CN109207400B - 一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法 - Google Patents

一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法 Download PDF

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Abstract

一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法，涉及一种降解邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法。是要解决现有的邻苯二甲酸酯降解菌降解多种PAEs的效果差的问题。该复合菌剂包括施氏假单胞菌DNE‑S1和施氏假单胞菌DNE‑S2。降解方法：将施氏假单胞菌DNE‑S1和施氏假单胞菌DNE‑S2接种到含有多种PAEs的介质中，在温度为20‑40℃、100‑200rpm条件下降解1‑7天。本发明的复配菌剂能够显著提高黑土中各PAEs的清除速率，且能够很好地适应土壤环境，在PAEs污染黑土修复中具有良好的潜力。本发明用于降解黑土中邻苯二甲酸酯。

Description

一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法
技术领域
本发明涉及一种降解邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法。
背景技术
许多研究表明，邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)常作为塑料制品的增塑剂广泛应用于生活实践与工业生产中。PAEs是一种环境激素类物质，自然条件下难以降解，因此会长期残留在环境之中，即使在低浓度下也能影响生态环境。PAEs只通过氢键和范德华力与基材相连。因此，随着时间的推移，PAEs会从塑料产品迁移到环境中。目前，PAEs已被美国环境保护局和中国环境监测总站列为优先控制污染物之一。由于其是一类疏水性有机污染物，具有较高的辛醇-水分配系数，容易吸附于沉积物和土壤颗粒物上。已有的调查数据显示，目前我国农业土壤中各种PAEs的含量一般在几至几十毫克每千克，土壤中PAEs含量超标严重，因此PAEs污染土壤修复问题函待解决。
自然环境中PAEs的水解和光解速率较慢，生物降解成为其从环境中去除的主要途径。近年来，细菌降解PAEs已经得到广泛的研究，大量高效降解的菌株已经从各类环境中分离得到。然而环境中的PAEs往往是多种的，现有的邻苯二甲酸酯降解菌难于降解环境中的多种PAEs。
发明内容
本发明是要解决现有的邻苯二甲酸酯降解菌降解多种PAEs的效果差的问题，提供一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法。
本发明高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S1和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S2。
其中施氏假单胞菌DNE-S1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.16034。施氏假单胞菌DNE-S2保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.16035。
进一步的，施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为(0.5～2):1。
优选的，施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为2:1。
所述施氏假单胞菌DNE-S1在MSM培养基上培养2天的菌落形态较大，直径约2-3mm，呈圆形，微凸起，乳白色，不透明。扫描电镜下为杆状。
所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S1的16S rDNA基因序列如SEQID NO：1所示。通过16S rDNA序列比对分析，结果表明该菌株与Pseudomonas stutzerisp.ATCC 175889相似性最高，同源率高达98％。
所述施氏假单胞菌DNE-S2在MSM培养基上培养2天的菌落较小，直径约1-2mm，呈圆形，微凸起，淡黄色，不透明。扫描电镜下为杆状。
所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S2的16S rDNA基因序列如SEQID NO：2所示。通过16S rDNA序列比对分析，结果表明该菌株与Pseudomonas japonicasp.NBRC 103040相似性最高，同源率高达98％。
通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定DNE-S1和DNE-S2属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
利用上述复合菌剂降解邻苯二甲酸酯的降解方法，包括以下步骤：
将施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2接种到含有多种PAEs的介质中，在温度为20-40℃、100-200rpm条件下降解1-7天。
进一步的，将DNE-S1和DNE-S2制备成菌悬液接种到含多种PAEs的介质中。所述菌悬液的制备方法为将纯化后的DNE-S1或DNE-S2接入无机盐培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌2-4次后重悬调节OD600nm＝0.8-1.2作为菌悬液。
进一步的，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值相同，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的体积比为2:1。
进一步的，所述多种PAEs为DMP、DEP、DBP和DEHP中的任意两种或两种以上的混合物。
进一步的，所述介质为黑土或无机盐培养基。
优选地，当介质为无机盐培养基时，多种PAEs的浓度均为200mg/L时，100mL的无机盐培养基中分别加入1mL的OD600nm＝1.0含有DNE-S1和DNE-S2的复配菌剂。
优选地，当介质为黑土时，多种PAEs的浓度均为100mg/kg时，200g的黑土中加入10mL的OD600nm＝1.0含有DNE-S1和DNE-S2的复配菌剂。
本发明的有益效果：
环境中PAEs污染往往是多种PAEs共同作用所导致。单一菌株在降解复合PAEs时有一定的局限性。本发明从城市垃圾填埋场的土壤中分离出两株对多种PAEs具有高效降解能力的施氏假单胞菌DNE-S1和DNE-S2，并研究其在多种PAEs污染黑土中的修复效果，结果表明二者复配后可有效降低黑土中的PAEs污染，是理想的黑土环境污染修复物，具有十分广泛的应用前景。
施氏假单胞菌DNE-S1、施氏假单胞菌DNE-S2均能降解多种PAEs，特别是DNE-S1对苯环链接烷基链长度较短的PAEs，如DMP和DEP，24h的降解率分别达到99.60％和98.80％；而针对烷基链长度较长的PAEs，如DBP和DEHP，24h的降解率分别达到11.93％和10.82％。DNE-S2对于DMP和DEP，24h的降解率低于同时期DNE-S1的降解率，分别达到80.00％和52.61％；而对烷基链长度较长PAEs，如DBP和DEHP，24h的降解率高于同时期DNE-S1的降解率，分别达到25.38％和20.58％。
本发明将施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2按照2:1的比例复配，得到复合菌剂，复合菌剂对于DBP的24h降解效率能够达到60.00％，对于含有较长烷基侧链的DEHP的24h降解效率可达63.51％，对于DMP的24h降解效率可达95.26％，对于DEP的24h降解效率可达97.79％。可见，本发明的复配菌剂能够显著提高黑土中长烷基侧链PAEs的清除速率，且能够很好地适应土壤环境，在PAEs污染黑土修复中具有良好的潜力。
本发明复合菌剂中的施氏假单胞菌DNE-S1，属于施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.16034。施氏假单胞菌DNE-S2，属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.16035。
附图说明
图1为菌株DNE-S1在无机盐培养基上培养3天的生长形态特征。
图2为菌株DNE-S2在无机盐培养基上培养3天的生长形态特征。
图3为菌株DNE-S1的扫描电镜图片。
图4为菌株DNE-S2的扫描电镜图片。
图5为菌株DNE-S1的16S rDNA的系统发育树。
图6为菌株DNE-S2的16S rDNA的系统发育树。
图7为24h菌株DNE-S1和菌株DNE-S2对四种混合PAEs的降解效果。
图8为24h复配菌剂对四种混合PAEs的降解效果。
图9为未接菌的污染黑土处理中各PAEs的降解效果。
图10为未接菌污染黑土中PAEs的降解效果。
图11为复配菌剂对污染黑土处理中各PAEs的降解效果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S1和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S2；
其中施氏假单胞菌DNE-S1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：16034。施氏假单胞菌DNE-S2保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCC NO：16035。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为(0.5～2):1。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为2:1。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式利用高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂降解邻苯二甲酸酯的降解方法，包括以下步骤：
将施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2接种到含有多种PAEs的介质中，在温度为20-40℃、100-200rpm条件下降解1-7天。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：将DNE-S1和DNE-S2制备成菌悬液接种到含多种PAEs的介质中。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：所述菌悬液的制备方法为将纯化后的DNE-S1或DNE-S2接入无机盐培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌2-4次后重悬调节OD600nm＝0.8-1.2作为菌悬液。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值相同，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的体积比为(0.5～2):1。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是：DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值相同，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的体积比为2:1。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四至八之一不同的是：所述多种PAEs为DMP、DEP、DBP和DEHP中的任意两种或两种以上的混合物。其它与具体实施方式四至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式四至八之一不同的是：所述介质为黑土或无机盐培养基。其它与具体实施方式四至八之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例所用的无机盐培养基配方(MSM)：K2HPO4·3H2O：1g/L，MgSO4·7H2O：0.8g/L，NaCl：1g/L，NH4NO3：0.5g/L，FeCl3·6H2O：0.075g/L，CaCl2·2H2O：0.1g/L。最终pH为8.0。固体平板则添加1.5％(w/v)琼脂粉。
实施例1：菌株的分离与鉴定：
采集肇东市垃圾填埋场的土壤，称取5g土壤样品于含有50mL无菌水的150mL三角瓶中，30℃、125rpm震荡8h。取5mL土壤悬浊液加入200mL PAEs(分别含有50mg/L DMP、DEP、DBP、DEHP)的上述无机盐培养基中。经30℃、125rpm培养3天后，每次取1mL的培养液进行连续富集、驯化、转接10次，并逐渐提高培养基中的PAEs含量至800mg/L。将驯化后的菌液稀释10-3～10-5涂布在无机盐固体平板上。平板倒置，于30℃培养2天。平板长出菌落后，挑取单菌落进行划线纯化后，获得两株形态不同的细菌，编号DNE-S1、DNE-S2。分别将两株菌DNE-S1、DNE-S2，涂布于含有800mg/L的MSM固体平板上30℃倒置培养2天观察其菌落形态(图1、图2)。由图1可知在MSM固体培养基上，DNE-S1菌落形态较大、直径约2-3mm、呈圆形、微凸起、乳白色，不透明。由图2可知在MSM固体培养基上DNE-S2菌落形态较小、直径约1-2mm、呈圆形、凸起、淡黄色，不透明。
扫描电镜观察鉴定：将纯化后的DNE-S1、DNE-S2接入含有800mg/L的MSM培养基中。于30℃、125rpm条件下活化培养24h，抽取5mL菌液经8000rpm离心3min，弃上清液，用等体积的PBS缓冲液洗菌3次。在所得菌体沉淀中加入0.75mL 2.5％戊二醛溶液，置于4℃冰箱中静置一夜。8000rpm离心3min后，弃上清。用0.75mL pH7.2的PBS缓冲液洗菌3次。之后菌体分别在浓度50％、70％和90％的乙醇中进行脱水处理，每次10-15min，8000rpm离心3min弃上清。随后菌体在100％的乙醇中脱水3次，每次15min，8000rpm离心3min弃上清。之后，分别利用100％乙醇：叔丁醇＝1:1的溶液以及纯叔丁醇溶液对脱水后的菌体进行置换，每次15min。将处理过的菌体在-20℃冰箱中冰冻30min后，置于冷冻干燥机中干燥4h。最后将干燥后的样品制片观察。图3可见DNE-S1菌体为杆状，直径10-30μm。图4可见DNE-S2菌体为杆状，直径10-30μm。
菌株的16S rDNA分子鉴定：利用细菌16S rDNA通用引物27F、1492R对菌株DNE-S1、DNE-S2进行PCR扩增。PCR产物经测序(上海生工完成测序)后，DNE-S1的16S rDNA序列如SEQID NO：1所示。将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析。如图5所示，DNE-S1与Pseudomonas sp.B-1(KJ820781.1)进化距离最短，同源性最高。DNE-S2的16S rDNA序列如SEQ ID NO：2所示。将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析。如图6所示，DNE-S2与Pseudomonas sp.NBRC 103040(NR114192.1)进化距离最短，同源性最高。
通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定DNE-S1属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，DNE-S2属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
实施例2：菌株DNE-S1、DNE-S2对多种PAEs的降解效果试验：
(一)菌悬液的制备：
分别将纯化后的菌株DNE-S1、DNE-S2接入无机盐培养基中培养至对数生长期。经5000rpm离心5min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD600nm＝1.0作为菌悬液。
(二)向含有800mg/L浓度PAEs(分别含200mg/L的DMP，DEP，DBP，DEHP)的25mL培养液中分别接种上述菌悬液250μL，以不接菌的无机盐培养基作为对照组，并调节pH为8.0，每组3个重复。用GC-MS测定样品中多种PAEs的降解情况。
(三)PAEs检测：
将摇瓶培养后的25mL样品转移至100mL比色管中，加入等体积正己烷涡旋萃取1min，过无水Na2SO4、脱脂棉干燥，用正己烷稀释100倍待测。
色谱条件：采用岛津公司QP2010Plus型GC-MS串联质谱仪。色谱柱型号为安捷伦HP-5柱子(0.25μm×0.25mm×30m)，进样温度为250℃，离子源(E1)温度为220℃，采用不分流进样1μL，载气为高纯度氦气。升温程序为：初始温度：80℃，保持2min，20℃/min梯度升温10min至280℃，保持5min。
质量控制：采用外标法和四点校正标准物质制作标准曲线。4种PAEs混标的基质加标平均回收率为93.0％-101.42％，相对偏差低于7.0％。
由图7可知，DNE-S1、DNE-S2对于四种PAEs(DMP、DEP、DBP和DEHP)都具有降解能力。特别是DNE-S1、DNE-S2均对苯环链接烷基链长度较短PAEs(DMP、DEP)有较好的降解效果。其中，DNE-S1对于烷基链长度较短PAEs的降解效果要优于DNE-S2。DNE-S1对DMP、DEP的降解效率在24h可达到99.60％和98.80％，远高于DNE-S2对DMP、DEP的降解效率在24h所达到的80.00％和52.61％。对于较难降解的长链PAEs(DBP、DEHP)，DNE-S2的降解能力要略好于DNE-S1。DNE-S2对DBP、DEHP的降解效率在24h可达到25.38％和20.58％，略高于DNE-S1对DBP、DEHP在24h所达到的11.93％和10.82％。这说明DNE-S1、DNE-S2更利于短链PAEs，对长链PAEs降解效果相对较差。DNE-S1对于短链PAEs的降解能力要优于DNE-S2。对于长链PAEs，DNE-S2的降解效果要略好于DNE-S1。故本发明利用DNE-S1与DNE-S2复配，修复复合PAEs污染黑土。
实施例3：不同配比复配菌剂对多种PAEs的降解效果试验：
(一)菌悬液的制备：同上所述
(二)不同比例菌剂复配：
将制备好的菌悬液按照DNE-S1：DNE-S2的体积比为1:1，2:1，1:2的比例制作成三种不同比例的复配菌剂，命名为菌剂1、菌剂2和菌剂3。DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值均为OD600nm＝1.0。
(三)向含有800mg/L浓度PAEs(分别含200mg/L的DMP，DEP，DBP，DEHP)的25mL培养液中分别接种上述复配菌剂250μL，以不接菌的MSM培养基作为对照组，并调节pH为8.0，每组3个重复。用GC-MS测定样品中多种PAEs的降解情况。
(四)PAEs检测：
将摇瓶培养24h后的25mL样品转移至100mL比色管中，加入等体积正己烷涡旋萃取1min，过无水Na2SO4、脱脂棉干燥，用正己烷稀释100倍待测。
色谱条件：采用岛津公司QP2010Plus型GC-MS串联质谱仪。色谱柱型号为安捷伦HP-5柱子(0.25μm×0.25mm×30m)，进样温度为250℃，离子源(E1)温度为220℃，采用不分流进样1μL，载气为高纯度氦气。升温程序为：初始温度：80℃，保持2min，20℃/min梯度升温10min至280℃，保持5min。
质量控制：采用外标法和四点校正标准物质制作标准曲线。4种PAEs混标的基质加标平均回收率为95.0％～105.5％，相对偏差低于5.5％。
由图8可知，三种复配菌剂均能提升较长烷基支链PAEs降解效率。其中菌剂2降解DBP的效率最高，24h降解效率能够达到60.00％，远高于菌剂1和菌剂3同时期所能达到的38.57％和25.71％。而且对于含有较长烷基侧链的DEHP菌剂1和菌剂2降解效率也较好，24h分别可达69.47％和63.51％。对于DMP，三种比例的复配菌剂均对其有较好的降解效果，24h降解率均超过90％。其中菌剂2和菌剂3的降解效果稍优于菌剂1，在24h时DMP降解率分别能够达到95.26％和97.79％。但菌剂3对于DEP的降解效果明显弱于菌剂1和菌剂2。结果显示，菌剂2在24h时DEP的降解率高达97.79％，菌剂1在24h DEP降解率为92.10％，而同时间菌剂3对DEP的降解率仅能达到79.30％。
由图9可知，在800mg/L PAEs(分别含200mg/L的DMP，DEP，DBP，DEHP)的MSM培养基中，24h菌剂2的总残留量最低，达到168mg/L。可见，菌剂2对于复合PAEs污染的降解效果最好。故选择DNE-S1:DNE-S2比例为2:1的菌剂2制作成复配菌剂。
实施例4：复配菌剂对多种PAEs污染黑土的修复效果
(一)供试土壤准备：
试验所用黑土取自哈尔滨市东北农业大学试验田土壤，风干后过2mm筛，pH为7.78，含水率11.39％。
向黑土中添加4种PAEs(包含DMP、DEP、DBP、DEHP)，使土壤中4种PAEs的含量均达到100mg/kg。将土壤调整至田间持水量(约30％)，置于30℃培养箱中避光老化7天。
(二)试验处理：
分别称取黑土样品各200g，置于250mL小烧杯中避光保存。向供试土壤中施加经实施例3优选的复配菌剂，接菌量为5％(v/w)，充分搅拌混匀。另外，将不接菌的黑土作为空白对照组。将土壤调至田间持水量(约30％)，30℃培养箱中避光培养。分别于0、1、3、5、7天定期对土壤样品进行萃取，后经GC-MS检测土壤中各种PAEs的残留量。
(三)土壤萃取：
称取5g土壤样品于50mL离心管中，加入10mL二氯甲烷超声萃取10min，经5000rpm离心5min后收集上清液。土壤沉淀中再加入10mL二氯甲烷采用相同的方法超声萃取共3次。合并上清液。将上清液通过内含干燥脱脂棉以及无水Na2SO4的漏斗转移至圆底烧瓶中。经旋转蒸发后浓缩上清液，定容至2mL，待GC-MS检测。
GC-MS色谱条件同上所述。
质量控制：采用外标法和四点校正标准物质制作标准曲线。4种PAEs混标的基质加标平均回收率为93.24％-107.94％，相对偏差低于7.94％。该方法满足痕量有机物定量分析要求。
图10和图11中■表示DMP，●表示DEP，▲表示DBP，▼表示DEHP。如图11所示，与对照组(图10)相比接入实施例3优选复配菌剂的黑土中PAEs含量显著下降。与液体培养基中优选的复配菌剂结果相同，优选菌剂对于短链PAEs(DMP、DEP)降解效果最好，3天时DMP和DEP降解率分别达到96.34％和93.80％。而对于较长链PAEs(DBP)，3天降解率也能达到81.91％。而长支链的DEHP到第3天降解率为42.25％。7天时，DMP、DEP和DBP的降解率分别达到98.34％、97.88％和94.24％。长链支链的DEHP在第7天时降解率也可达到82.49％。而7天的未接菌黑土中DMP、DEP、DBP和DEHP的降解率分别为41.39％，36.67％，28.65％和9.28％。
表1优选菌剂2修复土壤复合PAEs实际贡献率(％)
DMP DEP DBP DEHP
第1天 22.10 11.89 12.64 9.55
第3天 78.05 77.82 72.21 35.14
第5天 67.78 72.12 72.78 56.77
第7天 56.95 61.21 65.59 73.21
由表1可知优选复配菌剂2对复合PAEs降解的实际贡献率。其中，优选复配菌剂2在第3天对烷基侧链链较短的PAEs(DMP和DEP)实际贡献率最高，分别达到78.05％和77.82％。对于烷基侧链较长的DBP优选菌剂2在第5天的实际降解率最大，达到72.78％。而对于长烷基侧链DEHP，优选复配菌剂2在第7天时实际降解率也能达到73.21％。可见优选复配菌剂2能够显著提高黑土中各PAEs的清除速率，且能够很好地适应土壤环境。因此优选复配菌剂2在PAEs污染黑土修复中具有良好的潜力。
微生物降解复合PAEs时，DEHP和DBP因为其结构复杂，微生物降解速率通常较慢，对DMP和DEP的降解速率通常高于DEHP和DBP。已有研究表明短烷基侧链的PAEs(如DMP、DEP)毒性高于较长烷基侧链的PAEs(如DEHP、DBP)。在DEHP和DBP降解的过程中，次级代谢产物(如MEHP、MBP和MEP等)毒性远远高于母体，且DMP和DEP也会作为二者代谢过程中的中间体出现。现有的功能微生物虽然具有降解污染物的能力，但大量研究表明其生物活性在降解过程中可能受到抑制。在复合PAEs降解过程中，毒性较大的DMP、DEP以及各种次级代谢产物的出现会导致降解菌株对较长烷基侧链DEHP和DBP降解率进一步下降。在复配菌剂中，DNE-S1能够快速降解毒性较大的DMP和DEP，减少环境体系中有高毒性物质的积累，缩短功能菌株暴露的时间，保持功能菌株的生物活性，特别是对于DNE-S2(更善于降解长烷基侧链的DEHP和DBP)。因此，复配菌剂有助于微生物保持对复合PAEs的高效降解能力，复配菌剂降解能力优于单一菌株。
序 列 表
<110> 东北农业大学
<120>一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂及降解方法
<160> 2
<210> 1
<211> 1463
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌（Pseudomonas sp.）
<220>
<223> 施氏假单胞菌DNE-S1的16S rDNA
<400> 1
gccggggggc agactaccat gcagtcgagc ggatgagtgg agcttgctcc atgattcagc 60
ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggacaac gtttcgaaag 120
gaacgctaat accgcatacg tcctacggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta 180
tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggcgaggtaa aggctcacca aggcgacgat 240
ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct 300
acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc 360
gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt 420
taataccttg ctgttttgac gttaccgaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca 480
gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta 540
ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac 600
tggcgagcta gagtatggca gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag 660
atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctggg ctaatactga cactgaggtg 720
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc 780
gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagct aacgcattaa gtcgaccgcc 840
tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 900
ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatgctgag 960
aacctgccag agatggcggg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc 1020
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta 1080
gttaccagca cgttatggtg ggcactctaa ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1140
tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acggcctggg ctacacacgt gctacaatgg 1200
tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc 1260
cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga 1320
atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380
gttgctccag aagtagctag tctaaccttc gggggacgta ccacggagat aaggcg 1436
<210> 2
<211> 1446
<212> DNA
<213> 施氏假单胞菌（Pseudomonas sp.）
<220>
<223> 施氏假单胞菌DNE-S2的16S rDNA
<400>2
ggcgcccgtg ccgggcggcc ttacacatgc agtcgagcgg atgagaagag cttgctcttc 60
gattcagcgg cggacgggtg agtaatacct aggaatctgc ctggtagtgg gggacaacgt 120
ttcgaaagga acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga ccttcgggcc 180
ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240
gctacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc 360
catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg ggaggaaggg 420
cagtaagcga ataccttgct gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg gctaactctg 480
tgccagcagc cgcggtaata cagagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 540
cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca 600
tccaaaactg gcgagctaga gtagggcaga gggtggtgga atttcctgtg tagcggtgaa 660
atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctgggct catactgaca 720
ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 780
acgatgtcaa ctagccgttg gaatccttga gattttagtg gcgcagctaa cgcattaagt 840
tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggccttgac 960
atccaatgaa ctttccagag atggattggt gccttcggga acattgagac aggtgctgca 1020
tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct 1080
tgtccttagt taccagcacg ttatggtggg cactctaagg agactgccgg tgacaaaccg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct acacacgtgc 1200
tacaatggtc ggtacagagg gtcgccaagc cgcgaggtgg agctaatctc acaaaaccga 1260
tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1320
gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtgggt tgcaccagaa gtagctagtc taaccttcgg gaggacggta ccacgtgatc 1440
attgct 1446

Claims (9)

1.一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂，其特征在于该复合菌剂包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S1和施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)DNE-S2；
其中施氏假单胞菌DNE-S1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCCNO.16034。施氏假单胞菌DNE-S2保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年7月2日，保藏编号为CGMCCNO.16035。
2.根据权利要求1所述的一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂，其特征在于所述施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为(0.5～2):1。
3.根据权利要求1所述的一种高效降解黑土中邻苯二甲酸酯的复合菌剂，其特征在于所述施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2的菌体数量比为2:1。
4.利用权利要求1所述的复合菌剂降解邻苯二甲酸酯的降解方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
将施氏假单胞菌DNE-S1和施氏假单胞菌DNE-S2接种到含有多种PAEs的介质中，在温度为20-40℃、100-200rpm条件下降解1-7天；所述多种PAEs为DMP、DEP、DBP和DEHP中的任意两种或两种以上的混合物。
5.根据权利要求4所述的降解方法，其特征在于将DNE-S1和DNE-S2制备成菌悬液接种到含多种PAEs的介质中。
6.根据权利要求5所述的降解方法，其特征在于所述菌悬液的制备方法为将纯化后的DNE-S1或DNE-S2接入无机盐培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌2-4次后重悬调节OD600nm＝0.8-1.2作为菌悬液。
7.根据权利要求6所述的降解方法，其特征在于DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值相同，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的体积比为(0.5～2):1。
8.根据权利要求6所述的降解方法，其特征在于DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的OD值相同，DNE-S1菌悬液和DNE-S2菌悬液的体积比为2:1。
9.根据权利要求4或5所述的降解方法，其特征在于所述介质为黑土或无机盐培养基。
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