CN113493288B - 一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

发明属于生物发酵领域，公开了一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，包括如下重量份组分：蚯蚓肠腔培养物2～4份；蚯蚓粪培养物3～5份；黑水虻幼虫肠道培养物3～5份；黑水虻幼虫粪培养物4～6份；大麦虫幼虫肠道培养物3～5份；大麦虫幼虫粪培养物5～7份；屎壳郎幼虫肠道培养物2～4份；屎壳郎幼虫粪培养物2～4份；虫沙42～50份；鬼针草粉18～25份；腐植酸钠15～20份。该组合可有效降低养殖臭味，同时，本发明还提供该组合物的制备方法。

Description

一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物及其制备方法。
背景技术
本申请人于2018年提出了一项发明专利ZL201811428762.6，公开了一种复合脂类，包括如下组分：大麦虫脂类提取物、柑橘类脂类提取物、黑水虻脂类提取物；大麦虫脂类提取物：柑橘类脂类提取物：黑水虻脂类提取物的重量比为：6-10:2-6:1-3。其用于减少畜禽粪污臭味臭气排放的喷雾剂。
除此之外，本领域在降低养殖臭味的方面，大多采用饲料添加剂的形式实现。如：
CN202010814223.7公开了一种预防育肥羊养殖过程中产生臭味的微生物有益活菌剂，所述微生物有益活菌剂包括以下重量份的原料：芽孢杆菌3～5份、乳酸菌1～3份、酵母菌1～3份、培养基8～12份和井水60～100份。本申请提供了一种预防育肥羊养殖过程中产生臭味的微生物有益活菌剂，其作为添加剂直接添加到饲料中即可。利用复合益生菌，复合益生菌仅采用芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌，通过利用复合益生菌产生的各种酶，各个因素共同作用，协助羊快速、完整的消化各种谷物，减少粪便谷物等营养物质的含量。
畜禽粪污及臭气组成成分较复杂，治理难度极大。目前，养殖废弃物处理与利用模式方面，主要集中在固体粪便堆肥利用和沼气生产，前者缺点在于源头污染大，产生大量臭气，其主要原因是长期缺乏有效处理技术的投入和设施设备的研发；而后者在养殖场中更为常见，是目前养殖废弃物处理最有效的方法之一，但沼气工程建设投资成本高、占地面积大；能源产品利用难度大、处理周期过长，沼液产生量大、集中，臭气排放等需配套后续处理利用工艺，处理和治理成本高昂。
本申请人在对于各种经济虫种的进一步深度研究后发现，对于经济虫种的生态利用价值仍有很大的研发空间。
所以，本案首要解决的技术问题是：如何通过经济虫种的综合利用技术降低畜禽养殖粪污的臭味臭气物质排放问题。
发明内容
针对目前现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，该组合物能快速发酵降解粪污中臭味物质，有效减少臭气排放。
本发明的另一目的在于提供该组合物的制备方法。
具体方案如下：
一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，包括如下重量份组分：
蚯蚓肠腔培养物2～4份；
蚯蚓粪培养物3～5份；
黑水虻幼虫肠道培养物3～5份；
黑水虻幼虫粪培养物4～6份；
大麦虫幼虫肠道培养物3～5份；
大麦虫幼虫粪培养物5～7份；
屎壳郎幼虫肠道培养物2～4份；
屎壳郎幼虫粪培养物2～4份；
虫沙42～50份；
鬼针草粉18～25份；
腐植酸钠15～20份。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，蚯蚓肠腔培养物总菌量≥3×1010cfu/g,黑水虻幼虫肠道培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g、大麦虫幼虫肠道培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎幼虫肠道培养物总菌量≥1.5×1010cfu/g。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，蚯蚓幼虫粪培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g,黑水虻幼虫粪培养物总菌量≥5.0×1010cfu/g、大麦虫幼虫粪培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪培养物总菌量≥3.0×1010cfu/g。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，所述虫沙为蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪、屎壳郎幼虫粪的混合；
其中，蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪、屎壳郎幼虫粪的比例为2：2：3：3。
需要说明的是，在本发明中，蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪、屎壳郎幼虫粪的比例在1-3:1-3：2-4:2-4的比例范围内都能够起到比较好的除臭效果。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，所述蚯蚓肠腔培养物、黑水虻幼虫肠道培养物总菌量、大麦虫幼虫肠道培养物总菌量及屎壳郎幼虫肠道培养物的制备方法均为如下工艺：
将对应的虫体的肠道匀浆得到浆状物，按3～5wt％的接种量接种到混合液体培养基Ⅰ中，厌氧培养36～48小时，并经过冻干处理得到；所述浆状物中固含量为45％～65％；
混合液体培养基Ⅰ含如下重量比组分：NA：TSA：LB：MRS＝4：2：2：2。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，所述蚯蚓幼虫粪培养物、黑水虻幼虫粪培养物、大麦虫幼虫粪培养物及屎壳郎幼虫粪培养物的制备方法均为如下工艺：
将对应的虫粪匀浆得到浆状物，按5～7wt％的接种量接种到混合液体培养基Ⅱ中，厌氧培养24～36小时，并经过冻干处理得到；所述浆状物中固含量为50％～70％；
混合液体培养基Ⅱ含如下重量比组分：NA：TSA：LB：MRS＝4：3：2：1。
在上述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物中，所述组合物的性能指标如下：
总菌量≥5～7×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量≥3.0×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量≥4.5×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量≥5.0×108cfu/g，产酸细菌≥3.5×108cfu/g。
(2)抑菌效果
猪粪抑菌直径≥28mm，鸡粪抑菌直径≥25mm。
同时，本发明还公开了一种如上所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物的制备方法，其特征在于：将各组分混合均匀即可得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的组合物对于畜禽类粪污的臭气成分(硫化氢(H2S)和氨气(NH3))与臭味物质(对-甲酚、吲哚、粪臭素等)起到明显的降解减排作用。
具体来说，其具有如下优势：
1、本发明的配方相比于空白样，其臭气臭味处理能力显著；
2、本发明中组合物含幼虫肠道培养物、幼虫粪便培养物、虫沙、鬼针草粉、腐植酸钠缺一不可。
3、蚯蚓肠腔培养物、黑水虻幼虫肠道培养物、大麦虫幼虫肠道培养物及屎壳郎幼虫肠道培养物是缺一不可的，当四者都存在时，其抑菌效果与臭味臭气物质减少是最为明显的。
4、蚯蚓幼虫粪培养物、黑水虻幼虫粪培养物、大麦虫幼虫粪培养物及屎壳郎幼虫粪培养物是缺一不可的，当四者都存在时，其抑菌效果与臭味臭气物质减少是最为明显的。
5、虫沙对于抑菌作用和粪污降解作用具有协同效应。
附图说明
图1是本发明的各组合物(Ⅰ～Ⅷ)对猪粪污抑菌效果；
图2是本发明的各组合物(Ⅰ～Ⅷ)对鸡粪污抑菌效果；
图3是本发明的各组合物(Ⅷ～Ⅺ)对鸡粪污抑菌效果；
图4是本发明的各组合物(Ⅷ～Ⅺ)对猪粪污抑菌效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
原材料说明：
蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫，蚯蚓粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪均来源于广东虫虫生物科技有限公司。
营养琼脂培养基(NA)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、LB培养基及MRS培养基来源于购于广东环凯微生物科技有限公司。
1、幼虫肠腔与肠道匀浆物制备
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，用匀浆机分别将幼虫肠腔与肠道与无菌水进行匀浆，分别获得蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道匀浆物，其含量均为45％～65％。
2、幼虫粪匀浆物制备
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，用匀浆机分别将幼虫粪与无菌水进行匀浆，分别获得蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪匀浆物，其含量均为50％～70％。
3、幼虫肠腔与肠道培养物制备
在无菌操作条件下，分别取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道匀浆物3％-5％，接入盛有50L混合液体培养基Ⅰ(NA：TSA：LB：MRS＝4：2：2：2)的发酵罐中，厌氧培养36-48小时。发酵结束后，取出培养液，经真空冷冻干燥6-8小时，分别获得幼虫肠腔与肠道培养物。经平板菌落计数：蚯蚓幼虫肠腔总菌量≥3×1010cfu/g,黑水虻幼虫肠道培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g、大麦虫幼虫肠道培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物总菌量≥1.5×1010cfu/g。
4、幼虫粪培养物制备
在无菌操作条件下，分别取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪便5％-7％，接入盛有50L混合液体培养基Ⅱ(NA：TSA：LB：MRS＝4：3：2：1)的发酵罐中，先厌氧发酵24-36小时，再好氧培养36-48；发酵结束后，取出培养液，经真空冷冻干燥8-10小时，分别获得虫粪培养物。经平板菌落计数：蚯蚓幼虫粪培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g,黑水虻幼虫粪培养物总菌量≥5.0×1010cfu/g、大麦虫幼虫粪培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪培养物总菌量≥3.0×1010cfu/g。
5、组合物制备
分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物2-4份和粪培养物3-5份，黑水虻幼虫肠道培养物3-5份和粪培养物4-6份，大麦虫幼虫肠道培养物3-5份和粪培养物5-7份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2-4和粪培养物2-4份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉18-25份，腐植酸钠15-20份及混合虫沙42-50份(蚯蚓幼虫粪：黑水虻幼虫粪：大麦虫幼虫粪：屎壳郎(蜣螂)幼虫粪＝2：2：3：3)，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
6、组合物评价指标
(1)活菌数
组合物的总菌量≥5-7×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量≥3.0×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量≥4.5×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量≥5.0×108cfu/g，产酸细菌≥3.5×108cfu/g。
(2)抑菌效果
猪粪抑菌直径≥28mm，鸡粪抑菌直径≥25mm。
实施例1
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，加入一定量无菌水，用匀浆机进行匀浆，分别获得幼虫肠道匀浆物，其含量均为45％；同样条件，取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，加入一定量无菌水，进行匀浆，分别获得幼虫粪匀浆物，其含量均为50％。同样条件下，分别取各幼虫肠道匀浆物和幼虫粪匀浆物3％和5％，分别接入盛有50L液体培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的发酵罐中，肠道匀浆物厌氧培养36小时，幼虫粪匀浆物先厌氧培养24小时，再好氧发酵36小时；发酵结束后，分别取出两种培养液，经真空冷冻干燥6小时和8小时，分别获得幼虫肠道培养物和虫粪培养物。分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物2份和粪培养物3份，黑水虻幼虫肠道培养物3份和粪培养物4份，大麦虫幼虫肠道培养物3份和粪培养物5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2份和粪培养物2份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉25份，腐植酸钠20份及混合虫沙50份，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
经检测，蚯蚓幼虫肠腔和虫粪总菌量分别为3.2×1010cfu/g和3.55×1010cfu/g，黑水虻幼虫肠道和虫粪总菌量分别为3.52×1010cfu/g和5.35×1010cfu/g，大麦虫幼虫肠道和虫粪总菌量分别为4.54×1010cfu/g和4.58×1010cfu/g，蜣螂幼虫肠道和虫粪总菌量分别为1.56×1010cfu/g和3.05×1010cfu/g；组合物Ⅰ的总菌量为5.05×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量为3.3×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量为4.51×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量为5.05×108cfu/g，产酸细菌为3.51×108cfu/g。猪粪污抑菌直径为28.50mm，鸡粪污抑菌直径为25.20mm。
实施例2
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，加入一定量无菌水，用匀浆机进行匀浆，分别获得幼虫肠道匀浆物，其含量均为50％；同样条件，取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，加入一定量无菌水，进行匀浆，分别获得幼虫粪匀浆物，其含量均为55％。同样条件下，分别取各幼虫肠道匀浆物和幼虫粪匀浆物3.5％和5.5％，分别接入盛有50L液体培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的发酵罐中，肠道匀浆物厌氧培养39小时，幼虫粪匀浆物先厌氧培养27小时，再好氧发酵39小时；发酵结束后，分别取出两种培养液，经真空冷冻干燥6.5小时和8.5小时，分别获得幼虫肠道培养物和虫粪培养物。分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉22份，腐植酸钠18份及混合虫沙44份，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
经检测，蚯蚓幼虫肠腔和虫粪总菌量分别为3.5×1010cfu/g和3.80×1010cfu/g，黑水虻幼虫肠道和虫粪总菌量分别为3.75×1010cfu/g和5.85×1010cfu/g，大麦虫幼虫肠道和虫粪总菌量分别为4.90×1010cfu/g和4.92×1010cfu/g，蜣螂幼虫肠道和虫粪总菌量分别为1.78×1010cfu/g和3.52×1010cfu/g；组合物Ⅰ的总菌量为5.53×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量为3.50×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量为4.68×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量为5.32×108cfu/g，产酸细菌为3.85×108cfu/g。猪粪污抑菌直径为28.84mm，鸡粪污抑菌直径为25.75mm。
实施例3
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，加入一定量无菌水，用匀浆机进行匀浆，分别获得幼虫肠道匀浆物，其含量均为55％；同样条件，取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，加入一定量无菌水，进行匀浆，分别获得幼虫粪匀浆物，其含量均为60％。同样条件下，分别取各幼虫肠道匀浆物和幼虫粪匀浆物4.0％和6.0％，分别接入盛有50L液体培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的发酵罐中，肠道匀浆物厌氧培养42小时，幼虫粪匀浆物先厌氧培养30小时，再好氧发酵42小时；发酵结束后，分别取出两种培养液，经真空冷冻干燥7小时和9小时，分别获得幼虫肠道培养物和虫粪培养物。分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物3份和粪培养物4份，黑水虻幼虫肠道培养物4份和粪培养物5份，大麦虫幼虫肠道培养物4份和粪培养物6份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物3份和粪培养物3份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉20份，腐植酸钠17份及混合虫沙45份，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
经检测，蚯蚓幼虫肠腔和虫粪总菌量分别为3.82×1010cfu/g和3.95×1010cfu/g，黑水虻幼虫肠道和虫粪总菌量分别为3.91×1010cfu/g和6.01×1010cfu/g，大麦虫幼虫肠道和虫粪总菌量分别为5.10×1010cfu/g和5.16×1010cfu/g，蜣螂幼虫肠道和虫粪总菌量分别为1.92×1010cfu/g和3.90×1010cfu/g；组合物Ⅰ的总菌量为6.04×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量为3.80×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量为4.94×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量为5.76×108cfu/g，产酸细菌为4.10×108cfu/g。猪粪污抑菌直径为29.15mm，鸡粪污抑菌直径为25.96mm。
实施例4
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，加入一定量无菌水，用匀浆机进行匀浆，分别获得幼虫肠道匀浆物，其含量均为60％；同样条件，取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，加入一定量无菌水，进行匀浆，分别获得幼虫粪匀浆物，其含量均为65％。同样条件下，分别取各幼虫肠道匀浆物和幼虫粪匀浆物4.5％和6.5％，分别接入盛有50L液体培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的发酵罐中，肠道匀浆物厌氧培养45小时，幼虫粪匀浆物先厌氧培养33小时，再好氧发酵45小时；发酵结束后，分别取出两种培养液，经真空冷冻干燥7.5小时和9.5小时，分别获得幼虫肠道培养物和虫粪培养物。分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物3.5份和粪培养物4.5份，黑水虻幼虫肠道培养物4.5份和粪培养物5.5份，大麦虫幼虫肠道培养物4.5份和粪培养物6.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物3.5份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉20份，腐植酸钠16份及混合虫沙48份，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
经检测，蚯蚓幼虫肠腔和虫粪总菌量分别为4.20×1010cfu/g和4.52×1010cfu/g，黑水虻幼虫肠道和虫粪总菌量分别为4.25×1010cfu/g和6.54×1010cfu/g，大麦虫幼虫肠道和虫粪总菌量分别为5.70×1010cfu/g和6.48×1010cfu/g，蜣螂幼虫肠道和虫粪总菌量分别为2.24×1010cfu/g和4.12×1010cfu/g；组合物Ⅰ的总菌量为6.80×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量为3.90×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量为5.03×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量为6.06×108cfu/g，产酸细菌为4.64×108cfu/g。猪粪污抑菌直径为29.60mm，鸡粪污抑菌直径为26.20mm。
实施例5
在无菌操作条件下，取蚯蚓幼虫肠腔、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道，加入一定量无菌水，用匀浆机进行匀浆，分别获得幼虫肠道匀浆物，其含量均为65％；同样条件，取蚯蚓幼虫、黑水虻幼虫、大麦虫幼虫及屎壳郎(蜣螂)幼虫粪，加入一定量无菌水，进行匀浆，分别获得幼虫粪匀浆物，其含量均为70％。同样条件下，分别取各幼虫肠道匀浆物和幼虫粪匀浆物5％和7％，分别接入盛有50L液体培养基Ⅰ和培养基Ⅱ的发酵罐中，肠道匀浆物厌氧培养48小时，幼虫粪匀浆物先厌氧培养36小时，再好氧发酵48小时；发酵结束后，分别取出两种培养液，经真空冷冻干燥8小时和10小时，分别获得幼虫肠道培养物和虫粪培养物。分别取蚯蚓幼虫肠腔培养物4份和粪培养物5份，黑水虻幼虫肠道培养物5份和粪培养物6份，大麦虫幼虫肠道培养物5份和粪培养物7份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物4份和粪培养物4份，放入搅拌机中，加入辅料鬼针草粉18份，腐植酸钠15份及混合虫沙42份，充分混合均匀，获得组合物(组合物Ⅰ)。
经检测，蚯蚓幼虫肠腔和虫粪总菌量分别为4.50×1010cfu/g和4.80×1010cfu/g，黑水虻幼虫肠道和虫粪总菌量分别为4.80×1010cfu/g和6.74×1010cfu/g，大麦虫幼虫肠道和虫粪总菌量分别为5.90×1010cfu/g和6.83×1010cfu/g，蜣螂幼虫肠道和虫粪总菌量分别为2.50×1010cfu/g和4.80×1010cfu/g；组合物Ⅰ的总菌量为6.96×109cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量为3.90×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量为5.28×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量为6.44×108cfu/g，产酸细菌为4.83×108cfu/g。猪粪污抑菌直径为30.02mm，鸡粪污抑菌直径为28.04mm。
组合物配制及抑菌效果评估(有效含量：25％)：
组合物Ⅰ(编号：1)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料鬼针草粉22份，腐植酸钠18份及混合虫沙44份，充分混合均匀。
组合物Ⅱ(编号：2)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料：混合虫沙84份，充分混合均匀。
组合物Ⅲ(编号：3)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料：玉米芯粉84份，充分混合均匀。
组合物Ⅳ(编号：4)：黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料：玉米芯粉66份，充分混合均匀。
组合物Ⅴ(编号：5)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料：玉米芯粉57份，充分混合均匀。
组合物Ⅵ(编号：6)：黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份；辅料：玉米芯粉39份，充分混合均匀。
组合物Ⅶ(编号：7)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2份和粪培养物2份；辅料：玉米芯粉12份，充分混合均匀。
组合物Ⅷ(编号：8)：玉米芯粉100份(空白对照组)
组合物Ⅸ(编号：9)：蚯蚓幼虫肠腔培养物6份，黑水虻幼虫肠道培养物8份，大麦虫幼虫肠道培养物9份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物5份，辅料鬼针草粉22份，腐植酸钠18份及混合虫沙44份。
组合物Ⅹ(编号：10)：蚯蚓幼虫粪培养物6份，黑水虻幼虫粪培养物8份，大麦虫幼虫粪培养物9份，屎壳郎(蜣螂)幼虫粪培养物5份，辅料鬼针草粉22份，腐植酸钠18份及混合虫沙44份。
组合物Ⅺ(编号：11)：蚯蚓幼虫肠腔培养物2.5份和粪培养物3.5份，黑水虻幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物4.5份，大麦虫幼虫肠道培养物3.5份和粪培养物5.5份，屎壳郎(蜣螂)幼虫肠道培养物2.5份和粪培养物2.5份，加入辅料鬼针草粉22份，腐植酸钠18份。
体外抑菌效果评估方法：
步骤1：制备固体培养基底层。吸取M-H固体培养基30ml倒入培养皿(直径：12.0cm±0.1cm)，待凝固。
步骤2：制备菌悬液。从某一鸡场和猪场采集新鲜粪污，在无菌条件下，分别取粪污样品各20g加入盛有180mL无菌水的三角瓶中，置于37℃恒温培养箱，振荡培养0.5h后取出，在超净工作台中静置10min，分别吸取20mL菌悬液装入无菌离心管中，备用。
步骤3：制备菌层。吸取一定量(比例：10滴/200ml)菌悬液，加到M-H培养基(50-55℃)中充分摇匀后，吸取20ml倒入已盛有培养基底层的平皿中，静置凝固10min，形成菌层。
步骤4：抑菌活性检测。用无菌镊子将牛津杯(内径6.0(±0.1)mm，外径7.8(±0.1)mm，高10.0(±0.1)mm)均匀放置制好的平板上。向牛津杯中分别加满各组合物(组合物终浓度为50％)；设空白对照组。将平板置于(36.9±0.1)℃培养箱中培养18-24h观察结果、拍照及测量抑菌圈直径大小(mm)。结果见表1及图1至图2。
活菌数量检测方法：
采用差异性平板计数法。差异化培养基配制如下：
(1)产蛋白酶菌株筛选培养基：葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、酪蛋白5g/L、氯化钠5g/L、酪氨酸0.1g/L；琼脂15g/L；pH7.5。校正pH值，装于三角瓶中，113℃高压灭菌15min备用。以产透明圈的为产蛋白酶菌。
(2)产酸菌株筛选培养基：蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母提取物5g，K2HPO41.56g，柠檬酸二铵1.5g(硫酸铵0.3g)，乙酸钠3g，葡萄糖10g，吐温802ml，MgSO4·7H2O 0.25g，用蒸馏水稀释至1L，加入1.5％(W/V)琼脂粉，用0.2％(W/V)轻质碳酸钙调pH值至6.2-6.4，121灭菌15min。以形成透明钙圈的为产酸菌。
(3)产脂肪酶菌株筛选培养基：橄榄油2.5ml，蛋白胨1.0g，牛肉膏0.5g，葡萄糖0.3g、PVA1.0g、氯化钠0.5g、吐温800.5ml，琼脂1.5g，溴甲酚紫wt％为0.016％，蒸馏水定容至100ml，调PH值为7.5，121℃高压灭菌15～20min备用。以产亮黄色透明圈的为产脂肪酶菌
(4)产纤维素酶菌株筛选培养基：CMC-Na 2g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2，将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH值，加入2％琼脂，装于三角瓶中，115℃高压灭菌15min备用。以产透明圈的为产纤维素酶菌。
表1各组合物体外抑菌试验评估
Figure BDA0003097009620000131
注：“+”表示有抑菌效果，“+”越多，抑菌效果越明显；“—”表示无抑菌效果。
组合物处理粪污除臭体外检测效果评估：
(1)采样
从广东省农业科学院动物科学研究所基地的其中一个鸡场的大鸡舍和猪场的大猪舍采集新鲜粪污，随机分为九个处理组(Ⅰ组～Ⅷ组及空白组)，每个处理组有15个重复。在无菌条件下，分别取粪污样品各100g平铺于各组的宽口锥形瓶(容量规格：1L)中，设空白组不作任何处理，八个处理组(Ⅰ组～Ⅷ组及空白组)分别应用不同组合的组合物(组合物Ⅰ至组合物Ⅷ)进行处理，往锥形瓶中粪污加入组合物，充分搅拌均匀，然后用3层无菌滤纸封口，移入培养箱(室温)中培养48h后，分别用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行H2S和NH3臭气检测，完成后取出粪污样品进行臭味物对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。
(2)检测方法建立
1)粪污臭味物质检测方法
对-甲酚、吲哚及粪臭素的测定采用高效液相色谱法参照(Walter Schüssler andLutz Nitschke,1999；Jensen et al.,1995)。检测器为Waters-2475荧光检测器，色谱柱为C18反相色谱柱；λex＝280nm，λem＝360nm。流动相：乙腈和水梯度洗脱。洗脱程序为：乙腈：水＝18:82,0min；乙腈：水＝45:55，25min；乙腈：水＝90:10，45min；乙腈：水＝100:0，46min；乙腈：水＝100:0，51min；乙腈：水＝18:82，56min；乙腈：水＝18:82，60min；流动相流速为：0.6mL/min，柱温为30℃，进样量：20μL。
2)标准曲线的建立
用流动相乙腈稀释对-甲酚、吲哚及粪臭素，获得不同工作浓度的标准样品，采用高效液相色谱法建立获得的标准曲线：对-甲酚(р-Cresol)：Y＝4.13×105X+7.59×104R2＝0.9995；吲哚(Indole)：Y＝2.18×107X+5.19×106R2＝0.9993；粪臭素(Skatole)：Y＝2.77×107X+2.45×106R2＝0.9995。
3)粪污臭气物质检测方法
粪污的臭气成分硫化氢(H2S)和氨气(NH3)检测：分别采用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行H2S和NH3臭气检测。结果表明，组合物Ⅰ体外处理鸡猪粪污的除臭能力明显优于其它各组合物。见表2。
表2各组合物体外处理评估数据统计
Figure BDA0003097009620000151
案例1
在韶关市某一养鸡场和英德市某一养猪场进行应用效果评价，分别选取各4栋中鸡舍和4栋的生长育肥猪舍，每栋鸡和猪舍的集粪池分别标记为空白组和处理组，空白组不做任何处理，处理组为应用组合物Ⅰ(按本发明的实例2制备方法)处理。按比例5kg/吨(组合物Ⅰ/粪污)向集粪池投放组合物Ⅰ，搅拌后，厌氧发酵48小时，于第三天上午分别用AeroqualS200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行硫化氢(H2S)和氨气(NH3)臭气检测，检测结束后分别从不同位点采集粪污样品(样品数量n≥30份)带回实验室，进行臭味物质对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。检测方法依照实验室建立的检测方法。
结果表明，在养殖场中应用组合物Ⅰ均能显著减少鸡猪粪污中臭气硫化氢(H2S)和氨气(NH3)的排放量及臭味物质的含量。见表3和表4。
表3鸡舍和猪舍经组合物Ⅰ处理后臭气物质含量变化(单位：PPM)
Figure BDA0003097009620000161
注：各组同行数据肩标有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表4中鸡舍和生长育肥猪舍经组合物Ⅰ处理后粪污中臭味物质含量变化
Figure BDA0003097009620000162
案例2
在清远市某一养鸡场和某一养猪场进行应用效果评价，分别选取各6栋大鸡舍和6栋的肥育猪舍，每栋鸡和猪舍的集粪池分别标记为空白组和处理组，空白组不做任何处理，处理组为应用组合物Ⅰ(按本发明的实例2制备方法)处理。按比例5kg/吨(组合物Ⅰ/粪污)向集粪池投放组合物Ⅰ，搅拌后，厌氧发酵48小时，于第三天上午分别用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行硫化氢(H2S)和氨气(NH3)臭气检测，检测结束后分别从不同位点采集粪污样品(样品数量n≥30份)带回实验室，进行臭味物质对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。检测方法依照实验室建立的检测方法。
结果表明，在养殖场中应用组合物Ⅰ均能显著减少鸡猪粪污中臭气硫化氢(H2S)和氨气(NH3)的排放量及臭味物质的含量。见表5和表6。
表5大鸡舍和肥育猪舍经组合物Ⅰ处理后臭气物质含量变化(单位：PPM)
Figure BDA0003097009620000171
注：各组同行数据肩标有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表6大鸡舍和肥育猪舍经组合物Ⅰ处理后粪污中臭味物质含量变化(单位：μg/g)
Figure BDA0003097009620000172
案例3
在广州从化区某一养鸡场和某一养猪场进行应用效果评价，分别选取各6栋小鸡舍和6栋的保育猪舍，每栋鸡和猪舍的集粪池分别标记为空白组和处理组，空白组不做任何处理，处理组为应用组合物Ⅰ(按本发明的实例2制备方法)处理。按比例5kg/吨(组合物Ⅰ/粪污)向集粪池投放组合物Ⅰ，搅拌后，厌氧发酵48小时，于第三天上午分别用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行硫化氢(H2S)和氨气(NH3)臭气检测，检测结束后分别从不同位点采集粪污样品(样品数量n≥30份)带回实验室，进行臭味物质对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。检测方法依照实验室建立的检测方法。
结果表明，在养殖场中应用组合物Ⅰ均能显著减少鸡猪粪污中臭气硫化氢(H2S)和氨气(NH3)的排放量及臭味物质的含量。见表7和表8。
表7小鸡舍和保育猪舍经组合物Ⅰ处理后臭气物质含量变化(单位：PPM)
Figure BDA0003097009620000181
注：各组同行数据肩标有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表8小鸡舍和保育猪舍经组合物Ⅰ处理后粪污中臭味物质含量变化(单位：μg/g)
Figure BDA0003097009620000182
案例4
在河源东源县某一养鸡场和某一养猪场进行应用效果评价，分别选取各6栋中鸡舍和6栋的大猪舍，每栋鸡和猪舍的集粪池分别标记为空白组和处理组，空白组不做任何处理，处理组为应用组合物Ⅰ(按本发明的实例2制备方法)处理。按比例5kg/吨(组合物Ⅰ/粪污)向集粪池投放组合物Ⅰ，搅拌后，厌氧发酵48小时，于第三天上午分别用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行硫化氢(H2S)和氨气(NH3)臭气检测，检测结束后分别从不同位点采集粪污样品(样品数量n≥30份)带回实验室，进行臭味物质对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。检测方法依照实验室建立的检测方法。
结果表明，在养殖场中应用组合物Ⅰ均能显著减少鸡猪粪污中臭气硫化氢(H2S)和氨气(NH3)的排放量及臭味物质的含量。见表9和表10。
表9鸡舍和猪舍经组合物Ⅰ处理后臭气物质含量变化(单位：PPM)
Figure BDA0003097009620000191
注：各组同行数据肩标有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表10鸡舍和猪舍经组合物Ⅰ处理后粪污中对-甲酚、吲哚及粪臭素含量变化(单位：μg/g)
Figure BDA0003097009620000192
案例5
在肇庆高要某一养鸡场和某一养猪场进行应用效果评价，分别选取各6栋大鸡舍和6栋的中猪舍，每栋鸡和猪舍的集粪池分别标记为空白组和处理组，空白组不做任何处理，处理组为应用组合物Ⅰ(按本发明的实例2制备方法)处理。按比例5kg/吨(组合物Ⅰ/粪污)向集粪池投放组合物Ⅰ，搅拌后，厌氧发酵48小时，于第三天上午分别用Aeroqual S200-EHT(H2S)手持式气体检测仪和Aeroqual S200-EHT(NH3)手持式气体检测仪进行硫化氢(H2S)和氨气(NH3)臭气检测，检测结束后分别从不同位点采集粪污样品(样品数量n≥30份)带回实验室，进行臭味物质对-甲酚、吲哚及粪臭素检测。检测方法依照实验室建立的检测方法。
结果表明，在养殖场中应用组合物Ⅰ均能显著减少鸡猪粪污中臭气硫化氢(H2S)和氨气(NH3)的排放量及臭味物质的含量。见表11和表12。
表11大鸡舍和中猪舍处理后硫化氢(H2S)和氨气(NH3)含量变化(单位：PPM)
Figure BDA0003097009620000201
注：各组同行数据肩标有相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。
表12大鸡舍和中猪舍处理后粪污中对-甲酚、吲哚及粪臭素含量变化(单位：μg/g)
Figure BDA0003097009620000202
综上所述：
通过上述的测试结果可以得到如下结论：
本发明的组合物对于畜禽类粪污的臭气成分(硫化氢(H2S)和氨气(NH3))与臭味物质(对-甲酚、吲哚、粪臭素等)起到明显的降解减排作用。
具体来说，其具有如下优势：
1、本发明的配方相比于空白样，其臭气臭味处理能力显著；
2、本发明中组合物含幼虫肠道培养物、幼虫粪便培养物、虫沙、鬼针草粉、腐植酸钠缺一不可。
3、蚯蚓肠腔培养物、黑水虻幼虫肠道培养物、大麦虫幼虫肠道培养物及屎壳郎幼虫肠道培养物是缺一不可的，当四者都存在时，其抑菌效果与臭味臭气物质减少是最为明显的。
4、蚯蚓幼虫粪培养物、黑水虻幼虫粪培养物、大麦虫幼虫粪培养物及屎壳郎幼虫粪培养物是缺一不可的，当四者都存在时，其抑菌效果与臭味臭气物质减少是最为明显的。
5、虫沙对于抑菌作用和粪污降解作用具有协同效应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：包括如下重量份组分：
蚯蚓幼虫肠腔培养物   2～4份；
蚯蚓幼虫粪培养物     3～5份；
黑水虻幼虫肠道培养物 3～5份；
黑水虻幼虫粪培养物   4～6份；
大麦虫幼虫肠道培养物 3～5份；
大麦虫幼虫粪培养物   5～7份；
屎壳郎幼虫肠道培养物 2～4份；
屎壳郎幼虫粪培养物   2～4份；
虫沙                 42～50份；
鬼针草粉             18～25份；
腐植酸钠             15～20份。
2.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：蚯蚓幼虫肠腔培养物总菌量≥3×1010cfu/g, 黑水虻幼虫肠道培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g、大麦虫幼虫肠道培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎幼虫肠道培养物总菌量≥1.5×1010cfu/g。
3.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：蚯蚓幼虫粪培养物总菌量≥3.5×1010cfu/g, 黑水虻幼虫粪培养物总菌量≥5.0×1010cfu/g、大麦虫幼虫粪培养物总菌量≥4.5×1010cfu/g及屎壳郎（蜣螂）幼虫粪培养物总菌量≥3.0×1010cfu/g。
4.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：所述虫沙为蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪、屎壳郎幼虫粪的混合；
其中，蚯蚓幼虫粪、黑水虻幼虫粪、大麦虫幼虫粪、屎壳郎幼虫粪的比例为2：2：3：3。
5.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：所述蚯蚓幼虫肠腔培养物、黑水虻幼虫肠道培养物、大麦虫幼虫肠道培养物及屎壳郎幼虫肠道培养物的制备方法均为如下工艺：
将对应的虫体的肠道匀浆得到浆状物，按3～5wt%的接种量接种到混合液体培养基Ⅰ中，厌氧培养36～48小时，并经过冻干处理得到；所述浆状物中固含量为45%～65%；
混合液体培养基Ⅰ含如下重量比组分：NA：TSA：LB：MRS=4：2：2：2。
6.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：所述蚯蚓幼虫粪培养物、黑水虻幼虫粪培养物、大麦虫幼虫粪培养物及屎壳郎幼虫粪培养物的制备方法均为如下工艺：
将对应的虫粪匀浆得到浆状物，按5～7wt%的接种量接种到混合液体培养基Ⅱ中，厌氧培养24～36小时，并经过冻干处理得到；所述浆状物中固含量为50%～70%；
混合液体培养基Ⅱ含如下重量比组分：NA：TSA：LB：MRS=4：3：2：1。
7.根据权利要求1所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物，其特征在于：所述组合物的性能指标如下：
总菌量≥5～7×109 cfu/g，其中，产纤维素酶细菌含量≥3.0×109cfu/g，产蛋白酶细菌含量≥4.5×109cfu/g，产脂肪酶细菌含量≥5.0×108cfu/g，产酸细菌≥3.5×108cfu/g；
（2）抑菌效果
猪粪抑菌直径≥28mm，鸡粪抑菌直径≥25mm。
8.一种如权利要求1-7任一所述的用于畜禽养殖粪污发酵除臭的组合物的制备方法，其特征在于：将各组分混合均匀即可得到。
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