CN110564716B - 同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球、其制备方法及应用 - Google Patents
同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球、其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球、其制备方法及应用，所述载菌复合微球由海藻酸钠和竹炭搭载降解菌株PB‑1，并由壳聚糖覆膜形成，所述降解菌株属于红球菌属，分类命名为Rhodococcus sp.PB‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2019472。本发明通过正交试验确定了最适包菌量、海藻酸钠、竹炭和壳聚糖浓度。本发明提供的载菌复合微球对苯酚和苯胺的去除效果显著，并且可循环使用，制备方法简单易行，生产成本低，在处理相关有机物污染的工业废水中具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物材料制备领域，特别涉及一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球、其制备方法及应用。
背景技术
在芳族化合物中，苯酚和苯胺具有良好的反应活性和高产品效率，是合成精细化学品、农用化学品、药物和染料常用的原料或中间体，因而成为相关工业排放废水中的主要有害污染物组成成份。在各种有机污染物中，苯酚和苯胺都是属于有毒且较为顽固的一类，具有致突变性和潜在致命性。酚类可以通过皮肤接触轻易吸收，可能作为有效的内分泌干扰物；苯胺的主要毒性是与血液中血红蛋白结合，降低氧气运输。苯酚和苯胺均被美国环境保护署列为优先污染物(1994)，并被世界卫生组织列为三类致癌物(2017)。已有一些几种物理化学方法用于去除水中苯酚和苯胺，包括溶剂萃取，吸附，化学氧化，焚烧等，然而这些方法都不具有成本效益，还会形成有害副产物。使用微生物技术处理有机污染物已逐渐成为优先选择的方案，此方法操作成本较低，并且有完全去除的可能性。
微生物在处理含酚废水时，特别是当苯酚浓度超过1000mg/L，高浓度的底物会抑制微生物生长，生物降解过程明显减弱。为了克服这个问题，已经提出降解菌的固定化可以有效增强微生物对底物的耐受性，提高降解速率和具有重复使用等方面优势。无毒包埋材料可保护细胞免受有害化合物的毒性作用，并提升微生物在生物修复系统中的生存和代谢能力。许多不同的凝胶基质可作为细菌的固定载体，海藻酸钠(SA)凝胶是最常用的细胞固定材料，因为它的毒性低于合成聚合物，并且在温和的条件下很容易凝胶化。近年来竹炭(BC)这种环保功能型材料迅速发展，据报道BC与活性炭一样具有吸附能力，包含各种形状和大小的孔网络，可以与多种分子结合。为了提高海藻酸盐凝胶微球的强度，在其表面涂覆壳聚糖基质可以增强机械稳定性。壳聚糖(CA)是一种很有前景的涂料，具有无毒性、生物相容性、易于处理、价格便宜(由于其丰富性)和生物降解性。一些研究已报道出使用CA包覆可以改善海藻酸盐微球的稳定性，进而提升包埋益生菌的生存力。
研究表明，大量细菌、真菌和藻类等微生物可经固定化后用于降解苯酚或者苯胺，但目前没有文献报道出应用于同步去除苯酚和苯胺的载菌复合材料。基于工业废水中高浓度苯酚、苯胺及相关衍生物经常同时出现的情况，制备一种可用于同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球，在处理二者混合污染工业废水中具有十分广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球，所述同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球可缩短高浓度苯酚和/或苯胺完全去除时间，提高降解菌株的降解率，显著优化去除效果。
本发明的目的之二在于提供一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球的制作方法，所述方法简单易行，无需特殊设备，有望用于工业化生产。
本发明目的之三在于提供一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球的应用，用于处理苯酚和/或苯胺混合污染的工业废水，具有十分广阔的应用前景。
本发明实现目的之一采用以下技术方案：
一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球，该微球由海藻酸钠和竹炭搭载降解菌株，并由壳聚糖覆膜形成，所述降解菌株属于红球菌属，分类命名为Rhodococcus sp.PB-1，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019472。
本发明实现目的之二采用以下技术方案：
一种权利要求1所述的同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球的制备方法，所述方法主要步骤如下：
(1)将海藻酸钠、竹炭粉和壳聚糖均进行灭菌处理，得到无菌的海藻酸钠、竹炭粉和壳聚糖；
(2)将步骤(1)得到的无菌海藻酸钠粉末中溶于无菌水中，充分溶解，配制成海藻酸钠终浓度为3％的溶液Ⅰ；将步骤(1)得到无菌壳聚糖加入1％醋酸溶液中，充分溶解，配制成壳聚糖终浓度为3％的溶液Ⅱ；
(3)将步骤(1)得到的无菌竹炭粉加入到步骤(2)得到的溶液Ⅰ中，配制成竹炭终浓度为3％的溶液Ⅲ，再向溶液Ⅲ中加入降解菌株PB-1，使包菌量为1.406×109CFU/mL，充分混匀，得到混合稠液；
(4)在无菌条件下，将步骤(3)得到的混合稠液逐滴滴入到4℃、4％CaCl2溶液中形成凝胶颗粒，将含该凝胶颗粒的4％CaCl2溶液置于室温下1h，然后弃去4％CaCl2溶液，并用无菌生理盐水洗涤该凝胶颗粒，再将该凝胶颗粒浸没于4℃、4％CaCl2溶液中交联24h，得到交联后的凝胶颗粒；
(5)将步骤(4)得到的交联后的凝胶颗粒使用无菌生理盐水洗涤并沥干表面水分后，置于步骤(2)得到的溶液Ⅱ中覆膜4h，得到粒径约3mm的海藻酸钠-竹炭-壳聚糖载菌复合微球，即所述载菌复合微球；
其中，上述终浓度均为质量体积百分比。
本发明实现目的之三采用以下技术方案：
一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球在苯酚和/或苯胺去除中的应用。
本发明使用的菌株从湖北省武汉市原武昌焦化厂废厂区含煤焦油底泥、水样和岸边土壤中筛选得到，其分类命名为红球菌PB-1(Rhodococcus sp.PB-1)，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国·武汉·武汉大学)。
本发明以载菌复合微球每组用量为5.0g，加入到pH值为7.0的100mLMSM培养基，于30℃、180rpm培养，进行对污染物(苯酚和/或苯胺)去除特性试验，结果显示如下：
(1)该载菌复合微球可重复循环使用，在混合底物(苯酚1000mg/L+苯胺1000mg/L)去除中，每个循环持续时间为48h，该载菌复合微球可重复在此浓度混合底物中使用4次；
(2)单一底物(苯酚或苯胺)去除中，该载菌复合微球对2000mg/L苯酚完全去除时间为108h，对1500mg/L苯胺完全去除时间为62h；
(3)混合底物(苯酚和苯胺)去除中，该载菌复合微球在含苯酚和苯胺各1000mg/L的反应体系中，60h总去除率为94.74％；在含苯酚和苯胺各1500mg/L的反应体系中，108h总底物的去除率为96.91％。
与现有技术相比，本发明具有如下显著效益：
(1)本发明中使用的材料廉价易得，海藻酸钠、竹炭和壳聚糖用量低，因而制作成本较低；
(2)本发明的固定化微球可缩短高浓度苯酚和苯胺完全去除时间，提高降解菌株的降解率，显著优化去除效果；
(3)本发明的载菌复合微球制备方法简单易行，竹炭和菌体能在体系中均匀分布，可操作性强，无需特殊设备，有望用于工业化生产。
本发明中生物材料保藏信息：
本发明使用的菌株从湖北省武汉市原武昌焦化厂废厂区含煤焦油底泥、水样和岸边土壤中筛选得到，已于2019年6月19日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。该菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M2019472，分类命名：红球菌PB-1(Rhodococcus sp.PB-1)。
附图说明
图1为本发明载菌复合微球的普通光学照片。
图2为本发明载菌复合微球的电子扫描显微镜照片。
图3为本发明载菌复合微球的重复使用结果图。
图4为本发明载菌复合微球对苯酚独立去除结果图；
苯酚初始浓度为2000mg/L。
图5为本发明载菌复合微球对苯胺的独立去除结果图；
苯胺初始浓度为1500mg/L。
图6为本发明载菌复合微球对苯酚和苯胺混合底物(苯酚和苯胺各为1000mg/L)的去除结果图。
图7为本发明载菌复合微球对苯酚和苯胺混合底物(苯酚和苯胺各为1500mg/L)的去除结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明使用的降解菌株从湖北省武汉市原武昌焦化厂废厂区含煤焦油底泥、水样和岸边土壤中筛选得到，其分类命名为红球菌PB-1(Rhodococcus sp.PB-1)，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国·武汉·武汉大学)，保藏号为：CCTCC NO：M2019472。
【实施例1】载菌复合微球的制备
1.降解菌株PB-1菌悬液的制备
1.1挑菌：使用牙签挑取保存于4℃的LB平板上单菌落，置于装有1mL灭菌LB的2mLEP管中，180rpm、30℃培养14h至培养液浑浊，以达到活化降解菌株的目的。
1.2转菌、培养：扩大降解菌株培养，活化的降解菌株按照1％(V/V)加入到装有LB的锥形瓶中，相同条件下培养16h，培养基呈现橙红浊液。
1.3收菌：将步骤(2)培养好的菌液倒入灭菌干燥的50mL离心管中，6000rpm离心10min，去除上清液，菌体用适量MSM培养基清洗3遍。最后将菌体合并至1支离心管中，加入适量MSM培养基混匀，即得到降解菌PB-1的菌悬液，控制菌体密度在14×109CFU/mL左右。
2.载菌复合微球(海藻酸钠-竹炭-壳聚糖载菌微球)的制备
2.1为确定材料最适包埋浓度，按以下表1(正交实验表L934)制作不同材料配比的微球。准确称取以不同材料配比制备的微球5.0g，加入含2000mg/L苯酚、pH为7.0的100mLMSM培养基中，30℃、180rpm培养48h后测定苯酚浓度，计算苯酚的去除率。四因素三水平(L934)的正交试验结果如下表1：
表1正交试验表(L934)
结果：根据上表中数据，得到的最适条件为：包菌量在14.06×108CFU/mL，竹炭含量在3％，海藻酸钠含量在3％，壳聚糖含量在3％，苯酚去除率最高，所述含量均为质量体积百分比。
2.2依据上述2.1正交试验得到的最适条件，制作载菌复合微球，步骤如下：
2.2.1准确称取上述2.1最适条件下的海藻酸钠、竹炭粉和壳聚糖，采样紫外照射20min灭菌；
2.2.2将3g灭菌后的海藻酸钠粉末中溶于100mL无菌水，配制成海藻酸钠终浓度为3％的溶液Ⅰ；将灭菌后的壳聚糖粉末按比例中溶入1％醋酸溶液中，配制成壳聚糖终浓度为3％的溶液Ⅱ；上述过程中均使用微波加热助溶，保证溶解过程无菌污染；
2.2.3待溶液Ⅰ冷却后加入竹炭粉，配制成竹炭终浓度为3％的溶液Ⅲ，再根据细菌CFU与OD600的关系(数值上，CFU*107＝23.54*OD600+0.079)，向溶液Ⅲ中加入相应降解菌量，使包菌量在14.06×108CFU/mL，充分混合均匀，静置一段时间，排出气泡，得到混合稠液；
2.2.4使用5mL注射器吸取上述混合稠液，逐滴滴入到4℃、4％CaCl2溶液中(该过程在无菌操作台内进行)，形成凝胶颗粒，将含凝胶颗粒的4％CaCl2溶液于室温下放置1h；
2.2.5倒去CaCl2溶液，上述凝胶颗粒用无菌生理盐水清洗2-3遍，再将凝胶颗粒浸没于4℃、4％的CaCl2溶液，交联24h，得到交联后的凝胶颗粒；
2.2.6取出上述交联后的凝胶颗粒，再次用无菌生理盐水洗涤，沥干表面水分，室温下置于溶液Ⅱ中覆膜4h，得到粒径约3mm的海藻酸钠-竹炭-壳聚糖载菌复合微球，即载菌复合微球，无菌生理盐水洗涤后置于4℃保存备用。
上述浓度均为质量体积百分比。
结果：如附图1所示，制备好的载菌复合微球呈粒径均匀的黑色颗粒。经冷冻干燥后，使用电子扫描显微镜观察，得到如附图2所示的显微图，可见清晰的核壳式结构。
【实施例2】载菌复合微球在去除苯酚和/或苯胺中的应用
1.载菌复合微球的重复使用情况
将实施例1中2.2方法制备的载菌复合微球应用于混合底物(苯酚和苯胺)去除，研究其可重复循环使用次数。配制混合底物：苯酚1000mg/L+苯胺1000mg/L、pH为7.0的MSM培养基。准确称取5.0g载菌复合微球加入至100mL混合底物中，30℃、180rpm振荡培养，培养持续时间48h后，分别对苯酚、苯胺浓度进行测定，计算单个底物及总底物去除率。每次使用之后，微球用无菌生理盐水洗涤3遍，沥干水分之后，加入到下一个循环中重复使用，每个循环均为新配置混合底物(苯酚1000mg/L+苯胺1000mg/L、pH为7.0的MSM培养基)。实验重复三个平行，取均值作图。
实验结果：载菌复合微球至少可重复使用4次，如附图3所示，苯酚去除率及苯胺去除率均在65％以上，苯酚去除率最高可达90.54％，苯胺去除率最高达82.39％；总体去除率维持在75％以上，最高达85.94％。载菌复合微球循环使用过程中，出现膨胀现象，在第四次使用中出现破裂，主要由于MSM培养基中的磷酸盐与微球上的钙离子结合，导致凝胶微球结构破坏。总体来说，微球在每一次重复循环使用中都能保持较高的去除率，结构相对稳定，因而是一种用于去除苯酚和苯胺混合污染良好的复合材料。
2.载菌复合微球在苯酚和苯胺独立去除中的应用
分别配制含苯酚浓度为2000mg/L的pH为7.0的MSM培养基、含苯胺浓度为1500mg/L的pH为7.0的MSM培养基，均加入实施例1中2.2方法制备的载菌复合微球5.0g，分别进行两种底物(苯酚或苯胺)的独立去除。同时设立游离细胞对照组、灭菌微球对照组。
2.1游离细胞对照组：将实施例1中制备的菌株PB-1菌悬液，稀释100倍后，测其在波长600nm处的吸光值OD。要求本对照组降解体系中OD600＝0.3，总体积为100mL根据公式：A测*100*V＝100mL*0.3，计算出相应的菌液加入体积，将该体积的菌液分别加入至100ml含苯酚浓度2000mg/L的MSM培养基和100ml含苯胺浓度1500mg/L的MSM培养基中，分别计算苯酚108h内和苯胺72h内的去除率。
2.2灭菌微球对照组：采用与实施例1中载菌复合微球相同的制作方法，所有使用材料经过灭菌，但不添加降解菌株PB-1，制备灭菌微球。称取5.0g灭菌微球用于100mL本对照组体系，即将5.0g灭菌微球分别加入至100ml含苯酚浓度2000mg/L的MSM培养基和100ml含苯胺浓度1500mg/L的MSM培养基中，分别计算苯酚108h内和苯胺72h内的去除率。用以研究复合材料的吸附作用。
2.3载菌复合微球(载菌微球)实验组：将实施例1中2.2方法制备载菌复合微球5.0g用于100mL本实验组体系，用以研究复合材料的吸附作用。即将5.0g载菌复合微球分别加入至100ml含苯酚浓度2000mg/L的MSM培养基和100ml含苯胺浓度1500mg/L的MSM培养基中，分别计算苯酚108h内和苯胺72h内的去除率。
2.4所有对照组与实验组均置于30℃、180rpm培养，取样时间间隔为12h，每组重复三个平行。
实验结果：如附图4、附图5所示，实验前期，苯酚和苯胺的去除主要为材料的吸附作用，约有21.14％苯酚和19.29％苯胺被无菌微球吸附。最终，载菌复合微球实验组中，2000mg/L苯酚在108h完全去除，1500mg/L苯胺在62h完全去除；而游离细胞对照组中，苯酚去除率达到56.62％，苯胺去除率达到56.67％。这些结果表明，游离细胞可能无法抵抗苯酚和苯胺在较高初始浓度下的毒性作用，固定化微球可以为降解菌株PB-1提供保护，并且可抵抗底物抑制作用产生的不利影响，从而显著加速生物降解过程。实验结果证实SA-BC-CA(海藻酸钠-竹炭-壳聚糖)的结构足以维持包埋细胞的生物活性，因此SA-BC-CA复合材料是固定红球菌PB-1，用于降解苯酚和苯胺的合适载体。
3.载菌复合微球对苯酚和苯胺的同步去除中的应用
将实施例1中2.2方法制备的载菌复合微球应用于不同浓度苯酚和苯胺混合底物的同步去除。设置两个实验组：(1)苯酚浓度和苯胺浓度均为1000mg/L的pH为7.0的100mLMSM培养基；(2)苯酚浓度和苯胺浓度均1500mg/L的pH为7.0的100mL MSM培养基。分别于两个实验组中加入5.0g载菌复合微球，于30℃、180rpm培养，总反应时间120h。取样时间间隔为12h，对苯酚和苯胺浓度分别进行测定，计算单个底物去除率和总去除率，每组重复三个平行，取均值。
实验结果：如附图6所示，在总底物(苯酚+苯胺)浓度为2000mg/L的反应体系中，苯酚能够快速达到完全去除，苯胺在60h去除率达到89.48％，60h总去除率为94.74％，120h最终总去除率为96.73％。如附图7所示，在总底物(苯酚+苯胺)浓度为3000mg/L的反应体系中，两种底物去除率曲线明显变缓，苯酚在96h之内仍能达到完全去除，苯胺在108h去除率为93.81％，108h总去除率为96.91％，120h总去除率最终可达到97.78％。据我们所知，使用固定化微生物达到这种高效率的去除，在文献报道中甚少。
综上所述，从反应时间来看，单独处理2000mg/L苯酚需108h；处理2000mg/L混合底物需60h；处理3000mg/L混合底物需108h。显然，混合污染的底物去除效率更高。因此，相比于处理单一苯酚污染，载菌复合微球在处理高浓度苯酚和/或苯胺混合污染中更具有应用前景。
Claims (3)
1.一种同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球，其特征在于：所述载菌复合微球由海藻酸钠和竹炭搭载降解菌株，并由壳聚糖覆膜形成，所述降解菌株属于红球菌属，分类命名为Rhodococcus sp.PB-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019472。
2.一种权利要求1所述的同步去除苯酚和苯胺的载菌复合微球的制备方法，其特征在于：所述方法主要步骤如下：
(1)将海藻酸钠、竹炭粉和壳聚糖均进行灭菌处理，得到无菌的海藻酸钠、竹炭粉和壳聚糖；
(2)将步骤(1)得到的无菌海藻酸钠粉末中溶于无菌水中，充分溶解，配制成海藻酸钠终浓度为3％的溶液Ⅰ；将步骤(1)得到无菌壳聚糖加入1％醋酸溶液中，充分溶解，配制成壳聚糖终浓度为3％的溶液Ⅱ；
(3)将步骤(1)得到的无菌竹炭粉加入到步骤(2)得到的溶液Ⅰ中，配制成竹炭终浓度为3％的溶液Ⅲ，再向溶液Ⅲ中加入降解菌株PB-1，使包菌量为1.406×109CFU/mL，充分混匀，得到混合稠液；
(4)在无菌条件下，将步骤(3)得到的混合稠液逐滴滴入到4℃、4％CaCl2溶液中形成凝胶颗粒，将含该凝胶颗粒的4％CaCl2溶液置于室温下1h，然后弃去4％CaCl2溶液，并用无菌生理盐水洗涤该凝胶颗粒，再将该凝胶颗粒浸没于4℃、4％CaCl2溶液中交联24h，得到交联后的凝胶颗粒；
(5)将步骤(4)得到的交联后的凝胶颗粒使用无菌生理盐水洗涤并沥干表面水分后，置于步骤(2)得到的溶液Ⅱ中覆膜4h，得到粒径约3mm的海藻酸钠-竹炭-壳聚糖载菌复合微球，即所述载菌复合微球；
其中，上述终浓度均为质量体积百分比。
3.根据权利要求1所述的同步去除苯酚和苯胺载菌复合微球在苯酚和/或苯胺去除中的应用。
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Granted publication date: 20210720 |