CN104894012A - 一株17β-雌二醇降解菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株17β-雌二醇降解菌株及其应用。一株红球菌JX‐2，2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9636。一种用红球菌JX‐2所生产的固定化17‐β雌二醇降解菌剂，通过将该JX‐2菌悬液与海藻酸钠溶液混合均匀，以CaCl₂溶液为交联剂，交联5.5‐6.5h，得到直径约为3‐5mm固定化小球。本发明筛选获得红球菌JX‐2在实验室摇瓶培养条件下对17β‐雌二醇降解率可达90％以上。固定化菌剂直接施用于17β‐雌二醇污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使其中的17β‐雌二醇残留降低60％以上。

Description

一株17β-雌二醇降解菌株及其应用

技术领域

本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一株17β-雌二醇降解菌株及其应用。

背景技术

环境雌激素(EEs)是指：进入生物体内，可通过干扰生物体自身激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身激素的作用，对生物有机体维护正常的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利影响的环境化学物质。雌激素不需要大量存在就会给生物机体造成很强的危害，譬如使得生物体的性激素分泌紊乱、精子数量减少、雄性动物雌性化、癌症等发病率增加，造成生殖、免疫、神经等系统的多种病变。每年都有大量的雌激素排入环境中，对土壤、地表水和地下水环境造成污染，严重威胁人类和动物的安全与健康。虽然有研究表明，雌激素在自然环境下由于光照、酸碱、微生物等因素能部分降解，但降解效率非常低，其残存效应风险仍很大。因此，单纯依靠自然降解是无法达到彻底清除环境雌激素的目的。

17β‐雌二醇(17β‐Estradiol，E2)是一种由卵巢分泌的天然雌激素。人类和动物正常的生理活动会释放17β‐雌二醇。排入环境中的17β‐雌二醇可通过模拟、干扰或对抗机体原有内生激素的正常合成、运输和释放，使人和动物无法维持自身激素的平衡和调节，从而引起生殖器官病变和雌性化现象。17β‐雌二醇是如今诸多环境雌激素中作用最强的一种，作用强度是其代谢产物雌酮(E1)和雌三醇(E3)的5‐1000倍。例如当水体中雌激素17β‐雌二醇浓度仅为1ng·L^‐1时，就会干扰鱼类的内分泌系统，造成雄鱼的雌性化。如今，17β‐雌二醇已普遍存在于各类环境，特别是水环境中，由于17β‐雌二醇具有潜在的内分泌干扰作用，并且普通水处理技术难以有效地去除水中17β‐雌二醇，因此用微生物降解包括17β‐雌二醇在内的环境雌激素逐渐引起了人们的重视，但此项技术前提是获得高效稳定的降解菌。然而目前国内关于17β‐雌二醇降解菌的报道相对较少，因此，筛选出能适应中国本土环境的17β‐雌二醇高效降解菌显得尤为重要。

微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物大面积面源污染的降解修复，修复费用较低(仅为传统的物理化学修复花费的10％左右)，且不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于环境有机污染物的清除。由于17β‐雌二醇是一种不可避免产生和排放的雌激素，且性质比较稳定，不易发生自然降解，因此，对环境中雌二醇进行微生物降解的研究具有重要的意义。而目前，国内还鲜少有关于17β‐雌二醇微生物降解菌株的专利研究和应用报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种17β-雌二醇降解菌。

本发明的另一目的是提供该降解菌的应用。

本发明的又一目的是提供该17β-雌二醇降解菌生产的固定化菌剂。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株红球菌JX‐2，2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9636。

所述的菌种保藏号为CGMCC NO.9636的红球菌JX‐2在降解雌激素17‐β雌二醇中的应用；优选在降解水体环境或固体废弃物中雌激素17β‐雌二醇的应用。

所述的红球菌JX‐2在制备降解雌激素17‐β雌二醇的微生物制剂中的应用。

一种用本发明所述的红球菌JX‐2所生产的固定化17‐β雌二醇降解菌剂。

一种用权利要求1所述的红球菌JX‐2所生产的固定化17‐β雌二醇降解菌剂，是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC NO.9636的红球菌JX‐2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％(v/v，以培养基体积为基准，下同)的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为180转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为50小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl 10.0g·L^‐1，pH 7.5‐8.0；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液按体积比1‐1.5:1混合均匀，以质量浓度为5％的CaCl₂溶液为交联剂，将菌悬液‐海藻酸钠混合液滴入CaCl₂溶液中交联5.5‐6.5h(菌悬液‐海藻酸钠混合液与CaCl₂的体积比1:10)，得到直径约为3‐5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

本发明所述的降解菌剂在降解雌激素17β‐雌二醇中的应用；优选在降解水体环境或固体废弃物中雌激素17β‐雌二醇的应用。

有益效果

本发明筛选获得一株红球菌(Rhodococcus sp.)JX‐2(CGMCC 9636)，利用该菌株制备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为30mg·L^‐1的17β‐雌二醇降解率可达90％以上。将固定化菌剂直接施用于17β‐雌二醇污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使其中的17β‐雌二醇残留降低60％以上，解决了雌激素17β‐雌二醇对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害问题。

本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境以及畜禽粪便中17β‐雌二醇造成的雌激素污染。本发明中的技术可直接应用于我国畜禽粪便的无害化和资源化处理过程，具有广阔的产业前景和重要的环境、经济和社会效益。

附图说明

图1菌株JX-2的菌落照片和透射电镜照片

A图为菌株JX-2的菌落照片，B图为菌株JX-2的菌透射电镜照片

图2菌株JX-2以30mg·L^-1E2为唯一碳源时的生长和降解曲线

生物材料保藏信息

JX‐2，分类命名为红球菌Rhodococcus sp.，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.9636，保藏日期为2014年9月4日。

具体实施方式

实施例1菌株的分离和鉴定

取临安某污水处理厂活性污泥5g，加入到100mL的无机盐培养基中，添加17β‐雌二醇(E2)至30mg·L^‐1作为唯一碳源，于30℃，150r·min^‐1摇床培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取10^‐4‐10^‐7稀释度的富集液各0.1mL涂布于添加30mg·L^‐1E2的无机盐平板上，于30℃恒温培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含有30mg·L^‐1E2的无机盐液体培养基中，于30℃，150r·min^‐1摇床培养7d，验证其对E2的降解效果。无机盐培养基配方为：NH₄NO₃1.0g·L^‐1，KH₂PO₄0.5g·L^‐1，K₂HPO₄1.5g·L^‐1，NaCl 1.0g·L^‐1，MgSO₄·7H₂O0.2g·L^‐1，pH 8.0；固体培养基加20g·L^‐1琼脂。

降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min混匀，12000r·min^‐1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的E2含量。高效液相色谱(岛津LC‐20AT)设定参数为：Inertsil ODS‐SP‐C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈:水＝70:30，流速1.000mL·min^‐1，柱温40℃，紫外检测波长280nm。外标法按峰高定量。

从富集液中分离到一株E2降解菌，命名为菌株JX‐2。菌株JX‐2降解E2前后的液相色谱检测结果表明菌株JX‐2在7d内对初始浓度为30mg·L^‐1的E2降解率大于90％。菌株JX‐2在固体LB培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面隆起，湿润光滑，呈橙黄色，菌体易挑起。在透射电子显微镜下该菌呈短杆状，大小为(0.6～1.0)μm×(1.4～2.4)μm，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。其生理生化特性见表1。菌株JX‐2的形态和生理生化特征和Bergey's manual ofsystematic bacteriology上对红球菌的描述是一致的。

以菌株JX‐2的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株JX‐2与红球菌属的同源性最近，序列相似性达到99％以上。结合生理生化特征将该菌鉴定为红球属(Rhodococcus sp.)，将该菌送交中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 9636，保藏日期为2014年9月4日。

表1菌株JX‐2的生理生化特性

注：+表示在试验中呈阳性反应，‐为阴性反应。

实施例2修复菌剂的发酵和固定化

使用上述菌株JX‐2生产固定化修复菌剂的工艺为：斜面种—摇瓶种子液—种子罐—固定化产品(包装剂型为固定化菌剂)。

1)将保藏编号为CGMCC 9636的红球菌(Rhodococcus sp.)JX‐2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％(V/V，以培养基体积为基准，下同)的接种量接入装液量为70％(V/V，以发酵罐体积为基准，下同)的500L种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入装液量为70％的生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为180转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为50小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上；

其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl 10.0g·L^‐1，pH 7.5‐8.0；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液按体积比1‐1.5:1混合均匀，以质量浓度为5％的CaCl₂溶液为交联剂，将菌悬液‐海藻酸钠混合液滴入CaCl₂溶液中交联5.5‐6.5h(菌悬液‐海藻酸钠混合液与CaCl₂的体积比1:10)，得到直径约为3‐5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

实施例3培养基中菌株JX‐2对17β‐雌二醇的生物降解实验

在无机盐培养基(同实施例1)中加入终浓度为30mg·L^‐1的E2，以5％(V/V，以培养基体积为基准)接种量接入菌株JX‐2(CGMCC 9636)，设接种灭活的菌株JX‐2对照，30℃恒温摇床振荡培养。定时取样检测菌株JX‐2以30mg·L^‐1的E2为唯一碳源生长时的生长情况以及对E2的降解情况，结果见图2。菌株JX‐2可以E2为唯一碳源生长良好，且在7d内对初始浓度为30mg·L^‐1的E2的降解率达到90％以上。

实施例4固定化修复菌剂在污水和畜禽粪便处理中的应用

采用南京市玄武区月牙湖湖水作为供试水样。在该湖的的3个生活污水排污口处的湖水中均检测到E2，浓度分别为55.59ng·L^‐1、39.78ng·L^‐1、43.35ng·L^‐1。按10％的接种量在1L水样中投入固定化修复菌剂100g，于30℃，150r·min^‐1摇床振荡培养7d后利用高效液相色谱测定各水样中E2含量(同实施例1)，以不接菌剂水样作为对照。固定化修复菌剂对实际污水中E2的降解效果详见表2。从表2中可以看出，固定化修复菌株对排水口1处的E2降解率为73.5％；对排水口2处的E2降解率为64.4％；排水口3处的污水经降解后已测不到E2浓度(实际浓度小于检出限)。

采用南京市某养殖场的牛粪作为供试畜禽粪便。取4个牛粪样品，检测到E2的浓度分别为146.31μg·kg^‐1，148.84μg·kg^‐1，158.70μg·kg^‐1，174.01μg·kg^‐1。按50％的接种量在100g干燥牛粪样品中投入固定化修复菌剂50g，加入无菌水使牛粪的含水量保持在60％，于30℃恒温培养箱中培养7d后利用高效液相色谱测定其中的E2含量，以不接菌剂牛粪作为对照，期间每隔12h对牛粪进行翻堆处理。牛粪中E2含量测定参照付银杰等于2013年在《应用生态学报》杂志上发表的文章《应用UE‐SPE‐HPLC/FLD法检测养殖业畜禽粪便中雌激素》(24(11):3280‐3288)中关于畜禽粪便中雌激素的检测方法进行，具体检测步骤如下：牛粪样品经冷冻干燥后，加入15mL乙酸乙酯，超声萃取1h，于4000r·min^‐1下离心10min，取上清液5mL过硅胶柱，并用10mL的1:1(体积比)的乙酸乙酯与甲醇混合液洗脱，洗脱液收集于试管中，经氮吹仪吹干后，甲醇定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜后，用高效液相色谱仪测定，计算牛粪中E2的去除率。结果表明，固定化修复菌剂对牛粪样品中E2的去除率可达80％以上。

表2固定化修复菌剂对污水和畜禽粪便中E2的降解率

Claims (10)

1.一株红球菌JX‐2，2014年9月4日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9636。

2.权利要求1所述的红球菌JX‐2在降解雌激素17‐β雌二醇中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的红球菌JX‐2在降解水体环境或固体废弃物中雌激素17β‐雌二醇的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的固体废弃物为动物粪便。

5.权利要求1所述的红球菌JX‐2在制备降解雌激素17‐β雌二醇的微生物制剂中的应用。

6.一种用权利要求1所述的红球菌JX‐2所生产的固定化17‐β雌二醇降解菌剂。

7.根据权利要求6所述的固定化17‐β雌二醇降解菌剂，其特征在于是通过以下方法生产而成：

1)将保藏编号为CGMCC NO.9636的红球菌JX‐2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为180转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为50小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：蛋白胨10.0g·L^‐1，酵母5.0g·L^‐1，NaCl 10.0g·L^‐1，pH 7.5‐8.0；

5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝1.0，将该菌悬液与质量浓度为4％的海藻酸钠溶液按体积比1‐1.5:1混合均匀，以质量浓度为5％的CaCl₂溶液为交联剂，将菌悬液‐海藻酸钠混合液滴入CaCl₂溶液中交联5.5‐6.5h，菌悬液‐海藻酸钠混合液与CaCl₂溶液的体积比1:10，得到直径约为3‐5mm固定化小球，即为固定化修复菌剂。

8.权利要求7所述的降解菌剂在降解雌激素17β‐雌二醇中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求5所述的降解菌剂在降解水体环境或固体废弃物中雌激素17β‐雌二醇的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的固体废弃物为动物粪便。