CN105039211A - 一株多环芳烃去除复合材料、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多环芳烃去除复合材料，其有效成分包括:Mycobacterium？gilvum菌，保藏号为CGMCC？No.10941。制备方法为：将培养的Mycobacterium？gilvum菌(保藏号为CGMCC？No.10941)的种子液接种于装有生物炭的容器中，并于摇床振荡培养进行浸泡固定化后即得。可用于去除或降解土壤或水环境中的多环芳烃；在多环芳烃和重金属复合污染或多环芳烃单独污染的土壤或水环境中进行生物修复。

Description

一株多环芳烃去除复合材料、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，尤其涉及一株多环芳烃去除复合材料、制备方法及其用途。

背景技术

近年来，我国土壤的PAHs污染情况不容乐观，从不同区域土壤中检测到的PAHs残留平均值远高于其他发达国家，其中4环及以上的高分子量PAHs污染物占到总量的60%以上，这部分PAHs在土壤中半衰期长，毒性大并难于降解。当前对多环芳烃污染场地的修复主要有物理方法、化学方法、生物方法及联合修复。其中生物修复因具有成本低、无二次污染等优势而具有较大的应用潜力，而大量研究表明，在生物修复中，微生物修复是去除污染场地中多环芳烃的有效方法。但在PAHs污染场地中，具有多环芳烃降解能力的功能微生物丰度较低，因此从污染场地中筛选、分离出PAHs高效降解菌对实现污染场地修复的关键技术之一。

当前有较多的科研工作者已从PAHs污染场地筛选、分离得到较多PAHs降解菌，且后期的功能微生物投加生物强化修复具有一定的效用；但游离的功能微生物因无法适应环境不易存活或存活时间较短因而影响了PAHs去除效果。因此在利用功能微生物修复PAHs污染土壤时，需要一些辅助手段来增强功能微生物的作用。

针对微生物来说，较多研究者认为生物炭疏松多孔的结构可为微生物提供一个良好的生境，从而提高微生物对污染物的耐性，同时避免捕食者的捕食，进而能较好的存活于污染场地中。同时生物炭作为载体材料，其较强的吸附能力能吸附固定较多的功能微生物，进而提高功能微生物在污染场地中的丰度。另外生物炭由于具有可增强土壤肥力、改善土壤理化性质、增加农作物产量、促进土壤微生物生长的良好品质被认为是一种良好的土壤改良剂。再者生物炭因良好的吸附性能可吸附土壤中部分污染物而降低其生物有效性从而降低污染物风险。综上所述，生物炭可作为微生物固定化良好的载体材料。因此以生物炭作为载体材料固定化功能微生物，进而制备得菌株与生物炭的复合材料用于修复PAHs污染场地，复合材料可增强功能微生物的生物强化修复作用，能够实现PAHs污染场地的有效缓解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能去除或降解土壤或水环境中的多环芳烃；在多环芳烃和重金属复合污染或多环芳烃单独污染的土壤或水环境中进行生物修复的多环芳烃去除复合材料。

为实现上述目的，本发明提供一种多环芳烃去除复合材料，其特征在于，有效成分包括:Mycobacteriumgilvum菌，其的保藏号为CGMCCNo.10941。

另一方面，提供一种所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，将培养的Mycobacteriumgilvum菌的种子液接种于装有生物炭的容器中，并于摇床振荡培养进行浸泡固定化后即得，所述菌的保藏号为CGMCCNo.10941；所述装有生物炭的容器中还含有LB培养基；所述接种重量体积比例为生物炭:种子液=1:5-1:20；优选的，为8:1-12:1。

进一步，所述种子液的制备为：于三角瓶中接种活化后的Mycobacteriumgilvum菌液，接种后的三角瓶置于30℃，180r/min摇床中震荡培养至对数期OD₆₀₀为0.8，对数期菌液3000r/min离心5min，弃上清液后再加入等量已灭菌的LB培养液并重悬，新得到的菌液即为种子液；优选接种量为1体积%。

进一步，所述生物炭为将称取过2mm筛的生物炭加入到三角瓶中，再向三角瓶加入新鲜配制的LB培养液，高温灭菌后放置直至其温度降至室温。

进一步，所述生物炭为豆杆、水稻杆残余制备的多孔生物炭。

进一步，所述摇床震荡培养的条件为30℃，80r/min摇床中震荡培养48h。

进一步，所述浸泡固定化后还有清洗去杂质的步骤，具体为用灭过菌的200目滤网将完成浸泡固定的复合材料过滤，并用无菌水分多次冲洗载体材料；优选3次冲洗，即得。

还一方面，本发明提供一种所述多环芳烃去除复合材料用于去除或降解多环芳烃的用途；优选的，所述用途是指去除或降解土壤或水环境中的多环芳烃的用途；

任选的，所述土壤或水为重金属和多环芳烃污染的土壤或水。

还一方面，本发明提供一种所述多环芳烃去除复合材料在多环芳烃和重金属复合污染或多环芳烃单独污染的土壤或水环境中生物修复中的应用。

进一步，所述土壤或水有重金属和多环芳烃复合污染或多环芳烃单独污染。

本发明所述菌株的菌落橘黄色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。菌体呈短杆状，0.4μm×0.8–1.5μm，单个或成对排列，革兰氏阳性（见图1和图2）。能够利用葡萄糖酸钾和甘露醇为碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露醇产酸，过氧化氢酶、脲酶实验阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶实验阴性，吐温80水解阳性，七叶苷水解、明胶水解阴性，硝酸盐还原阳性，45℃不能生长。菌株16srDNA测序序列如SEQIDNO:1所示，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。经过NCBIBLAST比对，同源性为99%。

在初始含量均为50mg/L的萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并芘9中多环芳烃中，本发明所述菌株不能降解其中的苊、二氢苊、苯并芘，但菌株对萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘在第四天和第八天均能对进行有效降解。本发明所述菌株具有广泛的底物广谱性。

本发明所述菌株对初始浓度50mg/L的芘在第4天降解率可达57.85%，第9天时可达96.76%。

本发明所述菌株对多环芳烃具有较高的耐受浓度。对于初始浓度分别为50、75、100、200mg/L的芘，接种等量的本发明所述菌株，在相同时间内，随着培养体系中芘含量的增加，菌株对芘的去除量增加，由此表明在所实验的浓度中，菌株能适应环境中含量高达200mg/L的芘。

本发明所述菌株在Cu²⁺浓度为5-100mg/L培养液中生长良好；

本发明所述菌株在Cd²⁺浓度为0.5-50mg/L培养液中生长良好；

本发明所述菌株在Pb²⁺浓度为1-500mg/L培养液中生长良好；

本发明所述菌株在Zn²⁺浓度为0.5-100mg/L培养液中生长良好；

本发明所述菌株在As³⁺浓度为0.5-1mM/L培养液中生长良好；

本发明所述菌株在As⁵⁺浓度为2.5-10mM/L培养液中生长良好。

综上，本发明的菌株在5-100mg/LCu²⁺；0.5-50mg/LCd²⁺，1-500mg/LPb²⁺，0.5-100mg/LZn²⁺，0.5-1mM/LAs³⁺；2.5-10mM/LAs⁵⁺浓度中生长良好，即菌株对上述重金属具有良好的耐受性。

所述菌株保藏信息：

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2015年6月1日；

保藏编号：CGMCCNo.10941。

保藏菌株分类命名为：浅黄分枝杆菌Mycobacteriumgilvum。

本发明的申请人经过多次试验及创新性的研究，发现当接种比例生物炭：种子液=1：10（w/v）时，制备得到的多环芳烃去除复合材料种负载的Mycobacteriumgilvum最多；浸泡固定化后的载体材料上Mycobacteriumgilvum负载量为4.57x10¹²个/g，与同类技术相比，附载的微生物生物量较高。同时，具有很好的去除或降解多环芳烃的效果。从实施例8和9可以看出，本发明所述复合材料对水及土壤环境中的多环芳烃具有良好的去除效果。

附图说明

图1是Mycobacteriumgilvum生长于LB平板形态图。

图2是Mycobacteriumgilvum扫描电镜图（放大5000倍）。

图3是菌株系统发育树图。

图4是Mycobacteriumgilvum菌株降解多环芳烃的底物广谱性试验结果图。

图5是Mycobacteriumgilvum菌株对芘的降解试验结果图。

图6是Mycobacteriumgilvum菌株对培养液中不同初始含量的芘去除量试验结果图。

图7是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度Cu²⁺中的生长曲线图。

图8是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度Cd²⁺中的生长曲线图。

图9是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度Pb²⁺中的生长曲线图。

图10是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度Zn²⁺中的生长曲线图。

图11是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度As³⁺中的生长曲线图。

图12是Mycobacteriumgilvum菌株在不同浓度As⁵⁺中的生长曲线图。

图13是制备得到的多环芳烃去除复合材料外观图。

图14A为无菌生物炭表观图，14B为菌株SEM下形态图；C为菌株附载于生物炭表面的表观图。

图15是多环芳烃去除复合材料对MSM培养液中芘去除实验结果图。

图16是多环芳烃去除复合材料对多环芳烃污染土壤中∑16PAH的去除实验结果图。

图17是多环芳烃去除复合材料对多环芳烃污染土壤中芘的去除率结果图。

图18是多环芳烃去除复合材料多环芳烃污染土壤中荧蒽的去除率结果图。

图19是多环芳烃去除复合材料多环芳烃污染土壤中菲的去除率结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例所用培养基配方为：

所述MI的LB培养基成份为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。

所述LB培养基固体平板成份为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，15g/L纯化琼脂粉。

所述MSM培养液的成分为：K₂HPO₄6.0g/L,KH₂PO₄5.5g/L,Na₂SO₄2.0g/L,KCL2g/L,MgSO₄.7H₂O0.2g/L,1ml微量金属盐溶液/L。所述微量金属盐溶液配方为：N(CH₂COOH)₃1.5g/L,MnSO₄.H₂O0.5g/L,NaCl1.0g/L,FeSO₄.7H₂O0.1g/L,CoSO₄.7H₂O0.18g/L,CaCl₂.2H₂O0.1g/L,ZnSO₄.7H₂O0.18g/L,CuSO₄.5H₂O0.01g/L,KAl(SO₄)₂.12H₂O0.02g/L,H₃BO₃0.01g/L,Na₂MoO₄.2H₂O0.01g/L,NiCl₂.6H₂O0.025g/L,Na₂SeO₃.5H₂O0.3g/L。pH值为7.8。

所述MSM培养基固体平板的成份为：上述MSM培养液成份，15g/L纯化琼脂粉。

去除率={1-[（18天后土壤悬液固相中多环芳烃含量+水相中多环芳烃含量）/（第0天土壤悬液固相中多环芳烃含量+水相中多环芳烃含量）]}*100%

多环芳烃含量测定方法：

固相中多环芳烃测定方法简介：固相土壤中多环芳烃测定方法参照EPA3540C。

水相中多环芳烃测定方法参照《水和废水监测分析方法》（4.14.2）。

实施例1：菌株的筛选与分离

富集培养：以北京焦化厂多环芳烃污染土壤为菌源，称取10g土壤，加入90ml无菌水和0.5g玻璃珠，在180r/min，30℃摇床中震荡3h，静置30min后，取上清液5ml接种到含芘50mg/L己灭菌的45mlMSM培养液中,30℃,180r/min摇床培养。每隔10天转接5ml培养液于45ml芘浓度梯度成100、200、300、500mg/L递增的新鲜灭菌MSM培养液,经过5次转接完成多环芳烃降解菌的富集。

菌株筛选：取一定量最后一次富集培养液涂布于MSM固体平板后，平板倒扣于装有芘的烧杯中，采用升华法在MSM固体平板铺上一层芘膜。涂有芘膜的平板置于30℃恒湿培养箱中培养，培养期间多次观察，出现透明圈的菌落即为芘降解菌。

菌株分离纯化：挑选出现透明圈的菌落，经过多次平板划线分离得到降解菌的纯菌株。

新菌株用LB培养基30℃培养7天，菌落橘黄色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。菌体呈短杆状，0.4μm×0.8–1.5μm，单个或成对排列，革兰氏阳性（见图1和图2）。能够利用葡萄糖酸钾和甘露醇为碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露醇产酸，过氧化氢酶、脲酶实验阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶实验阴性，吐温80水解阳性，七叶苷水解、明胶水解阴性，硝酸盐还原阳性，45℃不能生长。

菌株16srDNA测序（上海美吉生物医药科技有限公司）序列如SEQIDNO:1所示。经过NCBIBLAST比对，同源性为99%。

SEQIDNO:1序列为：

GGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCGGCTTTGAAAGGATTCGCTCCACCTCACGGCATCGCAGCCCTTTGTACCGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCTCACGAGTCCCCACCATAACGTGCTGGCAACATGAGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGCACACAGGCCACAAGGGAACCGACATCTCTGCCGGCGTCCTGTGCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGTACTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGATCCCAAGGAAGGAAACTCACACCTAGTACCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAAGGTATATAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACTGCCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTCCACGCTACACAGAATTCCAGTCTCCCCTGCAGTACTCAAGTCTGCCCGTATCGCCCGCACGCCCACAGTTAAGCTGTGAGTTTTCACGAACAACGCGACAAACCACCTACGAGCTCTTTACGCCCAGTAATTCCGGACAACGCTCGGACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTTCTCCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCGTCCCTGGCGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCCACACCGCAAAAGCTTTCCACCACACACCATGAAGCATGCGGTCCTATTCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCAAAGTGCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCGAGTACCCCGAAGGGC

菌株经CICC鉴定为浅黄分支杆菌（Mycobacteriumgilvum），鉴定单位信息：中国工业微生物菌种保藏管理中心，简称CICC，地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，中国食品发酵工业研究院。菌株系统发育树见图3。

实施例2：菌株降解多环芳烃的底物广谱性试验

在装有已灭菌MSM培养液的100ml三角瓶中分别加入萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并芘，使上述9种多环芳烃含量均为50mg/L，以10%的接种量接种0D₆₀₀=1.0的Mycobacteriumgilvum菌液（实施例1所得，以下均同此）。所有三角瓶均放置于30℃，180r/min摇床中震荡培养，分别于第0、4、8天取样测定三角瓶中各多环芳烃的残余量。实验结果表明菌株不能降解上述多环芳烃中的苊、二氢苊、苯并芘，对其他6种多环芳烃的降解情况结果见表1和图4。

表1 mycobactrialgilvum菌株对多环芳烃的降解率表

注：RSD表示标准方差。

从表1可以看出，当多环芳烃含量均为50mg/L的情况下，本发明的菌株在第四天和第八天均能对萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘进行有效降解，说明本发明的菌株对多环芳烃底物具有广谱性。

实施例3：菌株对芘的降解试验

在装有已灭菌MSM培养液的100ml三角瓶中加入一定量的芘（溶于丙酮中），待丙酮挥发后加入MSM培养液，使芘初始含量为50mg/L。以10%的接种量接种0D₆₀₀=1.0的Mycobacteriumgilvum菌液。三角瓶放置于30℃，180r/min摇床中震荡培养，分别于第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天破坏性取样测定三角瓶中芘残余量。结果见图5，从图5可以看出，菌株对初始浓度50mg/L的芘在第4天降解率可达57.85%，第9天时可达96.76%。

实施例4：菌株对芘的耐受性试验

在装有已灭菌MSM培养液的100ml三角瓶中加入不同量的芘，使MSM培养液中芘含量为50、75、100、200mg/L。然后以10%的接种量接种0D₆₀₀=1.0的Mycobacteriumgilvum菌液。所有三角瓶均放置于30℃，180r/min摇床中震荡培养，于第0、8天破坏性取样测定各三角瓶中芘残余量。结果见图6，从图6可以看出，本发明所述菌株对多环芳烃具有较高的耐受浓度。对于初始浓度分别为50、75、100、200mg/L的芘，接种等量的本发明所述菌株，在相同时间内，随着培养体系中芘含量的增加，菌株对芘的去除量增加，由此表明在所实验的浓度中，菌株能适应环境中含量高达200mg/L的芘。

实施例5：菌株对重金属的耐受性试验

Cu²⁺耐性测定：以LB培养液为溶剂，配制CuSO₄浓度梯度为5、10、50、100、500mg/L的溶液，121℃高压灭菌30min。向不同Cu浓度梯度的溶液中接种一定量OD₆₀₀=0.8的Mycobacteriumgilvum的种子液，使溶液初始OD₆₀₀=0.1。再各取200ul接种后的溶液于96孔板中培养并监测溶液OD₆₀₀值的变化。

Cd²⁺耐性测定：Cd²⁺浓度梯度设置为0.5、1、5、10、50、100mg/L，其余操作同Cu²⁺。

Pb²⁺耐性测定：Pb²⁺浓度梯度设置为5、10、50、100、500mg/L，其余操作同Cu²⁺。

Zn耐性测定：Zn浓度梯度设置为0.5、5、10、50、100mg/L，其余操作同Cu²⁺。

As³⁺耐性测定：配制100mMAs³⁺母液，过滤除菌。以已灭菌LB为溶剂，用100mMAs³⁺母液配制As³⁺浓度梯度为0.5、1、5、10mM/L的溶液。向不同As³⁺浓度梯度的溶液中接种一定量OD₆₀₀=0.8的Mycobacteriumgilvum的种子液，使溶液初始OD₆₀₀=0.1。再各取200ul接种后的溶液于96孔板中培养并监测溶液OD₆₀₀值的变化。

As⁵⁺耐性测定：配制母液，过滤除菌。As⁵⁺浓度梯度为50、100、500、1000、2000、5000、10000uM/L，其余操作同As³⁺。

试验结果见图7-12。从图7-12可以看出，菌株在Cu浓度为5-100mg/L培养液中生长良好；菌株在Cd浓度为0.5-50mg/L培养液中生长良好；菌株在Pb浓度为1-500mg/L培养液中生长良好；菌株在Zn浓度为0.5-100mg/L培养液中生长良好；菌株在As³⁺浓度为0.5-1mM/L培养液中生长良好；菌株在As⁵⁺浓度为2.5-10mM/L培养液中生长良好。也就是说，本发明的菌株在5-100mg/LCu；0.5-50mg/LCd，1-500mg/LPb，0.5-100mg/LZn，0.5-1mM/LAs³⁺；0.5-10mM/LAs⁵⁺浓度中生长良好，即菌株对上述重金属具有耐受性。

实施例6：多环芳烃去除复合材料的制备

①种子液的制备：于1L三角瓶中以1%的接种量接种活化后（OD₆₀₀=0.8）的Mycobacteriumgilvum菌液，接种后的三角瓶置于30℃，180r/min摇床中震荡培养至对数期（OD₆₀₀=0.8），对数期菌液3000r/min离心5min，弃上清液后再加入等量已灭菌的LB培养液并重新悬浮微生物，新得到的菌液即为制备载体材料的种子液。

②称取过2mm筛的水稻杆生物炭1g，加入到100ml三角瓶中，再向三角瓶加入20ml新鲜配制的LB培养液，121℃灭菌30min。灭菌后的三角瓶放置直至其温度降至室温。

③接种：向上述装有已灭菌生物炭及LB培养液的三角瓶中接种种子液，接种比例为水稻杆生物炭:：种子液=1：10（w/v）。

④浸泡固定化：接种后的三角瓶置于30℃，80r/min摇床中震荡培养48h进行浸泡固定化。

⑤用灭菌的200目滤网将完成浸泡固定的复合材料过滤，并用30ml无菌水分3次冲洗载体材料，即得附载了菌株Mycobacteriumgilvum的复合材料也即多环芳烃去除复合材料。见图13。

实施例7：多环芳烃去除复合材料固定化的微生物生物量试验

方法：提取实施例6所制备得到的复合材料中DNA后进行实时荧光定量PCR，测定复合材料附载的Mycobacteriumgilvum生物量。

结果：见图14A、B、C。其中图14A为无菌生物炭表观，14B为菌株SEM下形态；C为菌株附载于生物炭表面；可以看出，生物炭表面有较多的降解菌定殖，且降解菌之间能形成菌胶团，生长良好。

浸泡固定化后的载体材料上Mycobacteriumgilvum负载量为4.57x10¹²个/g，与同类技术相比，附载的微生物生物量较高。

实施例8：多环芳烃去除复合材料对水相中芘的去除效果试验

试验方法：在装有一定量已灭菌MSM培养液的100ml三角瓶中加入含量为50mg/L的芘，再以1:300（载体：MSM培养液，w/v）的比例加入制备好的载体材料。然后三角瓶放置于30℃，180r/min摇床中震荡培养，分别于第0、6天破坏性取样后测定三角瓶中芘残余量。

实验结果：见图15，其中粒径1为0.25-2.00mm生物炭；粒径2为0.15-0.25mm生物炭；粒径3为0-0.15mm生物炭分别制备得到的复合材料对MSM培养液中的芘的去除率；从图中可以看出：不同粒径大小的生物炭制备得到的复合材料对MSM培养液中的芘均有良好的去除效果，5天内去除均可达98%。

实施例9：多环芳烃去除复合材料对污染土壤中多环芳烃的去除试验

试验方法：

多环芳烃去除复合材料添加组（以下简称复合材料）：①土壤悬液的制备：称取北京焦化厂多环芳烃污染土壤5g放于灭菌的150ml三角瓶中，再向其中加入50ml灭菌的新鲜MSM培养液，三角瓶置于30℃，180r/min摇床中震荡培养2天进行土壤的复苏，制备得土水1:10（w/v）的土壤悬液。

②以多环芳烃去除复合材料与污染土壤质量比为1:20的比例向制备好的土壤悬液中加入多环芳烃去除复合材料，三角瓶置于30℃，180r/min摇床中震荡培养18天，破坏性取样测定土壤悬液中土壤及水溶液中的多环芳烃残余量。

③实验对照处理如下：

复苏后土壤多环芳烃初始含量测定组：土壤复苏后破坏性取样冻存于-80℃冰箱。

无添加自然去除组（以下简称自然去除）：单纯土壤复苏后无任何添加置于30℃，180r/min摇床中震荡培养18天。

游离菌组（以下简称游离菌）：操作同多环芳烃去除复合材料添加组，只是在添加多环芳烃去除复合材料时换成Mycobacteriumgilvum游离菌株，其加入量与多环芳烃去除复合材料所附载Mycobacteriumgilvum等量。

生物炭添加组（以下简称生物炭）：操作同多环芳烃去除复合材料添加组，只是在添加多环芳烃去除复合材料时换成灭菌水稻杆生物炭，其加入量与多环芳烃去除复合材料等量。

实验结果：

1）∑16EPA的去除实验结果：见表2和图16。

图2：16种EPA-PAHs总去除率表

	自然去除	游离菌	生物炭	复合材料
					∑16PAH	3.45%	10.75%	16.84%	46.12%

从表2和图16可以看出，本发明多环芳烃去除复合材料在短期的18天内能有效的去除土壤中46.2%的多环芳烃，显著高于其他处理。

2）多环芳烃去除复合材料对芘、荧蒽、菲的去除率结果:见表3和图17-19。

表3：不同处理对芘、荧蒽、菲的去除率表

PAHs	自然去除	游离菌	生物炭	复合材料
					芘	0.51%	19.74%	13.46%	62.15%
荧蒽	15.13%	15.14%	16.95%	60.69%
					菲	3.97%	47.30%	47.26%	62.59%

从表3和图17-19可以看出，本发明多环芳烃去除复合材料在短期的18天内能有效的去除土壤中的芘、荧蒽及菲，且去除率均达60%以上，去除效果显著高于其他处理。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院城市环境研究所

<120>一种多环芳烃去除复合材料、制备方法及其用途

<130>P12406

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1350

<212>DNA

<213>mycobactrialgilvum菌

<400>1

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Claims (10)

1.一种多环芳烃去除复合材料，其特征在于，有效成分包括:Mycobacteriumgilvum菌，其的保藏号为CGMCCNo.10941。

2.一种权利要求1所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，将培养的Mycobacteriumgilvum菌的种子液接种于装有生物炭的容器中，并于摇床振荡培养进行浸泡固定化后即得，所述菌的保藏号为CGMCCNo.10941；所述装有生物炭的容器中还含有LB培养基；所述接种重量体积比例为生物炭:种子液=1:5-1:20；优选的，为8:1-12:1。

3.权利要求2所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，所述种子液的制备为：于三角瓶中接种活化后的Mycobacteriumgilvum菌液，接种后的三角瓶置于30℃，180r/min摇床中震荡培养至对数期OD₆₀₀为0.8，对数期菌液3000r/min离心5min，弃上清液后再加入等量已灭菌的LB培养液并重悬，新得到的菌液即为种子液；优选接种量为1体积%。

4.权利要求2所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，所述生物炭为将称取过2mm筛的生物炭加入到三角瓶中，再向三角瓶加入新鲜配制的LB培养液，高温灭菌后放置直至其温度降至室温。

5.权利要求2所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，所述生物炭为豆杆、水稻杆残余制备的多孔生物炭。

6.权利要求2所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，所述摇床震荡培养的条件为30℃，80r/min摇床中震荡培养48h。

7.权利要求2所述多环芳烃去除复合材料的制备方法，其特征在于，所述浸泡固定化后还有清洗去杂质的步骤，具体为用灭过菌的200目滤网将完成浸泡固定的复合材料过滤，并用无菌水分多次冲洗载体材料；优选3次冲洗，即得。

8.一种权利要求1所述多环芳烃去除复合材料用于去除或降解多环芳烃的用途；优选的，所述用途是指去除或降解土壤或水环境中的多环芳烃的用途；

任选的，所述土壤或水为重金属和多环芳烃污染的土壤或水。

9.一种权利要求1所述多环芳烃去除复合材料在多环芳烃和重金属复合污染或多环芳烃单独污染的土壤或水环境中生物修复中的应用。

10.权利要求9所述应用，其特征在于，所述土壤或水有重金属和多环芳烃复合污染或多环芳烃单独污染。