CN111560326B - 一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用 - Google Patents

一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用。本发明筛选分离得到了一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B，该菌株已于2020年3月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60988。该菌株能够利用草甘膦以及其代谢中间产物AMPA作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，能够快速、高效降解草甘膦及其降解中间产物AMPA，降解性能稳定，具有高效、快速、无残留、无二次污染的优点；因此，该菌株丰富了农药降解菌的资源库，在降解草甘膦或制备草甘膦降解菌剂、以及在制备生态修复微生物菌剂中均具有广泛的应用前景，对于修复草甘膦污染土壤或水体具有重要意义。

Description

一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用。
背景技术
草甘膦(Glyphosate,N-膦酰基甲基甘氨酸)，是1971年由美国孟山都公司研制的一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂。由于其理化性质稳定，具有高效、低毒、低残留等特点，在农、林、牧业等方面得到广泛的应用。草甘膦的除草作用机制主要是通过抑制绿色植物体内莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)的活性，来干扰5-烯醇式莽草酸-3-磷酸的合成，从而抑制植株体内所必需芳香族氨基酸的合成，最终导致植株失绿、发黄、枯萎、死亡。草甘膦作用机制独特，具有非选择性、高效性等优点，对于多种一年生和多年生的单、双子叶杂草的防除具有显著的效果，可防控世界上危害最大的78种杂草中的76种。随着抗草甘膦转基因作物的不断商业化种植，草甘膦的应用范围和使用量也不断增加。草甘膦除草效率高，效果好，成本低，已成为世界上应用最广、产量最大、年销售额最高的除草剂品种。
草甘膦一直以来都被认为是易降解、低残留、低毒、无致癌及遗传毒性的环境友好型农药，然而，越来越多的研究表明草甘膦并不是一种环境友好型农药。草甘膦会破坏土壤的微生态，影响微生物群落结构和土壤酶活性，尤其是抑制放线菌和土壤脲酶的活性。草甘膦还会影响雌性哺乳动物体内的胚胎发育，导致形态变异。例如，在鼠类试验中研究发现，草甘膦会导致母体和胎儿体内酶的活性功能异常，对妊娠期的雌鼠也有毒害作用，导致其后代的大脑会产生多功能性变异，骨骼无法正常发育等；另外，人体长期接触草甘膦一定程度会导致其早产及流产率的提高，且与草甘膦密切接触会产生DNA损伤，影响胎儿发育，使胎儿畸形产生生育缺陷。由此可见，土壤中残留的草甘膦不仅对环境造成影响，破坏生态平衡，并能通过食物链的富集进入哺乳动物体内，进而威胁人类健康，草甘膦的安全问题应引起人们的足够重视。因此，如何去除草甘膦的生态环境(土壤和水体)残留污染已成为当前亟待解决的问题。
以微生物降解为核心的生物修复技术具有安全、高效、无二次污染、无残留等优点，逐渐成为治理有机物和重金属污染的重要手段。现有专利(申请号为201610098355.8)公开了一株高效降解草甘膦的细菌Aquamicrobium defluvii YU1-1，在初始接菌量为2％～20％的条件下，该菌株对400mg/L草甘膦的降解率为100％。现有专利(申请号为201810657630.4)公开了利用菌株Aquamicrobium ahrensii制备得到的草甘膦固态降解菌剂，该菌剂对浓度为1000mg/L的固体和液体培养基中草甘膦的降解率在48h内达到100％。从以上现有技术可以看出，微生物菌剂在降解草甘膦中具有潜在的应用价值。但是，由于微生物降解草甘膦的能力会因菌株不同而存在一定的差异，因此，进一步筛选获得具有快速、高效且完全降解草甘膦能力的微生物菌株，对于有效解决草甘膦对生态环境的残留污染问题具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有草甘膦对生态环境的残留污染问题的缺陷和不足，提供一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium26B。
本发明第二个目的是提供中间苍白杆菌在降解草甘膦或制备草甘膦降解菌剂中的应用。
本发明第三个目的是提供中间苍白杆菌在制备生态修复微生物菌剂中的应用。
本发明第四个目的是提供一种草甘膦降解菌剂。
本发明第五个目的是提供一种生态修复微生物菌剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B，该菌株已于2020年3月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60988，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明从广西某农药厂废水处理池的活性污泥中分离筛选到了一株能够高效、快速降解草甘膦的菌株，经过形态学、生理生化以及分子生物学鉴定，该菌株属于中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)，命名为中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B。本发明发现该菌株在以草甘膦为唯一碳源的基础盐培养基中培养36h后，对草甘膦的降解效果为100％，且随着菌株初始接菌量的增加，完全降解草甘膦所需的时间显著降低。另外，该菌株也能够利用其降解草甘膦产生的中间产物AMPA为唯一碳源进行生长，且能耐受较高浓度的草甘膦。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
中间苍白杆菌在降解草甘膦或制备草甘膦降解菌剂中的应用。
中间苍白杆菌在制备生态修复微生物菌剂中的应用。
优选地，所述生态为草甘膦污染土壤或草甘膦污染水体。
本发明还提供了一种草甘膦降解菌剂，包括中间苍白杆菌。
本发明还提供了一种生态修复微生物菌剂，包括中间苍白杆菌。
优选地，所述中间苍白杆菌为中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B。
另外，所述菌剂在修复草甘膦污染土壤或草甘膦污染水体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述菌剂中的中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B的菌体浓度不低于1.0×105CFU/mL。
更优选地，所述菌剂中的中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B的菌体浓度为1.0×107CFU/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明筛选分离得到了一株中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B，该菌株能够利用草甘膦作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，快速降解草甘膦且完全矿化草甘膦，在草甘膦浓度为500mg/L时，初始接菌量为0.045g/L，培养至36h，该菌株对草甘膦的降解率为100％，且该菌株在土壤中培养5d后，对土壤中草甘膦的降解率高达95.4％；该菌株也能够利用其代谢中间产物AMPA作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在降解草甘膦方面具有高效、快速、无残留、无二次污染的优点，且降解性能稳定；
本发明丰富了农药降解菌的资源库，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径，为开发草甘膦污染治理新技术提供理论基础和科学依据，该中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B在降解草甘膦或制备草甘膦降解菌剂、以及在制备生态修复微生物菌剂中均具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为26B菌株在LB固体培养基上培养48h的菌落形态图；其中，“2019ZD1572S01”代表26B菌株测试编号。
图2是26B菌株的透射电镜图。
图3是26B菌株的革兰氏染色显微形态图。
图4是26B菌株的16S rDNA系统进化树。
图5是中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B的生长曲线及其降解草甘膦的曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所述培养基配方如下：
基础盐培养基(MSM，g/L)：(NH4)2SO4，2.0g；CaCl2·2H2O，0.01g；FeSO4·7H2O，0.001g；Na2HPO4·12H2O，1.5g；MgSO4·7H2O，0.2g；KH2PO4，1.5g，pH 7.0。固体培养基：每1L液体培养基加入15g琼脂粉。
Luria-Bertani培养基(LB，g/L)：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，去离子水1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min。固体培养基：每1L液体培养基加入15g琼脂粉。
实施例1 菌株的分离与鉴定
1、草甘膦降解菌株的筛选分离
采集广西南宁化工研究院农药厂废水处理池的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50mL含有草甘膦(50mg/L)的上述MSM液体培养基中。经30℃，200rpm培养5d后，每次按10％的接种量，将草甘膦质量浓度从50mg/L依次升至100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L连续富集培养。然后，将转接8次的培养液梯度稀释，涂布于含有300mg/L草甘膦的MSM固体平板上，30℃倒置培养48h。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在MSM固体平板上进行划线纯化，分离获得一株单菌落，编号为26B。
2、26B菌株的鉴定
(1)形态学鉴定
将26B菌株接种于LB固体平板上，在30℃条件下倒置培养48h，观察该菌株在LB固体培养基上培养48h的菌落形态；该菌株在LB液体培养基中呈扩散性混浊，并将该菌株置于透射电镜下，观察其菌株细胞的形态。
26B菌株在LB固体培养基上培养48h的菌落形态图如图1所示，可以看出，该菌株的菌落形态为菌落圆形，直径约1mm，表面光滑不透明，边缘整齐。
26B菌株的透射电镜图如图2所示，可以看出，透射电镜下菌株细胞呈具圆端的短杆状，直径约为1mm。
(2)生理生化鉴定
对26B菌株进行革兰氏染色，鉴定其为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；并依据《伯杰细菌鉴定手册》对该菌株进行生理生化实验。
26B菌株的革兰氏染色显微形态图如图3所示，可以看出，该菌株属于革兰氏阴性菌，好氧，具运动性。
26B菌株的生理生化鉴定结果如表1所示，可以看出，该菌株接触酶、氧化酶、脲酶、V-P测定、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、七叶苷水解、D-葡萄糖利用、阿拉伯糖利用、乳糖利用、麦芽糖利用、甘露醇利用、肌醇利用、蔗糖利用、鼠李糖利用、山梨醇利用、棉籽糖利用实验呈阳性；葡萄糖产气、明胶液化、吲哚、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验呈阴性。
表1 26B菌株的生理生化鉴定结果
Figure BDA0002442899440000051
Figure BDA0002442899440000061
注：“+”，表示阳性反应；“-”，表示阴性反应。
(3)分子生物学鉴定
提取26B菌株的基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用16S rDNA细菌通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，PCR产物委托上海英潍捷基贸易有限公司进行测序，得到26B菌株的16S rDNA序列。将26B菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用Clustal X 1.8.3及MEGA 6.0软件构建系统进化树及分析进化关系。
26B菌株的16S rDNA系统进化树如图4所示，可以看出，26B菌株的16S rDNA序列与BLAST在线数据库中的Ochrobactrum intermedium(GenBank登录号为MH344317.1)相似性达到99.12％，初步鉴定为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)。依据26B菌株的生理生化鉴定结果，该菌株的生理生化特征与中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)最相似，因此，本发明筛选获得的降解菌鉴定为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)。
基于上述鉴定结果，将该菌株分类命名为中间苍白杆菌Ochrobactrumintermedium 26B，并于2020年3月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：60988，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B对草甘膦的降解效果研究
1、实验方法
(1)种子液制备：将保存在-80℃冰箱里的中间苍白杆菌Ochrobactrumintermedium 26B在LB固体平板上进行活化后，接入含有10mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，4℃低温离心后，菌体用生理盐水(0.9％NaCl)冲洗，所得菌体作为接种体。
(2)降解性能测定：按初始接菌量为0.045g/L，分别向50mL含有草甘膦(500mg/L)的MSM培养液中接种，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养48h，每6h取样一次，采用稀释涂布平板后，记录菌落形成个数用来表示菌株26B的生长情况，采用UPLC-MS/MS测定其对草甘膦的降解情况。
(3)草甘膦及氨甲基膦酸(AMPA)检测条件：
UPLC-MS/MS：液相系统ACQUITYUPLC；
质谱系统XEVO-TQD(Waters，USA)；
色谱柱：ACQUITYUPLC HSS T3，1.7μm，2.1*100mm色谱柱；
流速：0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样体积：5μL；
流动相：A：水(含2mM乙酸铵+0.1％氨水)，B：甲醇；
表2 流动相及其条件
Figure BDA0002442899440000071
离子源：电喷雾离子化源ESI负离子，MRM模式；
毛细管电压：3.5kV；
源温度：150℃；
雾化气温度：350℃；
雾化气流速：800L/h；
按照以下公式计算草甘膦降解率：降解率(％)＝(1-A1/A0)×100，其中，A1为降解菌处理后草甘膦残留浓度，A0为对照处理后的草甘膦残留浓度。
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
另外，在相同条件下，将该菌株26B接种至AMPA浓度为500mg/L的液体MSM培养基中，观察该菌株26B的生长状况。
2、实验结果
中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B的生长曲线及其降解草甘膦的曲线如图5所示，可以看出，菌株26B在培养初期就能够快速降解草甘膦，随着培养时间的延长，草甘膦降解与菌株26B生长呈正相关。
在草甘膦作为唯一碳源条件下，菌株26B没有明显的生长和降解延滞期，在0～12h菌株26B生长较为缓慢，培养6h、12h后降解率分别为0.54％、6.95％，降解速率也较为缓慢。在12～24h菌株26B降解草甘膦的速率逐渐加快，为后续生长提供碳源和营养。在18h菌株26B进入生长对数期，持续到36h，在18～24h期间菌株26B对草甘膦的降解速率最快，且在36h时完全降解草甘膦，该菌株26B随之进入生长稳定期，降解草甘膦的产物AMPA的浓度也随着草甘膦的降解逐渐升高。在菌株26B被培养42h后开始进入衰亡期，菌群密度下降，AMPA的浓度也开始下降，说明此时菌株26B开始利用AMPA作为碳源和能量来源。
该结果说明菌株26B能够利用草甘膦作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在草甘膦浓度为500mg/L时，初始接菌量为0.045g/L，培养至36h，菌株26B对草甘膦的降解率为100％，表明该菌株26B具有高效、快速降解草甘膦的能力。
另外，在相同条件下，菌株26B在AMPA浓度为500mg/L的液体MSM培养基中也生长良好，说明该菌株也能够利用AMPA作为唯一碳源和能源进行生长繁殖。
以上结果表明：该菌株26B既能快速降解草甘膦，又能降解其中间产物AMPA，表明菌株26B能够完全降解草甘膦，且具有高效、快速、无残留、无二次污染的特点。
实施例3 中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B对土壤中草甘膦的降解效果研究
1、实验方法
供试土壤样品：农田表层土(3～10cm)，取自华南农业大学教学农场试验田，属于红壤土，超过3年未施用草甘膦。
收集供试土壤样品后，首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过2mm筛，分别取一定量的草甘膦溶于无菌水中，然后浸泡硅藻土，使草甘膦被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中草甘膦的终浓度为100mg/kg。取500g土样于30℃恒温恒湿培养箱中培养，按浓度1.0×107CFU/mL的接种量接入菌株26B降解菌悬液，以加蒸馏水的作为对照，土壤的持水量约保持在40％。在30℃和避光条件下连续培养5d，并定期取样，UPLC-MS/MS测定草甘膦残留量并计算降解率。降解率计算方法与实施例2中的相同。
2、实验结果
中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B对土壤中草甘膦的降解效果如表3所示，可以看出，菌株26B在土壤中培养5d后，其对土壤中草甘膦的降解率高达95.4％。
以上结果表明：菌株26B在直接施入土壤中后，能够快速降解土壤中的草甘膦，且降解性能稳定，为菌株26B对草甘膦的土壤修复提供了科学依据。
表3 中间苍白杆菌Ochrobactrum intermedium 26B对土壤中草甘膦的降解效果
Figure BDA0002442899440000091
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)26B，其特征在于，该菌株已于2020年3月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：60988。
2.权利要求1所述的中间苍白杆菌26B在降解草甘膦或制备草甘膦降解菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的中间苍白杆菌26B在制备生态修复微生物菌剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述生态为草甘膦污染土壤或草甘膦污染水体。
5.一种草甘膦降解菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的中间苍白杆菌26B。
6.一种生态修复微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的中间苍白杆菌26B。
7.权利要求5或6所述菌剂在修复草甘膦污染土壤或草甘膦污染水体中的应用。
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