CN110423709B - 一株高浓度苯酚、苯胺降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高浓度苯酚、苯胺降解菌及其应用。其分类命名为红球菌PB‑1（Rhodococcussp.PB‑1），保藏号为：CCTCC NO.M2019472。该菌株在48 h之内可完全降解1500 mg/L苯酚和800 mg/L苯胺，且2000 mg/L苯酚和1500 mg/L苯胺在72 h降解率分别为35%和68%。菌株降解苯酚的最佳温度为30~35℃，并且在碱性条件下降解效果较好，最适pH值为9.0。该菌株对苯酚和苯胺的降解均通过邻苯二酚1,2‑双加氧酶催化的邻位途径，该酶是一种诱导酶。本发明的菌株代谢产物无毒性，环境友好，在治理相关有机物污染的工业废水中具有非常高的应用价值。

Description

一株高浓度苯酚、苯胺降解菌及其应用

技术领域

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株对高浓度苯酚有降解效果，且能降解较高浓度苯胺的细菌。

背景技术

苯酚、苯胺及其衍生物被广泛应用于炼油、染料、农药、医药等行业生产中的原料或中间体，是相关工业排放废水中的主要有害污染物组成成份，是水体常见的污染物。2014年，我国苯酚总产量为134.4万吨；2015年，我国苯胺产量达到186万吨。苯酚和苯胺是现代化工行业中不可缺少的原料，市场广阔，随之而来的是其污染问题。含苯酚废水排入水体，不仅使生化需氧量增加，还会危害水生物繁殖与生存。苯胺是有毒有害物质，具有致癌作用，排放到环境中会严重污染环境和危害人体健康，因此需严格控制在一定含量范围内。

苯酚和苯胺具有致畸致癌作用，对环境和人类健康产生巨大危害，被许多国家列为优先控制污染物。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，苯酚和苯胺均在3类致癌物清单中。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。吸入高浓度苯酚蒸气可引发急性中毒现象，如头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。慢性中毒严重者引起蛋白尿，可致皮炎。苯胺急性中毒表现为引起高铁血红蛋白血症和肝、肾及皮肤损害。高铁血红蛋白10％以上，红细胞中出现赫恩兹小体，可在中毒4天左右发生溶血性贫血，中毒后2-7天内发生毒性肝病。

处理这类有机污染物的方法主要有催化氧化、生物降解、萃取与吸附等。近几十年的研究表明，许多微生物参与了此类有机毒物的降解反应。将微生物用于去除此类污染物，具有速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和，以及无二次污染等显著优点，潜力巨大。因此，利用微生物技术处理苯酚及苯胺污染物已成为当今水污染治理的重要途径和研究方向。目前，已经在许多菌属的微生物中发现了能够降解高浓度苯酚和苯胺的细菌，但能以苯胺和苯酚为唯一碳源、能源生长的微生物，虽有报道，但未作深入研究。基于工业废水中高浓度苯酚、苯胺和相关衍生物经常同时出现的情况，分离既能降解苯酚，又能降解高浓度苯胺的高效降解菌，并深入研究其降解特性，显得十分必要。目前，国内外对能以苯胺和苯酚为唯一碳源、能源生长的微生物报道较少，因此筛选出能够高效降解该类有机污染物的菌株，在水体污染治理中具有很高的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种既能降解苯酚，又能降解高浓度苯胺的微生物，所述菌种是从湖北省武汉市原武昌焦化厂废厂区含煤焦油底泥、水样和岸边土壤中筛选得到，通过深入研究其降解特性，为应用微生物治理此类有机污染水体提供理论基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，提供了一株红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1，其保藏号为：CCTCC NO：M2019472。

第二方面，提供上述的红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1在如下1)或2)中的应用：

1)在降解苯酚中的应用；

2)在降解苯胺中的应用。

第三方面，提供一种降解苯酚的方法，包括如下步骤：将上述的红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1接种在含有苯酚的体系中培养，实现降解苯酚。

上述的方法中，所述培养的温度为30～35℃，pH值为8-10，所述含有苯酚的体系的苯酚浓度为0-2000mg/L，且不为0；在本发明的实施例中，所述培养的温度为30℃，pH值为9,所述含有苯酚的体系的苯酚浓度为0-1000mg/L，且不为0。

上述含有苯酚的体系为含有苯酚的工业废水或者含有苯酚的培养基。

第四方面，提供一种降解苯胺的方法，包括如下步骤：将上述的红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1接种在含有苯胺的体系中培养，实现降解苯胺。

上述的方法中，所述培养的温度为30℃，pH值为7所述含有苯胺的体系的苯胺浓度为0-1500mg/L，且不为0。

上述含有苯酚或苯胺的体系为含有苯酚或苯胺的工业废水或者含有苯酚或苯胺的培养基。在本发明的实施例中培养基为LB培养基或者无机盐培养基，具体配方见实施例。

以上述红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。

红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1已于2019年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国·武汉·武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M2019472。

本发明的实验证明，本发明发现了一株新的红球菌(Rhodococcus sp.)PB-1CCTCCNO：M2019472，其能够快速高效地降解苯酚或苯胺，可用于含苯酚或苯胺废水的生物降解处理过程。

附图说明

图1为红球菌PB-1在固体LB平板上的生长情况；

图2为红球菌PB-1的电子扫描显微镜图；

图3为红球菌PB-1的分子生物学系统发育树；

图4为单因素影响PB-1降解苯酚实验图；

(a)加菌量的影响；(b)苯酚浓度的影响；

(c)pH的影响；(d)温度的影响。

图5为PB-1对不同浓度苯胺的降解。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】苯酚高效降解菌的筛选及驯化

本实验样品采至湖北省武汉市原武昌焦化厂废厂区含煤焦油底泥、水样和岸边土壤，采集后立即放于实验室-20℃冰箱保存，以杀死土壤中的昆虫和植物组织以及一些病毒。处理10h之后，于4℃解冻，多余的土样置于4℃冰箱保存。称取10g土样/底泥(湿重)，加入到90mL无菌水中，30℃，150rpm振荡2h。将得到的悬浊液依次稀释，取200uL稀释倍数为10^-3，10^-4，10^-5稀释液至于以苯酚为唯一碳源的无机盐固体培养基(培养基成分：(NH₄)₂SO₄1.0g/L，KH₂PO₄0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，NaCl 1.0g/L，苯酚0.5g/L，琼脂15g/L，pH＝7)。每个处理重复3个平板，30℃恒温培养，3-5天左右观察，对单个菌落在相同培养基上划线培养，得到具有苯酚降解特性菌株若干。

苯酚降解菌的驯化筛选：称取5g土样(湿重)，加入到含500mg/L苯酚的100mL无机盐培养基中，30℃，180rpm培养5天。以后每隔5天，取无机盐培养基中的培养液5mL，依次添加到为苯酚浓度1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L的无机盐培养基中。同时，每次转接均吸取1mL混合液，稀释20倍，取200μL涂布在含相同苯酚浓度的无机盐的固体培养基上，观察菌种生长情况，最终可得到具有高效降解特性的微生物。再于固体无机盐培养基上划线分离得到纯种特异降解菌。

针对已经筛选得到的降解菌，在以苯酚为唯一碳源的无机盐液体培养基中生长，根据生长情况选育出能耐受高浓度苯酚的菌株PB-1。研究菌株PB-1在以其他苯系物为唯一碳源的无机盐液体培养基中生长情况，发现该菌株可利用低浓度的喹啉，在较高浓度苯胺中生长良好，不能利用硝基酚、氯酚和萘等物质。

【实施例2】菌株的鉴定

将纯化的菌株接种于固体LB培养基，培养2天后观察菌株在固体平板上的菌落形态特征，然后获取少量菌体，经戊二醛固定、酒精梯度脱水、冷冻干燥后，于电子扫描显微镜下观察菌体的显微结构，并记录菌株的形态特征：菌体呈球形，直径约为1.0μm，无鞭毛。

菌株的理化性质鉴定包括碳源利用、氮源利用和生理生化测试。通过表格记录结果，菌株的碳源和氮源利用效率较高，有水解淀粉和油脂等能力。

表1红球菌PB-1碳源和氮源利用实验

表2红球菌PB-1生理生化检测

注：“+”表示培养5天内检测为阳性结果，“-”表示为阴性结果。

细菌16S rDNA测序包括了菌株DNA提取、16S rDNA体外PCR扩增(使用16S通用引物1492R和27F，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)获得1050bp的基因片段。将测序得到的序列结果带入NCBI的数据库中进行BLAST基因序列比对，经过MEGA软件分析，与数据库中相似菌株的16S rDNA序列进行比对，建立菌株16S rDNA系统发育树，如图2所示。结果表明该菌株与Rhodococcus sp.同源性很高，相似度高达99.9％。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为红球菌属Rhodococcus sp.，序列号为MK040534，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【实施例3】菌株对苯酚的最适降解条件分析

菌体培养：在LB平板上挑取PB-1单菌落，置于装有1mL LB的2mL EP管中，180rpm、30℃培养14h至培养液浑浊。按照1％(V/V)加入到装有LB的锥形瓶中，相同条件下培养16h左右。将菌液于6000rpm离心10min，收集菌体，并用灭菌的无机盐培养基清洗。最后将所有菌体合并至一支离心管中，用4mL无机盐培养基重悬，测定的菌液OD₆₀₀值。

单因素实验：选择菌体浓度、苯酚浓度、温度和pH作为研究的单因素变量，实验均在180rpm的恒温避光摇床内进行，不涉及温度和pH变量的均为30℃和pH 7.0条件。菌体浓度OD₆₀₀设置为0.1、0.2和0.3，苯酚浓度为1000、1500、2000、2500mg/L，温度梯度选择20、25、30、35、40℃，调节pH分别为5、6、7、8、9、10。实验结果表明：菌株PB-1降解苯酚的最佳温度为30～35℃，低温或高温能明显抑制该菌活性；pH在碱性范围内生长良好，最适pH为9.0，为一株嗜碱菌；该菌株耐受2000mg/L苯酚，72h降解率可达35％，不能在2500mg/L苯酚浓度下生长；在实验设置范围内，菌体浓度越高，降解效果越好，OD₆₀₀＝0.3时，24h几乎可完全降解1000mg/L苯酚。

【实施例4】菌株对苯胺的降解

研究菌株PB-1对苯胺的降解，依次配制含苯胺300、500、800、1200、1500mg/L的无机盐培养基，菌体OD₆₀₀＝0.3，于180rpm、30℃培养，每组3个平行。苯胺浓度测定在pH 8.0的硼砂-盐酸缓冲液体系进行，使用紫外分光光度计波长于230nm处比色，得到苯胺残留浓度，计算苯胺降解率。实验结果表明，菌株PB-1对苯胺的降解速率明显低于苯酚，该菌株24、48、72h内分别可完全降解300mg/L、800mg/L、1200mg/L苯胺，耐受苯胺浓度为1500mg/L，72h降解率达68％。在较高浓度苯胺培养基中，溶液呈现乳黄色，没有显现原本的淡粉色，同浓度苯胺对菌株PB-1的毒性较苯酚大，严重抑制菌株生长能力。

【实施例5】菌株对苯酚和苯胺降解途径分析

细胞裂解液制备：分别配制含1000mg/L苯酚、1000mg/L苯胺的无机盐培养基和LB培养基，加入菌液OD₆₀₀＝0.3。30℃、180rpm培养48h后，6000rpm离心10min收集菌体。用pH7.5磷酸缓冲液洗涤菌体2次，之后悬浮在相同的磷酸缓冲液中，利用超声波细胞粉碎机进行破碎(超声4s，间隔6s，总时间为10min)。10000rpm离心20min，其上清液即为细胞裂解液，用于粗酶活性测定。

粗酶活检测：反应混合物共3.0ml，含有2.0ml磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，0.6ml的1mM邻苯二酚，0.2ml去离子水和0.2ml细胞裂解物。反应在室温下进行。使用紫外分光光度计，通过测量375nm处的2-羟基粘康半醛和260nm处的粘康酸的吸光度，测定邻苯二酚2,3-双加氧酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶活性。每1min读数一次，记录前5min数值。根据公式，计算酶反应速率：

ν：酶反应速率，μmol·L^-1·min^-1；

A′：吸光度的变化率；

ε₃₇₅＝12000L·mol^-1·cm^-1；ε₂₆₀＝16000L·mol^-1·cm^-1。

由公式(1)计算得到下表：

表3红球菌PB-1在不同培养基中两种双加氧酶活性检测(单位：μmol·L^-1·min^-1)

实验结果表明红球菌PB-1对苯酚和苯胺的降解均通过邻苯二酚1,2-双加氧酶催化的邻位途径。而在LB培养基生长的菌株中未检测到两种酶的活性，说明该酶是一种诱导酶。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一株高浓度苯酚、苯胺降解菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1050

<212> DNA

<213> 红球菌 PB-1 (Rhodococcus sp. PB-1)

<400> 1

agatgcggtg cttaccatgc aagtcgaacg atgaagccca gcttgctggg tggattagtg 60

gcgaacgggt gagtaacacg tgggtgatct gccctgcact ctgggataag cctgggaaac 120

tgggtctaat accggatagg accttcggcc gcatggctgg gggtggaaag tttttcggtg 180

caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtaa tggcctacca aggcgacgac 240

gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 300

acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca gcgacgccgc 360

gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcacc catgacgaag cgcaagtgac 420

ggtagtggga gaagaagcac cggccaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt 480

gcgagcgttg tccggaatta ctgggcgtaa agagctcgta ggcggtttgt cgcgtcgtct 540

gtgaaaaccc gcagctcaac tgcgggcttg caggcgatac gggcagactc gagtactgca 600

ggggagactg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt 660

ggcgaaggcg ggtctctggg cagtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg ggtagcgaac 720

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg cgctaggtgt gggtttcctt 780

ccacgggatc cgtgccgtag ccaacgcatt aagcgccccg cctggggagt acggccgcaa 840

ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg tggattaatt 900

cgatgcaacg cgaagaacct tacctgggtt tgacatgtac cggacgactg cagagatgtg 960

gtttcccttg tggccggtag acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggtaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1050

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taccttgtta cgactt 16

Claims (10)

1.一株红球菌（Rhodococcus sp.）PB-1，其特征在于，其保藏号为：CCTCC NO：M2019472。

2.权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）PB-1在如下1）或2）中的应用：

1）在降解苯酚中的应用；

2）在降解苯胺中的应用。

3.一种降解苯酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）PB-1接种在含有苯酚的体系中培养，实现降解苯酚。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法中，培养的温度为30~35℃，pH值为8-10，所述含有苯酚的体系的苯酚浓度为0-2000 mg/L，且不为0。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为30℃，pH值为9, 所述含有苯酚的体系的苯酚浓度为0-1000 mg/L，且不为0。

6.一种降解苯胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）PB-1接种在含有苯胺的体系中培养，实现降解苯胺。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法中，培养的温度为30℃，pH值为7，所述含有苯胺的体系的苯胺浓度为0-1500 mg/L，且不为0。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含有苯胺的体系的苯胺浓度为0-300mg/L，且不为0。

9.一种菌剂，其特征在于，该菌剂的活性成分为权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）PB-1，所述红球菌的保藏号为 CCTCC NO：M2019472。

10.权利要求9所述的菌剂在治理含有苯胺或苯酚的工业废水中的应用。

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