。
第三方面，本发明提供了一种以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2为活性成分的菌悬液在降解二氯甲烷中的应用及其具体方法。
具体方法为：将所述菌悬液接种至0～1％盐浓度的DCM液体选择培养基中，以二氯甲烷为唯一碳源，在25～35℃的条件下培养，实现对二氯甲烷的降解；所述DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 1～50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0～9.0；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
进一步地，具体方法为：将所述菌悬液接种至0.91％盐浓度的DCM液体选择培养基中，以二氯甲烷为唯一碳源，在35℃的条件下培养，实现对二氯甲烷的降解；所述DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 1～50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.5；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
第四方面，本发明还提供了一种以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2为活性成分的菌悬液在降解苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚中的应用。
本发明的有益效果是：菌株FHY-2降解浓度为0～50mg/L的DCM，降解产物为CO2、H2O和细胞生物量，平均矿化率88.91％，氯离子平均释放率为90.73％，平均细胞产率为0.1379mg cells/mg DCM。该降解菌的发现对化学合成、制药行业废水废气中DCM的高效净化具有重要意义。该菌株还可降解其他同类工业常见有机污染物，比如苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚等。菌株FHY-2取自废气处理单元，对于氯代有机物，尤其是DCM具有较好地降解效果，可以较为完全地把DCM转化为CO2、H2O、细胞生物量等无害物质；同时，该菌株也能不同程度地降解苯、氯苯等工业常见的污染物，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为赤霉链霉菌FHY-2的平板图；
图2为赤霉链霉菌FHY-2的扫描电镜图；
图3为赤霉链霉菌FHY-2的系统发育树图；
图4为赤霉链霉菌FHY-2在不同浓度的DCM下的DCM浓度、细胞生物量随降解时间的变化图，其中，图4(a)为赤霉链霉菌FHY-2在不同浓度的DCM下的DCM浓度随降解时间的变化图，图4(b)为赤霉链霉菌FHY-2在不同浓度的DCM下的细胞生物量随降解时间的变化图；
图5为赤霉链霉菌FHY-2在降解不同浓度DCM下CO2生成量、Cl-释放量及细胞生物量的变化图；
图6为赤霉链霉菌FHY-2在不同转速下的DCE浓度、细胞生物量随降解时间的变化图，其中，图6(a)为赤霉链霉菌FHY-2在不同转速下的DCE浓度随降解时间的变化图，图6(b)为赤霉链霉菌FHY-2在不同转速下的细胞生物量随降解时间的变化图；
图7为赤霉链霉菌FHY-2对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图，其中，图7(a)为24h时对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图，图7(b)为48h时对工业常见有机污染物的降解率和细胞生长量的实验图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加明白清楚，结合附图和实施例，对本发明进一步的详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均在本发明保护范围。
下面未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照厂家所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
本发明提供了一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌，微生物分类命名为Streptomyces ardesiacus FHY-2，已在2023年05月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2023864；所述FHY-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
赤霉链霉菌是一种常见的杆菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用赤霉链霉菌降解DCM的报道。该降解菌的发现对于工业废水废气中DCM等氯代有机污染物的高效净化具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2的分离、纯化及鉴定
1.赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2的分离及纯化
赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2是从浙江台州某橡胶厂废气处理装置的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌，具体步骤如下：
(1)采样：从浙江台州某橡胶厂废气处理装置的活性污泥中别多点采样，作为筛选具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2的原材料；
(2)菌株分离：取适量废气处理装置中活性污泥，蒸馏水冲洗5次后，空曝24h以去除残留有机物；配置第一DCM液体选择培养基对活性污泥进行定向驯化，往第一DCM液体选择培养基加入体积分数为5％的驯化污泥，于30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养，3d后以体积分数为10％的量转接到新的第一DCM液体选择培养基振荡培养，直到单菌落的出现，挑取单菌落接入DCM固体选择培养基，获取生长快、菌落规则和性状稳定的单菌落，记为菌株FHY-2。
本实施例中，无机盐培养基的配制方法如下：在1000mL蒸馏水中加入0.376gKH2PO4、0.456g K2HPO4、0.48g(NH4)2SO4、0.68g NaNO3、0.25g Mg(NO3)2、0.011g CaCl2·2H2O、微量元素(0.06g MnCl2·H2O、0.088g ZnCl2、0.01g KI、0.1g NaMoO4·2H2O、0.05gH3BO3)，pH 7.0～7.2，分装于250mL的密封血清瓶，121℃灭菌20min。待无机盐培养基冷却后，加入50mg/L的DCM作为第一DCM液体选择培养基。
所述第一DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0。所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
所述DCM固体选择培养基的终浓度组成为：DCM 50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，琼脂20g/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0。
2.菌株FHY-2的鉴定
a、菌株FHY-2的生理生化特征
对所获得的菌株FHY-2进行形态观察和生理生化鉴定，菌落呈黄色，边缘整齐，光滑湿润；扫描电镜下观察该菌体的形态为分支状，无鞭毛，可分生孢子，革兰氏染色阳性，氧化酶阳性，淀粉水解和吲哚试验阳性，可利用蔗糖、乳糖和麦芽糖。菌株FHY-2如图1所示；扫描电镜下观察该菌体的形态为分支状，如图2所示。
b、菌株FHY-2的16S rDNA序列分析
通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株FHY-2为Streptomycesardesiacus。测序结果为：
cagtcccaccttcgacagctccctcccacaaggggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactttcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcgactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagaccggctttttgagattcgctccaccttgcggtatcgcagctcattgtaccggccattgtagcacgtgtgcagcccaagacataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccggcggtctcccgtgagtccccaacctccgaagagttgctggcaacacgggacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtacaccgaccacaaggggggcaccatctctgatgctttccggtgtatgtcaagccttggtaaggttcttcgcgttgcgtcgaattaagccacatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcacttaatgcgttagctgcggcacggacaacgtggaatgttgcccacacctagtgcccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtatcggcccagagatccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccgatctcccctaccgaactctagcctgcccgtatcgactgcagacccggggttaagccccgggctttcacaaccgacgcgacaagccgcctacgagctctttacgcccaataattccggacaacgcttgcgccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcactctcgcttcttccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtgagccattacctcaccaacaagctgataggccgcgggctcatcctgcaccgccggagctttcgacccgccgagatgcctcggcaggtcagtatccggtattagaccccgtttc
采用细菌DNA提取试剂盒(OMEGA，货号D3350)提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。采用细菌通用引物27F(正向引物27F，5AGAGTTTGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(反向引物1492R5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)对纯化的DNA进行PCR扩增。
采用TOYOBO公司的高保真PCR聚合酶产品KOD OneTM PCR Master Mix(货号KMM-101)进行PCR实验。反应体系如表1所示：
表1：反应体系
将菌株FHY-2的16S rDNA序列进行测试，菌株FHY-2的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。
将菌株FHY-2的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号NR_112454.1；同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Streptomycesardesiacus，与Streptomyces ardesiacus strain NBRC 15402同源性最高，达到100％。图3为菌株FHY-2的系统发育树图。
基于测序结果和生理生化试验结果，确定菌株FHY-2属于Streptomycesardesiacus。因此，将菌株FHY-2命名为Streptomyces ardesiacus FHY-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023864，保藏日期2023年05月30日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编地址：430072。
实施例2：以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2为活性成分的菌悬液的制备过程
所述菌悬液以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2经固体培养、种子培养、液体培养后制成，包括以下具体步骤：
(1)固体培养：将具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2接种至斜面培养基上，在30℃下培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为7.0，琼脂18g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在30℃下培养18h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为7.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在30℃下培养18h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为7.0。
实施例3：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2降解DCM环境因子的响应面优化实验
1.响应面试验设计及DCM降解速率预测模型的获得
考察了培养液pH、培养温度和培养液盐浓度3个因素对DCM生物降解效果的影响，利用Design Expert软件进行三因素三水平的响应面实验设计，预测赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2在不同培养条件下对DCM的降解速率。
利用Design Expert软件进行三因素三水平试验设计，其中，三因素分别为X1：培养液pH、X2：培养温度和X3：培养液盐浓度；Code值：-1、0、1分别对应于培养液pH＝6.0、培养液pH＝7.0、培养液pH＝8.0或培养温度＝20℃、培养温度＝30℃、培养温度＝40℃或培养液盐浓度＝0％、培养液盐浓度＝0.5％、培养液盐浓度＝1.0％。
设计实验响应值及预测值如表2所示。
表2：设计实验响应值及预测值
按表2配制不同培养液pH、不同培养温度和不同培养液盐浓度的第二DCM液体选择培养基，分装于250mL血清瓶中，装液量为50mL，121℃灭菌20min。待第二DCM液体选择培养基冷却后，分别加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液接种至不同培养液pH、不同培养温度和不同培养液盐浓度的第二DCM液体选择培养基中。
本实施例中，所述第二DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 30mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
以DCM为唯一碳源，初始浓度为30mg/L，密封后置于不同培养温度的摇床振荡培养。另取装有相同培养液的血清瓶，灭菌后加入DCM但不加入FHY-2菌悬液作为空白对照。培养24h后，分析培养液中DCM残留浓度，同时测定生物量。根据测得的降解速率，利用DesignExpert软件对其进行二次多元回归，拟合得到的预测模型为：
Y＝-79.847+29.338*X1+19.495*X2+33.176*X3-5.486*X1*X1
-2.782*X1*X2-2.294*X1*X3-2.407*X2*X2+0.927*X2*X3；
-3.850*X3*X3
其中，Y为DCM的降解速率，单位为mg/(L*h)。预测模型的相关系数R2＝0.9912，说明该预测模型所预测的降解速率与实际降解速率具有很好的相关性，可用于预测不同培养条件下菌株对DCM的降解速率。
2.赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2降解DCM的最佳环境因子组合
利用Design Expert软件对获得的预测模型进行分析，令其一阶偏导数为零，获得赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2降解DCM速率达到最大值时的环境因子组合：培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.91％，此时预测模型所预测的降解速率为1.405mg/(L*h)。菌株FHY-2在上述培养条件下对DCM实际降解速率为1.389mg/(L*h)，与预测值较为接近。
具体实验过程如下：
取800mL的培养液pH为7.5的第二DCM液体选择培养基，加入NaCl使培养液盐浓度达到0.91％，调节培养液的pH至7.5，分装至4个250mL的血清瓶中，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中3个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液，以初始浓度为30mg/L的DCM为唯一碳源。剩余1个血清瓶只加入30mg/L的DCM而不加入菌悬液作为空白对照。分别置于35℃的恒温摇床上振荡培养24h后，分析残留DCM浓度同时测定生物量，得到菌株FHY-2的降解速率。
在培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.91％的条件下，赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对DCM的实际降解速率为1.308、1.386和1.473mg/(L*h)，平均降解速率为1.389mg/(L*h)，接近于模型预测值，表明此环境因子组合为赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2降解DCM的最佳环境因子条件。
实施例4：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对不同浓度的DCM的降解性能检测
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.91％的条件下，考察赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对浓度0～200mg/L的DCM的降解性能。实验结果表明，菌株FHY-2在48h内能完全降解0～50mg/L的DCM，无法完全降解初始浓度大于50mg/L的DCM。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.91％的第三DCM液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第三DCM液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中6个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液，分别以10、30、50、100、150或200mg/L的DCM作为唯一碳源，另取6个血清瓶作为空白对照(只加入DCM而不加入菌悬液)。血清瓶密封后，在35℃条件下振荡培养，定时测定培养液中残留的DCM浓度及生物量，绘制菌株FHY-2对于不同初始浓度DCM的降解曲线和生物量变化曲线。
本实施例中，所述第三DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 0～200mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O 11mg/L，微量元素，溶剂为水；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
实验结果如图4(a)和图4(b)所示，菌株FHY-2在48h内能完全降解初始浓度不高于50mg/L的DCM，并且在这范围内随着浓度的增加，其生物量也显著增加，表明低浓度的DCM可以被FHY-2作为碳源利用。当初始DCM浓度大于50mg/L时，菌株FHY-2在48h内仅能对DCM有部分降解作用，且降解速率缓慢，这可能是由于高浓度DCM条件下对菌株活性造成了一定的抑制作用，但是DCM仍在不断被降解，说明菌株FHY-2具有较高的DCM高负荷冲击性能。
实施例5：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对DCM的矿化率、氯离子释放率和细胞产率分析
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.91％的条件下，考察赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对浓度为0～50mg/L的DCM的矿化率、氯离子释放率和细胞产率。实验结果表明，菌株FHY-2可以把DCM转化为CO2、H2O和细胞生物量，平均矿化率为88.91％，氯离子平均释放率为90.73％，平均细胞产率为0.1379mg cells/mg DCM。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.91％的第三DCM液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第三DCM液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中12个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液，分别以5、10、20、30、40或50mg/L的DCM作为唯一碳源(每个浓度2个血清瓶)，另取6个血清瓶作为空白对照(只加入DCM而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，定时测定培养液中DCM浓度、氯离子浓度、细胞生物量及CO2浓度。绘制菌株FHY-2对不同DCM浓度的矿化及脱氯曲线，拟合得到平均矿化率和氯离子平均释放率，并结合细胞增殖量，绘制细胞生物量和氯离子释放量、CO2的生成量之间的关系曲线，计算平均细胞产率。
实验结果如图5所示，氯离子的脱除量与DCM的浓度呈线性关系，其拟合直线方程为y＝0.7579x，相关系数R2＝0.9834，表明菌株FHY-2每利用1mg的DCM，能产生0.7579mg的氯离子，理论上每利用1mg的DCM能产生0.8353mg的氯离子，因此氯离子平均释放率为90.73％。
CO2的生成量与DCM的降解量之间也呈线性关系，其拟合直线方程为y＝0.4602x，相关系数R2＝0.9961，说明菌株FHY-2完全矿化1mg的DCM可以产生0.4602mg的CO2；理论上DCM完全氧化产生H2O和CO2，完全矿化1mg的DCM可以0.5176mg的CO2；因此菌株FHY-2的平均矿化率为88.91％。
菌株FHY-2在降解DCM的过程中，能利用有机碳合成自身细胞物。细胞增殖量和DCM降解量之间的线性关系为y＝0.1379x，相关系数R2＝0.9901，表明菌株FHY-2每降解1mgDCM能合成0.1379mg的自身细胞生物量。
实施例6：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2在厌氧及好氧条件下的性能分析
在最佳环境因子条件下，即培养温度为35℃、培养液pH为7.5以及培养液盐浓度为0.91％的条件下，考察赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2在不同溶解氧条件下对初始DCM浓度为50mg/L的降解率与生物量的生成。实验结果表明，菌株FHY-2在摇床转速高于120rpm条件下可以在24h将50mg/L DCM全部去除，且细胞生物量随氧溶解度的升高而升高，表明菌株Streptomyces ardesiacus FHY-2对DCM具备兼性厌氧的降解特性。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.91％的第三DCM液体选择培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的第三DCM液体选择培养基，121℃灭菌20min。待培养液冷却后，取其中14个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液，均以50mg/L的DCM作为唯一碳源(每个浓度2个血清瓶)，另取7个血清瓶作为空白对照(只加入DCM而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，其中，第一组血清瓶厌氧处理后橡胶塞密封处理，另外六组血清瓶纱布密封，并设置摇床转速分别为0、30、50、80、100、120或150rpm，定时测定培养液中DCM浓度和细胞生物量。
实验结果如图6(a)和图6(b)所示，在摇床转速高于120rpm条件下，50mg/L的DCM可以在24h被菌株Streptomyces ardesiacus FHY-2全部降解，其中随着摇床转速的提高，其降解速率也随着加快，生物量也随着升高，在摇床转速为150rpm时DCM的降解速率为2.3752mg/(L*h)，24h时其生物量为4.85mg/(L*h)，明显高于厌氧条件下的降解速率1.1791mg/(L*h)与生物量2.99mg/(L*h)，表明菌株Streptomyces ardesiacus FHY-2是一株兼性厌氧的DCM降解菌株。
实施例7：赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对工业常见有机污染物降解性能分析
分别以苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚这些工业中常见有机污染物作为唯一碳源，考察赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2对这些工业中常见有机污染物的降解能力。实验结果表明，菌株FHY-2能不同程度地降解上述有机污染物，24h内能完全地降解氯苯、五氯苯、六氯苯和苯酚，48h内能部分降解苯和甲苯。
具体实验过程如下：
配置培养液pH为7.5、培养液盐浓度为0.91％的无机盐培养基，分别向250mL的血清瓶中装入50mL的无机盐培养基，121℃灭菌20min。取其中6个血清瓶加入实施例2方法制备的初始生物量达到1.5mg/L的菌悬液，分别加入初始浓度为20mg/L的苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚作为唯一碳源，另取6个血清瓶作为空白对照(只加入苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚而不加入菌悬液)。血清瓶除氧密封后，在35℃条件下振荡培养，分别于24h和48h分析液相中残留的有机物浓度，测定相应的生物量，绘制不同有机污染物的降解率与菌株FHY-2的细胞生长量。
如图7(a)所示，当培养时间为24h时，菌株FHY-2能完全降解氯苯、五氯苯、六氯苯和苯酚，降解率均达到了100％，而此时菌株对于苯和甲苯的降解率为4.12mg/L和3.58mg/L。如图7(b)所示，当培养时间为48h时，菌株FHY-2对于苯和甲苯的降解率分别达到了13.02mg/L和7.26mg/L。以上试验结果说明，赤霉链霉菌(Streptomyces ardesiacus)FHY-2能降解多种常见有机污染物，对于该菌株用于工业污染废气废水有机污染物治理具有一定的实际意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (7)
1.一株具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌，其特征在于，微生物分类命名为赤霉链霉菌Streptomyces ardesiacus FHY-2，已在2023年05月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2023864；所述FHY-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种以权利要求1所述赤霉链霉菌为活性成分的菌悬液，其特征在于，所述菌悬液以具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2经固体培养、种子培养、液体培养后制成。
3.一种权利要求2所述菌悬液的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)固体培养：将具有二氯甲烷降解能力的赤霉链霉菌FHY-2接种至斜面培养基上，在20～40℃下培养2～4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0，琼脂18～20g/L；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：NaCl 10g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0；
(3)液体培养：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在20～40℃下培养12～24h，获得发酵培养液即为菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：K2HPO4 1500mg/L，KH2PO4 500mg/L，NaCl 1000mg/L，二氯甲烷50mg/L，MgSO4·7H2O 200mg/L，溶剂为水，pH值为6.0～8.0。
4.一种权利要求2所述菌悬液在降解二氯甲烷中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体为：将所述菌悬液接种至0～1％盐浓度的DCM液体选择培养基中，以二氯甲烷为唯一碳源，在25～35℃的条件下培养，实现对二氯甲烷的降解；所述DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 1～50mg/L，KH2PO4376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.0～9.0；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体为：将所述菌悬液接种至0.91％盐浓度的DCM液体选择培养基中，以二氯甲烷为唯一碳源，在35℃的条件下培养，实现对二氯甲烷的降解；所述DCM液体选择培养基的终浓度组成为：DCM 1～50mg/L，KH2PO4 376mg/L，K2HPO4 456mg/L，(NH4)2SO4 480mg/L，NaNO3 680mg/L，Mg(NO3)2 250mg/L，CaCl2·2H2O11mg/L，微量元素，溶剂为水，pH值为7.5；所述微量元素的终浓度组成为：MnCl2·H2O 60mg/L，ZnCl2 88mg/L，KI 10mg/L，NaMoO4·2H2O 100mg/L，H3BO3 50mg/L，溶剂为水。
7.一种权利要求2所述菌悬液在降解苯、甲苯、氯苯、五氯苯、六氯苯或苯酚中的应用。
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