CN113215009B - 一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用，该制备方法包括制备石油烃降解菌的菌悬液；其中，石油烃降解菌包括假单胞假碱菌、固氮假单胞菌、威尼斯不动杆菌及鞘氨醇单胞菌中的一种或几种的组合；向菌悬液中加入生物炭，并混合均匀使石油烃降解菌充分吸附到生物炭上，得到生物炭‑菌液混合液；将海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与生物炭‑菌液混合液混合均匀，以进行交联固定化，再将所得混合液逐滴滴加到CaCl2‑硼酸溶液中，以NaCl水溶液对所得混合液进行清洗后，将混合液置于无菌培养基平板上，自然晾干。该方法简便易行，成本低廉，可操作性强；所得复合固定化菌剂机械强度和对石油烃降解效果优异。

Description

一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种复合固定化菌剂及其制备方法与应用，属于环境生物修复技术领域。
背景技术
石油作为世界三大能源之一，对人类的重要性不言而喻，但是在石油开采与利用的过程中难免造成泄漏，由于石油污染成分复杂、流动性差、生物毒性严重，会对水体、土壤以及人体健康造成严重危害。石油泄漏到土壤中，对表层土的污染最为严重，可以破坏土壤的结构，造成土壤通透性差，土壤颗粒黏连板结等问题，土壤呈现盐碱化。此外，石油污染土壤后，会造成土壤中碳含量增加，而氮和磷含量保持不变，所以会造成土壤中的碳、氮、磷含量失调，土壤中微生物的生长受到抑制。因此，对石油污染土壤的修复迫在眉睫。
石油污染的修复方法包括物理、化学和生物方法，其中，生物方法具有成本低、操作方便、对环境影响小、不造成二次污染等优势受到广发重视。但是由于石油烃中含有的大量有害物质，会对微生物的生长造成抑制。所以，如果直接把石油烃降解菌加入到土壤中，细菌的存活率较低，对石油的降解效果也较差。基于此，固定化微生物修复技术逐步兴起。
目前，对于微生物固定化技术，有两个方面的研究热点。一是固定化菌剂的实现技术，二是固定化载体材料的选择。固定化菌剂的实现技术按照固定化载体与细胞作用方式的不同，主要可分为吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。吸附法具有操作简单、细菌存活率高的优点被广发应用。常用的固定化载体材料包括：海藻酸盐、琼脂、卡拉胶、明胶、海绵、聚乙烯醇、硅藻土、高岭土、活性炭、麸皮、秸秆、稻米壳、椰子壳等。海藻酸钠、聚乙烯醇和麸皮均廉价易得，将高分子材料和天然有机质材料结合成一种复合材料，充分发挥各个材料的优势。麸皮具有微生物生存的碳氮比，可以为微生物提高良好的生存条件，海藻酸钠和聚乙烯醇具有较好的机械强度和硬度，可以保护吸附在麸皮生物炭上的细菌，所制备的固定化菌剂不易变形和遭到破坏。目前，固定化微生物技术均只固定了一种石油高效降解菌，如中国专利CN106148318A(申请号：201610524938.2)公开的固定化菌剂中仅采用了一种菌。不同细菌降解石油组分不同，复合菌群的降解效果要高于单一菌群。
因此，提供一种利用复合载体固定化复合菌群的技术已经成为本领域亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述的缺点和不足，本发明的一个目的在于提供一种复合固定化菌剂制备方法。
本发明的另一个目的还在于提供由以上复合固定化菌剂制备方法制备得到的复合固定化菌剂。
本发明的又一个目的还在于提供以上所述复合固定化菌剂在修复石油烃污染土壤中的应用。
为了实现以上目的，一方面，本发明提供了一种复合固定化菌剂的制备方法，其中，所述固定化菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备石油烃降解菌的菌悬液；其中，所述石油烃降解菌包括假单胞假碱菌、固氮假单胞菌、威尼斯不动杆菌及鞘氨醇单胞菌中的一种或几种的组合；
(2)向所述菌悬液中加入生物炭，并混合均匀以使石油烃降解菌充分吸附到生物炭上，得到生物炭-菌液混合液；
(3)将海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液混合均匀，以使海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭之间进行交联固定化，再将所得混合液逐滴滴加到CaCl2-硼酸溶液中，以NaCl水溶液对所得混合液进行清洗后，将混合液置于无菌培养基平板上，自然晾干，得到海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(1)中所述制备石油烃降解菌的菌悬液，包括：
将石油烃降解菌接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期后，用无菌的NaCl水溶液洗涤，再加入NaCl水溶液，得到菌悬液。
在以上所述的制备方法中，优选地，以所述LB液体培养基的总体积计算，所述石油烃降解菌的接种量为1‰。
在以上所述的制备方法中，优选地，当所述石油烃降解菌包括假单胞假碱菌、固氮假单胞菌、威尼斯不动杆菌及鞘氨醇单胞菌中的任意两种、任意三种以及四种时，每种石油烃降解菌的用量相同。
在以上所述的制备方法中，优选地，石油烃降解菌的菌悬液制备过程中，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。
在以上所述的制备方法中，优选地，石油烃降解菌的菌悬液制备过程中，所述LB液体培养基按照以下步骤制得：
称取10g的NaCl，10g的胰蛋白胨，5g的酵母浸粉，加入到1L蒸馏水中溶解，将所得混合液的pH值调至7.2-7.4后，于121℃灭菌20min，得到LB液体培养基。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(2)中，所述生物炭是以麸皮为原料，于300±10℃裂解2-3h后制得。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(2)中，混合均匀所需时间为2-3h。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(2)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述生物炭的质量浓度为1％-5％。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(3)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，海藻酸钠的浓度为1％-5％，聚乙烯醇的浓度为1％-3％。
在以上所述的制备方法中，优选地，所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液按照以下步骤制得：
将海藻酸钠及聚乙烯醇于NaCl水溶液中溶解均匀，于121℃灭菌20分钟后，得到所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液。
在以上所述的制备方法中，优选地，海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液制备过程中，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。
在以上所述的制备方法中，优选地，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述CaCl2-硼酸溶液的质量浓度为2％-4％。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(3)中，海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液的体积比为1:1-2:1。
在以上所述的制备方法中，优选地，所述CaCl2-硼酸溶液按照以下步骤制得：
向蒸馏水中加入CaCl2，再加入一定量的硼酸调节pH至6.8，得到所述CaCl2-硼酸溶液。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(3)中，交联固定化时间为15-30min。
在以上所述的制备方法中，优选地，步骤(3)中，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。
在以上所述的制备方法步骤(3)中，本发明对所用无菌培养基平板不做具体要求，其可以是任意商购获得的一次性无菌培养基。
另一方面，本发明还提供了以上所述复合固定化菌剂的制备方法制备得到的复合固定化菌剂。
又一方面，本发明还提供了以上所述复合固定化菌剂在修复石油烃污染土壤中的应用。
在以上所述的应用中，优选地，以未被石油烃污染的土壤的总重量为100％计，石油烃污染土壤中石油烃的质量含量范围为0.01％-0.2％；以石油烃污染土壤的总重量为100％计，复合固定化菌剂的添加量范围为0.1％-10％。
本发明所提供的该方法将石油烃降解菌与由麸皮高温热解制备得到的生物炭混合，再将所得混合物添加到聚乙烯醇和海藻酸钠的混合溶液中，其中海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭之间进行交联固定化，但海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭交联固定化以后，所得交联固化产物不会成形，再将交联固定化后所得到的溶液滴加到一定浓度的CaCl2溶液中，可以使其成小球状，最后再经一系列的后续处理即可得到海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂。
综上，本发明首次利用麸皮生物炭作为载体，并与海藻酸钠和聚乙烯醇结合，制备得到了机械强度和对石油烃降解效果更好的复合固定化菌剂。与传统制备固定化菌剂的方法相比，本发明所提供的该方法简便易行，成本低廉，可操作性强。
将本发明所制备得到的复合固定化菌剂添加到被石油污染的液体培养基和土壤中，测定该复合固定化菌剂对石油烃的降解情况。具体而言，利用该菌剂修复被石油烃污染液体培养基时，当石油质量浓度为5％时，添加质量浓度为2％的复合固定化菌剂，经过7d的培养实验，其对石油烃的降解率高达75.12％；在石油污染物质量浓度为0.98％的土壤中，当添加质量浓度为1％的复合固定化菌剂时，经过49d的培养，其对石油烃的降解率可达49％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例中B1、B2、B3、B4四种菌的生长曲线图。
图1b为本发明实施例中B1、B2、B3、B4四种菌在不同盐度下，在LB液体培养基中培养至对数期之后的OD值变化曲线图。
图1c为本发明实施例中B1、B2、B3、B4四种菌在不同pH条件下，在LB培养基中培养至对数期之后的OD值变化曲线图。
图1d-图1g分别为B1、B2、B3、B4四种菌在石油固体培养基上的形态。
图2a为本发明实施例中复合固定化菌剂4B1111未自然晾干前的示意图。
图2b为本发明实施例中复合固定化菌剂4B1111自然晾干后的示意图。
图3a为生物炭的扫描电镜图。
图3b为本发明实施例中复合固定化菌剂4B1111的扫描电镜图。
图4a为本发明应用例1中，单一菌体B1、B2、B3、B4在石油污染的液体培养基中的降解效果图。
图4b为本发明应用例1中，两种菌体的组合B1+B2、B1+B3、B1+B4、B2+B3、B2+B4、B3+B4在石油污染的液体培养基中的降解效果图。
图4c为本发明应用例1中，三种菌体的组合B1+B2+B3、B1+B2+B4、B2+B3+B4、B1+B3+B4在石油污染的液体培养基中的降解效果图。
图4d为本发明应用例1中，四种菌体按照不同体积比的组合4B1111、4B2111、4B1211、4B1121、4B1112在石油污染的液体培养基中的降解效果图。
图5a为本发明应用例2中，海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂4B1111于30℃，不同pH值(5、6、7、8、9、10、11)下在石油污染的液体培养基中的石油去除率数据图。
图5b为本发明应用例2中，海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂4B1111于pH＝8，不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)下在石油污染的液体培养基中的石油去除率数据图。
图6为本发明应用例3中，海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂4B1111在土壤中的石油去除率数据图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合以下具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
本实施例提供了一系列复合固定化菌剂制备方法，其中，所述制备方法包括以下具体步骤：
1)高效石油烃降解菌的筛选：从老化的油泥和石油污染的土壤中筛选高效石油降解菌，将10g油泥和土壤分别溶于无机盐培养基中，置于摇床中，在30℃条件下培养7天后，取10mL富集液于无机盐培养基中，以上步骤重复4次。驯化后得到高效的石油烃降解菌。取微量菌液涂布在LB培养基上划线纯化，得到纯菌后用20v％的甘油水溶液(其中体积分数以甘油水溶液的总体积为基准计算得到)，在-20℃下保藏；
所述无机盐培养基按照以下步骤制得：
准确称取20g NaCl，8.5g Na2HPO4·2H2O，3.0g KH2PO4，1.0g NH4Cl，溶于799mL蒸馏水中，得到目标培养基；
准确称取0.49g MgSO4·7H2O和0.011g CaCl2分别溶于100mL蒸馏水中，得到MgSO4·7H2O溶液、CaCl2溶液；
另外准确称取微量元素：0.04g CuSO4，0.1g KI，0.4g MnSO4·H2O，0.4g ZnSO4·7H2O，0.5g H3BO3，0.16g H2MoO4·2H2O，0.2g FeCl3·6H2O，溶于100mL蒸馏水中，得到微量元素液；
121℃灭菌20分钟后，无菌环境下，取1mL微量元素液、100mL MgSO4·7H2O溶液和CaCl2溶液，加入以上所述的目标培养基中。pH值调至8.0。
2)生物炭的制备：以麸皮为原料，在300℃下于马弗炉中高温裂解2h，制备得到生物炭。
3)石油烃降解菌的菌悬液的制备：将筛选得到的四株菌等量(体积接种量均为1‰)接种于100mL的LB液体培养基中，培养至对数生长期后，在5000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，用无菌的质量浓度为0.9％的NaCl溶液重复洗涤三次，去除培养基中残留的营养物质；再向离心、洗涤完的菌体中加入与LB液体培养基等量(100mL)的质量浓度为0.9％的NaCl溶液，分别记为溶液A-D，再对溶液A-D进行离心，弃去上清液，用质量浓度为0.9％的NaCl溶液重复洗涤三次，将所得菌体(分别记为菌体B1、B2、B3、B4)加入到75mL质量浓度为0.9％的NaCl溶液中，重悬即可得到单一的菌悬液，分别记为菌悬液B1、B2、B3、B4；
其中，所述的四株菌分别为：Pseudomonas pseudoalcaligenes strain(假单胞假碱菌)、Pseudomonas guguanensis strain(固氮假单胞菌)、Acinetobacter venetianus(威尼斯不动杆菌)、Sphingobacterium pakistanense strain(鞘氨醇单胞菌)，分别标记为B1、B2、B3、B4，四株混合菌标记为4B；
两株菌混合菌悬液的制备：取步骤3)溶液A-D中的任意两种，按照体积比为1:1的比例进行混合，且混合后菌悬液的最终体积为100mL，再对所得溶液进行离心，弃去上清液，用质量浓度为0.9％的NaCl溶液重复洗涤三次，将所得菌体(分别记为菌体B1+B2、B1+B3、B1+B4、B2+B3、B2+B4、B3+B4)加入到75mL质量浓度为0.9％的NaCl溶液中，重悬即可得到两株菌混合菌悬液，分别记为菌悬液B1+B2、B1+B3、B1+B4、B2+B3、B2+B4、B3+B4；
三株菌混合菌悬液的制备：将步骤3)溶液A-D中的任意三种，按照体积比为1:1:1的比例进行混合，且混合后菌悬液的最终体积为100mL，再对所得溶液进行离心，弃去上清液，用质量浓度为0.9％的NaCl溶液重复洗涤三次，将所得菌体(分别记为菌体B1+B2+B3、B1+B2+B4、B2+B3+B4、B1+B3+B4)加入到75mL质量浓度为0.9％的NaCl溶液中，重悬即可得到三株菌混合菌悬液，分别记为菌悬液B1+B2+B3、B1+B2+B4、B2+B3+B4、B1+B3+B4；
四株菌混合菌悬液的制备：将步骤3)中溶液A-D分别按照体积比为1:1:1:1、2:1:1:1、1:2:1:1、1:1:2:1、1:1:1:2的比例进行混合，且混合后菌悬液的最终体积为100mL，再对所得溶液进行离心，弃去上清液，用质量浓度为0.9％的NaCl溶液重复洗涤三次，将所得菌体(分别记为菌体4B1111、4B2111、4B1211、4B1121、4B1112)加入到75mL质量浓度为0.9％的NaCl溶液中，重悬即可得到三株菌混合菌悬液，分别记为菌悬液4B1111、4B2111、4B1211、4B1121、4B1112；
所述LB液体培养基按照以下步骤制得：称取NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，加入1L蒸馏水溶解，用0.1M NaOH将pH值调至7.2-7.4，分装至10个100mL锥形瓶中，121℃灭菌20分钟；
本实施例中，四种菌的生长曲线见图1a所示，从图1a中可以看出，B1在8h后进入对数增长期，15h后进入稳定期；B2、B3在10h左右进入对数增长期，20h进入稳定期；B4在18h之后进入对数增长期；30h进入稳定期。说明这四株菌都可以较快地进入对数增长期，起到良好的降解效果；
对以上所述四种菌分别进行菌株耐盐性试验及菌株耐碱性试验，其中，菌株耐盐性试验包括以下步骤：
以LB液体培养基为基础，将NaCl浓度分别设置为0.5％、2％、3％、5％、7％、9％、11％，接种量为1‰(以LB液体培养基的总体积计)，pH调至7.2-7.4，30℃、于恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值。实验结果如图1b所示。从图1b中可以看出，四种菌的最适盐度都在2％左右，且在盐度≤3％时均具有较好的生长活性。当盐度>3％时，菌株的生长活性下降，但盐度为7％时仍有活性，说明四菌株具有较高的耐盐性；
菌株耐碱性试验：以LB液体培养基为基础，将pH值分别设置为5、6、7、8、9、10、11，盐度设置为2％(LB液体培养基中氯化钠质量/配制LB液体培养基所用水质量)，接种量为1‰，30℃、于恒温摇床培养至对数期，于600nm波长处测定吸光度OD值。实验结果如图1c所示。从图1c中可以看出，四种菌的最适pH值为8。其中B1、B2在pH值为11时仍具有较高的生长活性，说明其耐碱性能非常强。当pH>9时，四株菌的生长活性急剧下降，pH值为10时生长活性较低，B3、B4在pH为11时，菌株不能生长。综合上述分析，四株菌具有良好的耐碱性；
向以上所述的无机盐培养基(1000mL)中加入20g琼脂，然后蒸汽(121℃)灭菌20min，冷却至50℃时倒平板，再均匀涂布0.1g原油于固体培养基表面，最后将四种菌分别涂布在以上所述固体培养基表面，四种菌在所述固体培养基表面的形态示意图分别如图1c-图1g所示。从图1c-图1g中可以看出，这四株菌在原油固体培养基上均可以形成溶油圈，表明其均具有良好的降解石油的效果。
4)将菌吸附到生物炭上：往步骤3)所述的菌悬液中加入3g生物炭，混匀3h。让细菌充分吸附到生物炭上，得到生物炭-菌液混合液。
5)海藻酸钠与聚乙烯醇的混合液的制备：于锥形瓶中加入2g海藻酸钠，1g聚乙烯醇，加入25mL质量浓度为0.9％NaCl溶液，121℃灭菌20分钟，待冷却后摇匀备用。
6)4％CaCl2-硼酸溶液的配置：向100ml蒸馏水中加入4g CaCl2，再加入一定量的硼酸调节pH为6.8，得到4％CaCl2-硼酸溶液。
7)复合菌剂的固定化：将步骤5)所述的海藻酸钠与聚乙烯醇的混合液与步骤4)所述生物炭-菌液混合液混合，置于摇床中，混匀30min后，用胶头滴管逐滴滴加到步骤6)所述的4％CaCl2-硼酸溶液中。再用质量浓度为0.9％NaCl洗三次后置于一次性培养基上，自然晾干，即可得到海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂，分别记为菌剂B1、B2、B3、B4、B1+B2、B1+B3、B1+B4、B2+B3、B2+B4、B3+B4、B1+B2+B3、B1+B2+B4、B2+B3+B4、B1+B3+B4、4B1111、4B2111、4B1211、4B1121、4B1112；其中，该4B1111未自然晾干前的示意图如图2a所示，自然晾干后的示意图如图2b所示，从图2a及图2b中可以看出，所制备得到的海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂均为球形，且大小均匀。
将实施例所得到的以上菌剂置于质量浓度为2.5％(以配制戊二醛水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准)的戊二醛水溶液中固定3h(也可以固定过夜)，然后用磷酸缓冲溶液清洗3次，每次清洗5min；再分别用30v％、50v％、70v％、80v％、90v％、100v％的乙醇(体积分数以溶液总体积为基准计算得到)脱水，每次15min；最后置于超净台上吹干，采用扫描电子显微镜观察菌株的固定效果。其中，生物炭及4B1111的扫描电镜图分别如图3a-图3b所示。从图3a中可以看出，生物炭上存在孔隙结构，有利于细菌附着；从图3b中可以看出，四株菌都很好地固定在了生物炭表面。
对比例
本对比例提供了一系列复合固定化菌剂制备方法，其中，该制备方法与实施例所提供的制备方法的区别仅在于：海藻酸钠、聚乙烯醇、生物炭或氯化钙的用量不同，对比例及实施例中，海藻酸钠、聚乙烯醇、生物炭及氯化钙的用量如下表1所示。
表1
Figure BDA0002373570610000091
Figure BDA0002373570610000101
注：以上表1中的各组分的用量百分比是以配制菌悬液所用的0.9％的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合液所用的0.9％的NaCl溶液的质量之和(近似为100g)为基准计算得到的。
从以上表1中可以看出，当海藻酸钠质量浓度为2％、聚乙烯醇质量浓度为1％，生物炭的质量浓度为3％、CaCl2的质量浓度为4％时，制备得到的复合固定化菌剂(固定化小球)效果最佳，其机械强度大，弹性大，且不容易变形；当海藻酸钠、聚乙烯醇、生物炭或CaCl2的添加浓度过高、过低或者不添加时，都会导致固定化小球不成球，机械强度小，容易变形等问题。
应用例1
本应用例将实施例所提供的菌体分别用于修复石油烃污染土壤，具体包括以下步骤：
向实施例步骤1)中所述无机盐培养基中加入质量浓度为5％(以所述无机盐培养基的总重为基准计算得到)的原油，再向添加原油后的无机盐培养基中分别添加质量浓度为2％(以所述添加原油后的无机盐培养基的总重量为基准计算得到)的以上所述各菌体(或者菌体组合)，在pH值为8，温度为30℃的条件下进行降解实验，7d后测定降解率。
本应用例中所得到的以上各菌体在石油污染的液体培养基中的石油降解率数据如图4a-图4d所示。从图4a-图4d中可以看出，本发明实施例中所提供的菌体在液体培养基中的降解效果都在20％以上，属于高效的石油烃降解菌；且四株菌任意混合之后所得菌的降解效果显著提升，大于单一菌种的降解效果；其中，四株菌以1:1:1:1体积比混合后所得到的菌体的降解效果最好，降解率可达到38.12％。
应用例1中，石油烃降解率的测定可按照以下步骤进行：取20mL降解完成之后的石油液体培养基，用1:1的H2SO4(H2SO4:蒸馏水＝1:1，体积比)酸化至pH为2，加入1g的NaCl用于破乳化，然后加入20mL二氯甲烷，于60w条件下超声萃取15min，再用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20mL二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相至已知重量的干燥圆底烧瓶内，旋转蒸发仪在35℃条件下将圆底烧瓶中的二氯甲烷溶剂蒸干，再称取圆底烧瓶的重量。根据前后两次圆底烧瓶的质量差计算石油烃降解率。
应用例2
本应用例将实施例所提供的菌剂4B1111用于修复石油烃污染土壤，具体包括以下步骤：
向实施例步骤1)中所述无机盐培养基中加入质量浓度为5％(以所述无机盐培养基的总重为基准计算得到)的原油，再向添加原油后的无机盐培养基中分别添加质量浓度为2％(以所述添加原油后的无机盐培养基的总重量为基准计算得到)的所述菌剂4B1111，分别在30℃，不同pH值(5、6、7、8、9、10、11)和pH＝8，不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)下进行降解实验，7d后测定去除率。
本应用例中所得到的菌剂4B1111在石油污染的液体培养基中的石油去除率数据如图5a-图5b所示。从图5a-图5b中可以看出，海藻酸钠和聚乙烯醇固定化后所得到的海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂在液体培养基中的降解效果大大提高，石油去除率可以达到75％以上，高达75.12％(pH＝8，温度为30℃下得到的数据)。
应用例2中，石油烃去除率的测定可按照以下步骤进行：取20mL降解完成之后的石油液体培养基，用1:1的H2SO4(H2SO4:蒸馏水＝1:1，体积比)酸化至pH为2，加入1g的NaCl用于破乳化，然后加入20mL二氯甲烷，于60w条件下超声萃取15min，再用分液漏斗将水相和有机相分离，剩余水相中再添加20mL二氯甲烷，重复上述超声萃取过程，此过程进行三次，收集有机相至已知重量的干燥圆底烧瓶内，旋转蒸发仪在35℃条件下将圆底烧瓶中的二氯甲烷溶剂蒸干，再称取圆底烧瓶的重量。根据前后两次圆底烧瓶的质量差计算石油烃去除率。
应用例3
本应用例将实施例所提供的4B1111用于修复石油烃污染土壤，具体包括以下步骤：
将含原油0.98wt％(以未被石油烃污染的土壤的总重量为基准计算得到)的石油污染土壤的含水率调整至20-30％，按质量比为1％(以石油污染土壤的总重量为基准计算得到)加入4B1111，混合均匀；在人工气候箱中，于25℃条件下修复49d。修复过程中，土壤含水率维持在20-30％，每隔一周测定一次去除率。
应用例3中，海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂在土壤中的石油去除率数据如图6所示，从图6中可以看出，添加海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭制备得到的复合固定化菌剂，对土壤中的石油烃降解效果也大大提高，具体而言，经过49d的降解后，其对土壤中石油烃的去除率可以达到45％以上，可达到49％。
应用例3中，土壤中石油烃去除率的测定可按照以下步骤进行：用二氯甲烷浸泡后的滤纸将10g左右经风干后的土壤样品(过50目筛)包严，置于索氏提取筒中。量取100mL二氯甲烷，加入到已知重量的干燥圆底烧瓶内，进行24h索氏萃取，萃取结束后，用旋转蒸发仪在35℃条件下将圆底烧瓶中的二氯甲烷溶剂蒸干，再称取圆底烧瓶的重量。根据前后两次圆底烧瓶的质量差计算石油烃去除率。
以上所述，仅为本发明的具体实施例，不能以其限定发明实施的范围，所以其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修饰，都应仍属于本专利涵盖的范畴。另外，本发明中的技术特征与技术特征之间、技术特征与技术发明之间、技术发明与技术发明之间均可以自由组合使用。

Claims (12)

1.一种复合固定化菌剂的制备方法，其特征在于，所述固定化菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备石油烃降解菌的菌悬液；其中，所述石油烃降解菌为假单胞假碱菌、固氮假单胞菌、威尼斯不动杆菌及鞘氨醇单胞菌中的三种或四种的组合，且每种石油烃降解菌的用量相同；
(2)向所述菌悬液中加入生物炭，并混合均匀以使石油烃降解菌充分吸附到生物炭上，得到生物炭-菌液混合液；
步骤(2)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述生物炭的质量浓度为1％-5％；
(3)将海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液混合均匀，以使海藻酸钠、聚乙烯醇和生物炭之间进行交联固定化，再将所得混合液逐滴滴加到CaCl2-硼酸溶液中，以NaCl水溶液对所得混合液进行清洗后，将混合液置于无菌培养基平板上，自然晾干，得到海藻酸钠-聚乙烯醇-生物炭复合固定化菌剂；
所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液按照以下步骤制得：
将海藻酸钠及聚乙烯醇于NaCl水溶液中溶解均匀，于121℃灭菌20分钟后，得到所述海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％；
步骤(3)中，以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，海藻酸钠的浓度为1％-5％，聚乙烯醇的浓度为1％-3％；
以配制菌悬液所用的NaCl溶液及配制海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液所用的NaCl溶液的质量之和为100％计，所述CaCl2-硼酸溶液的质量浓度为2％-4％；
步骤(3)中，海藻酸钠与聚乙烯醇的混合NaCl水溶液与所述生物炭-菌液混合液的体积比为1:1-2:1；
步骤(3)中，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述制备石油烃降解菌的菌悬液，包括：
将石油烃降解菌接种于LB液体培养基中，培养至对数生长期后，用无菌的NaCl水溶液洗涤，再加入NaCl水溶液，得到菌悬液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以所述LB液体培养基的总体积计算，所述石油烃降解菌的接种量为1‰。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，以配制NaCl水溶液所用蒸馏水的总重量为计算基准，所述NaCl水溶液的质量浓度为0.9％。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基按照以下步骤制得：
称取10g的NaCl，10g的胰蛋白胨，5g的酵母浸粉，加入到1L蒸馏水中溶解，将所得混合液的pH值调至7.2-7.4后，于121℃灭菌20min，得到LB液体培养基。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物炭是以麸皮为原料，于300±10℃裂解2-3h后制得。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，混合均匀所需时间为2-3h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述CaCl2-硼酸溶液按照以下步骤制得：
向蒸馏水中加入CaCl2，再加入一定量的硼酸调节pH至6.8，得到所述CaCl2-硼酸溶液。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，交联固定化时间为15-30min。
10.权利要求1-9任一项所述复合固定化菌剂的制备方法制备得到的复合固定化菌剂。
11.权利要求10所述复合固定化菌剂在修复石油烃污染土壤中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，以未被石油烃污染的土壤的总重量为100％计，石油烃污染土壤中石油烃的质量含量范围为0.01％-0.2％；以石油烃污染土壤的总重量为100％计，复合固定化菌剂的添加量范围为0.1％-10％。
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