CN109628353B - 一种生物炭基固定化微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物炭基固定化微生物菌剂及其制备方法与应用。生物炭基固定化微生物菌剂包括生物炭基材料，以及生物炭基材料上吸附的菌体以及营养剂，所述菌体为分支杆菌CSC‑6(Mycobacterium sp.CSC‑6)，在2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC No.M 2017726。所述生物炭基固定化微生物菌剂用于降解石油。与现有技术相比，本发明通过固定吸附菌剂+营养剂的方式制备的菌剂对石油烃有较高的降解能力，降解含1.0wt％的石油的污水7天后，降解率可达83.5％，相比于单纯菌剂的降解率52.0％具有较大幅度的提高。同时，生物炭基固定化微生物菌剂更有利于活性菌的保存。

Description

一种生物炭基固定化微生物菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，尤其是涉及一种生物炭基固定化微生物菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着石油及其衍生物在日常生活中越来越广泛的应用，石油在开采、炼化及运输过程中所造成的环境污染问题也日益突出，因此修复石油污染物的任务刻不容缓。目前，生物修复技术因具有操作简单、成本低廉、不破坏土壤环境、无二次污染且处理效果好等优点，成为石油污染修复领域最具发展前景的技术。传统的生物修复技术是通过直接添加石油降解菌株处理石油等污染物，从而达到净化修复对象的目的。但该种方式也存在诸多的问题，例如外来石油降解菌与土著菌的恶性竞争会大大降低降解菌分解石油的能力；石油烃的可生物利用性低致使降解菌不易存活；降解菌受施用环境的影响菌株活性大大降低等。为了改善菌株的生长条件以及提高菌株在施用环境中的存活率和降解石油的能力，很多研究人员提出通过物理吸附、包埋法、交联法等方式将菌株负载于载体上来解决以上问题。
目前研究较多的传统载体主要有无机材料(如高岭土、硅藻土、煤渣、微孔玻璃等)，有机材料(如聚乙烯醇、聚氨酯等)，天然材料(海藻酸钠、卡拉胶、壳聚糖等)。但这些载体因存在寿命短、吸附能力小、容易造成二次污染等劣势，而未能广泛的应用于实际的修复项目中。因此，获得一种具有吸附能力强、绿色无污染的微生物载体，对生物修复技术的广泛应用具有关键性的作用。生物炭是使用农业废弃物在限氧条件下通过高温热解产生的一种多孔碳材料，具有比表面积大、吸附能力强等优点，其良好的透气性和锁水性还有助于改善微生物的生存环境，促进其对污染物的修复。使用生物炭作为生物修复技术中微生物的载体，不仅能够提高微生物的存活能力和降解石油的能力，而且还解决了农业废弃物的归置问题，是一种绿色环保、合理利用资源和值得广泛推广的技术。
中国专利CN106148318A公开了一种生物炭固定化菌剂的制备与应用，制备步骤包括：将降解石油的微生物依次进行种子液培养和液态发酵培养，得发酵液；将发酵液与生物炭进行混合吸附，制得生物炭固定化微生物菌剂。将该菌剂应用于油泥砂及石油污染土壤中，对石油去除率有一定的提高，较单独微生物修复去除率提高20-30％，且以农业废弃物作为载体，成本低廉。
中国专利CN104946620A公开了一种用于修复石油烃污染盐碱化土壤的微生物固定化菌剂及制备方法，该方法利用从盐碱化石油污染土壤中筛选出的一株耐盐碱石油烃降解菌，以生物炭为载体，并添加海藻酸钠制成固定化菌球，用来处理石油烃污染土壤。该发明具有工艺简单、降解菌优势明显并有较好的稳定性，可提高盐碱土壤中石油烃的降解效率。
中国专利CN107574162A公开了一种基于生物炭缓释营养基固定化菌剂的制备方法，该发明通过受控造孔联合表面碱化改性生物炭，并将生物炭浸泡于缓释膜原溶液中形成缓释膜层，晾干后用于炭基固定化微生物菌剂的制备。该方法制备的生物炭菌剂，通过缓慢释放，持续为微生物的降解过程提供营养元素，降低营养物质随着降水过程的流失，同时促进微生物有效挂膜，提高了污染物的微生物降解效率。以上专利中提供的生物炭菌剂在制备方法上主要是通过生物炭的吸附作用，具有方法简单、容易操作的优点。
在提高菌剂降解能力或存活能力方面主要通过改性生物炭载体或将生物炭菌剂制成菌球的方式。其中改性生物炭载体的操作繁琐，成本较高；而将生物炭菌剂制成菌球，仅在菌剂的保存上具有一定的优势，在实际应用过程中，菌剂外部的包裹材料容易阻碍菌株与污染物的接触，提高菌剂的降解能力非常有限。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有高效降解石油能力的生物炭基固定化微生物菌剂及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一株菌株，为分支杆菌CSC-6(Mycobacterium sp.CSC-6)，该菌株在2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，其保藏编号是：CCTCC No.M 2017726。
该菌株已经在申请号为201711462501.1，公开号为CN 108300674 A，专利名称为“一种石油降解菌及其获得方法和在降解原油中的应用”的中国专利申请公开。
所述菌株是从石油污染土壤中筛选出来的。
本发明提供一种生物炭基固定化微生物菌剂，包括生物炭基材料，以及生物炭基材料上吸附的菌体，所述菌体为分支杆菌CSC-6(Mycobacterium sp.CSC-6)。
所述生物炭基固定化微生物菌剂，还包括生物炭基材料上吸附的营养剂。
营养剂溶液包括以下含量比例的组分：
油酸0.4-0.8mL，甘油1.0-3.0g，柠檬酸钠0.2-0.4g，磷酸氢二钠1.0-1.5g，磷酸二氢钾1.0-1.5g，硫酸铵0.5-1.0g，硫酸锌0.5-1.0mg，氯化钙0.5-1.0mg，硫酸铜0.5-1.0mg，硫酸镁15-25.0mg。
进一步，所述生物炭基材料包括生物炭。
本发明提供所述生物炭基固定化微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
挑取如权利要求1所述菌株(即从石油污染土壤中筛选出来的Mycobacteriumsp.CSC-6)于1#液体培养基中活化，取活化后的菌液于2#液体培养基中扩大培养得到种子液，将种子液加入含有2#液体培养基的发酵罐中发酵培养后，脱水得到浓缩菌液；
将一定量的浓缩菌液加入含有生物炭基材料的3#液体培养基，混合吸附一定时间后，使用碟式离心机脱水去除多余的培养基初步得到生物炭基菌剂，
将该生物炭基菌剂加入一定量的营养剂吸附一定时间后，冷冻干燥或风干制得最终所述生物炭基固定化微生物菌剂。
进一步优选地，每100g生物炭基材料使用的浓缩菌液是1g，使用的营养剂溶液是50g。
本发明提供所述生物炭基固定化微生物菌剂的制备方法的一种具体步骤如下：
(一)使用接种环从保存分支杆菌CSC-6(Mycobacterium sp.CSC-6)的LB固体平板上，挑取一环菌株接种于5-10mL的1#液体培养基中，在20-35，℃转速为120-150r/min的振荡培养箱中活化24-48h；
1#液体培养基的组成为：蛋白胨8.0-12.0g，酵母粉4.0-6.0g，氯化钠8.0-12.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4。
(二)按照体积比1-5％的接种量取活化后菌液接种于2#液体培养基中，在20-35，℃转速为120-150r/min的振荡培养箱中扩大培养24-48h，得到种子液。
2#液体培养基的组成为：葡糖糖15.0-20.0g，蛋白胨15.0-20.0g，酵母粉8.0-10.0g，原油0-2.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4。
(三)按照体积比5-10％的接种量取种子液加入到装有2#液体培养基的5.0L的发酵罐中，培养条件为：通风比0.4-0.8vvm，搅拌速度200-300r/min，温度20-35，℃pH 7.2-7.4，发酵时间24-48h，发酵结束后，在5000-8000r/min的高速离心机上离心，去除发酵液，获得1#菌剂。
(四)将1#菌剂按照体积比0.1-0.25％的量加入3#液体培养基中，在20-35℃，转速为120-150r/min的振荡培养箱中培养2-8h后，加入10-50％的生物炭载体，继续振荡12-24h后，使用碟式离心机去除多余3#液体培养基获得2#菌剂。
3#液体培养基的组成为：蔗糖4.0-6.0g，牛肉膏2.0-4.0g，酵母粉0.5-1.0g，去离子水1000mL，原油0-2.0g，pH 7.2-7.4。
(五)加入50-100％的营养剂溶液于2#菌剂中，吸附2-4h后，置于冷冻干燥机内或自然风干去除多余水分，得到3#菌剂。
所述营养剂溶液的组成为：油酸0.4-0.8mL，甘油1.0-3.0g，柠檬酸钠0.2-0.4g，磷酸氢二钠1.0-1.5g，磷酸二氢钾1.0-1.5g，硫酸铵0.5-1.0g，硫酸锌0.5-1.0mg，氯化钙0.5-1.0mg，硫酸铜0.5-1.0mg，硫酸镁15-25.0mg。
(六)将1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂按照质量比1-5％加入含有1.0-10.0wt％的石油污水中，在20-35，℃转速为120-150r/min的振荡培养箱中降解7天。对含有1.0-10.0％的污水中石油的降解，1#菌剂的降解率为18.2-52.0％，2#菌剂的降解率为25.4-72.0％，3#菌剂的降解率为33.7-83.5％。
将1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂分别在4℃、室温和30℃下储存6个月后，其中活性菌的剩余率分别为：1#菌剂为40.3-22.3％，2#菌剂为69.8-48.1％，3#菌剂为86.3-71.7％。
通过降解石油污染物的实验表明，所述生物炭基固定化微生物菌剂对水体中石油污染物的降解能力较单菌剂提高15-31％左右。将菌剂分别在4℃、室温和30℃下保存6个月后，所述生物炭基固定化微生物菌剂中的活菌数比单菌剂高34-64％左右。
本发明提供的所述生物炭基固定化微生物菌剂用于降解石油。
与现有技术相比，本发明通过固定吸附菌剂+营养剂的方式制备的3#菌剂对石油烃有较高的降解能力，降解含1.0wt％的石油的污水7天后，降解率可达83.5％，相比于1#菌剂的降解率52.0％具有较大幅度的提高。
利用本发明的制备方法制备的3#菌剂，与1#菌剂和2#菌剂在相同条件下储存6个月后，3#菌剂中的活性生物量损失的较少，说明制备3#菌剂的方式更有利于活性菌的保存。
附图说明
图1：生物炭基材料的扫描电镜图；
图2：实施例中3#菌剂的扫描电镜图；
图3：生物炭菌剂对水体中含有1.0wt％的石油降解7天后的降解率；
图4：生物炭菌剂对水体中含有10.0wt％的石油降解7天后的降解率；
图5：生物炭菌剂在不同条件下储存6个月后的菌活性剩余率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
分支杆菌Mycobacterium sp.CSC-6的发酵培养
使用接种环从保存Mycobacterium sp.CSC-6的LB固体平板上，挑取一环菌株接种于5mL的1#液体培养基(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4)中，在30，℃转速为120r/min的振荡培养箱中活化48h。
取8mL活化后的CSC-6菌液加入400mL的2#液体培养基(葡糖糖20.0g，蛋白胨20.0g，酵母粉10.0g，原油2.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4)中，在30，℃转速为120r/min的振荡培养箱中扩大培养48h，得到种子液。
取400mL种子液加到装有3.6L的2#液体培养基的发酵罐中，培养条件为：通风比0.5vvm，搅拌速度200r/min，温度30，℃pH 7.2-7.4，发酵时间48h。发酵结束后，在5000r/min的高速离心机上离心，去除发酵液，获得1#菌剂。
实施例2
称取1.0g的1#菌剂加入1000mL的3#液体培养基(蔗糖5.0g，牛肉膏3.0g，酵母粉1.0g，去离子水1000mL，石油2.0g，pH 7.2-7.4)中，在30℃，转速为120r/min的振荡培养箱中培养4h后，加入100g的生物炭载体，生物炭载体的微观结构如图1所示，继续振荡24h后，使用碟式离心机去除多余3#液体培养基获得2#菌剂。
加入50g的营养剂溶液(油酸0.4mL，甘油1.0g，柠檬酸钠0.2g，磷酸氢二钠1.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸铵0.5g，硫酸锌0.5mg，氯化钙0.5mg，硫酸铜0.5mg，硫酸镁15.0mg)于2#菌剂中，吸附2h后，置于冷冻干燥机内去除多余水分，得到3#菌剂。3#菌剂微观图如图2所示。
实施例3
生物炭基复合菌剂降解性能
采用实施例1、2制备的1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂分别进行降解水体中石油污染物的实验。配制含有1.0wt％石油的无机盐培养基(1.00g/L NH4Cl，0.05g/L CaCl2，0.10g/LMgSO4.7H2O，1.00g/L K2HPO4，1.00g/L KH2PO4)100mL，加入1#菌剂0.01g为实验组1，加入2#菌剂1.0g为实验组2，加入3#菌剂1.0g为实验组3，加入1.0g生物炭+营养剂(油酸0.4mL，甘油1.0g，柠檬酸钠0.2g，磷酸氢二钠1.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸铵0.5g，硫酸锌0.5mg，氯化钙0.5mg，硫酸铜0.5mg，硫酸镁15.0mg)为对照组1，加入1.0g生物炭为对照组2，不加菌剂为对照组3，在30，℃转速为120r/min的振荡培养箱中降解7天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过重量法分别分析实验组和对照组，结果如图3所示。1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂对1.0％的石油的降解率分别为52.0％、72.0％、83.5％。
实施例4
采用实施例1、2制备的1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂分别进行降解水体中石油污染物的实验。配制含有10.0wt％石油的无机盐培养基(1.00g/L NH4Cl，0.05g/L CaCl2，0.10g/LMgSO4.7H2O，1.00g/L K2HPO4，1.00g/L KH2PO4)100mL，加入1#菌剂0.01g为实验组1，加入2#菌剂1.0g为实验组2，加入3#菌剂1.0g为实验组3，加入1.0生物炭+营养剂(油酸0.4mL，甘油1.0g，柠檬酸钠0.2g，磷酸氢二钠1.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸铵0.5g，硫酸锌0.5mg，氯化钙0.5mg，硫酸铜0.5mg，硫酸镁15.0mg)为对照组1，加入1.0g生物炭为对照组2，不加菌剂为对照组3，在30，℃转速为120r/min的振荡培养箱中降解7天后，用正己烷萃取剩余石油烃。通过重量法分别分析实验组和对照组，结果如图4所示。1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂对10.0％的石油的降解率分别为18.3％、25.4％、33.7％。
实施例5
将通过冷冻干燥制备的1#菌剂6.0g、2#菌剂60.0g和3#菌剂60.0g，分别分成三等份装于自封袋中，并分别储存于4℃、室温和30℃下。6个月后，采用脂磷法测定吸附具有活性的生物量，并对照初始的活性生物量，得出菌剂中活性菌的剩余率。结果如图5所示。1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂在4℃下储存6个月后活性菌剩余率分别为40.3％，69.8％，86.3％；1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂在室温下储存6个月后活性菌剩余率分别为31.3％，64.0％，74.0％；1#菌剂、2#菌剂、3#菌剂在30℃下储存6个月后活性菌剩余率分别为22.3％，48.1％，71.7％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种生物炭基固定化微生物菌剂，其特征在于，包括生物炭基材料，以及生物炭基材料上吸附的菌体和营养剂，所述菌体为分支杆菌CSC-6(Mycobacterium sp.CSC-6)，分支杆菌CSC-6在2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，其保藏编号是：CCTCC No.M 2017726；
营养剂溶液包括以下含量比例的组分：
油酸0.4-0.8mL，甘油1.0-3.0g，柠檬酸钠0.2-0.4g，磷酸氢二钠1.0-1.5g，磷酸二氢钾1.0-1.5g，硫酸铵0.5-1.0g，硫酸锌0.5-1.0mg，氯化钙0.5-1.0mg，硫酸铜0.5-1.0mg，硫酸镁15-25.0mg；
所述生物炭基材料包括生物炭。
2.一种如权利要求1所述生物炭基固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
挑取分支杆菌CSC-6活化，取活化后的菌液扩大培养得到种子液，将种子液发酵培养后，脱水得到浓缩菌液；
将浓缩菌液加入含有生物炭基材料的液体培养基，混合吸附后，脱水去除多余的培养基初步得到生物炭基菌剂，
将该生物炭基菌剂加入营养剂吸附，制得最终所述生物炭基固定化微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述生物炭基固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，每100g生物炭基材料使用的浓缩菌液是1g，使用的营养剂溶液是50g。
4.根据权利要求2所述生物炭基固定化微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(一)使用接种环从保存分支杆菌CSC-6(Mycobacterium sp.CSC-6)的LB固体平板上，挑取一环菌株接种于5-10mL的1#液体培养基中，在20-35℃，转速为120-150r/min的振荡培养箱中活化24-48h；
(二)按照体积比1-5％的接种量取活化后菌液接种于2#液体培养基中，在20-35℃，转速为120-150r/min的振荡培养箱中扩大培养24-48h，得到种子液；
(三)按照体积比5-10％的接种量取种子液加入到装有2#液体培养基的5.0L的发酵罐中，培养条件为：通风比0.4-0.8vvm，搅拌速度200-300r/min，温度20-35℃，pH 7.2-7.4，发酵时间24-48h，发酵结束后，在5000-8000r/min的高速离心机上离心，去除发酵液，获得1#菌剂；
(四)将1#菌剂按照体积比0.1-0.25％的量加入3#液体培养基中，在20-35℃，转速为120-150r/min的振荡培养箱中培养2-8h后，加入10-50％的生物炭载体，继续振荡12-24h后，使用碟式离心机去除多余3#液体培养基获得2#菌剂；
(五)加入50-100％的营养剂溶液于2#菌剂中，吸附2-4h后，置于冷冻干燥机内或自然风干去除多余水分，得到3#菌剂，即所述生物炭基固定化微生物菌剂；
1#液体培养基的组成为：蛋白胨8.0-12.0g，酵母粉4.0-6.0g，氯化钠8.0-12.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4；
2#液体培养基的组成为：葡萄糖15.0-20.0g，蛋白胨15.0-20.0g，酵母粉8.0-10.0g，原油0-2.0g，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4；
3#液体培养基的组成为：蔗糖4.0-6.0g，牛肉膏2.0-4.0g，酵母粉0.5-1.0g，去离子水1000mL，原油0-2.0g，pH 7.2-7.4；
所述营养剂溶液的组成为：油酸0.4-0.8mL，甘油1.0-3.0g，柠檬酸钠0.2-0.4g，磷酸氢二钠1.0-1.5g，磷酸二氢钾1.0-1.5g，硫酸铵0.5-1.0g，硫酸锌0.5-1.0mg，氯化钙0.5-1.0mg，硫酸铜0.5-1.0mg，硫酸镁15-25.0mg。
5.权利要求1所述生物炭基固定化微生物菌剂的应用，其特征在于，所述生物炭基固定化微生物菌剂用于降解石油。
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