CN114774402A - 一种微生物培育及固定化的方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物培育及固定化的方法，包括培育过程和固定化过程；对土著微生物的培育、对微生物菌剂的二次培养的过程中，从一开始就加入活性炭，使微生物均匀地附着在活性炭上，形成生物膜‑活性炭复合体。使得在后续的固定化过程中，活性炭对微生物起到保护作用。本发明将活性炭从一开始即加入水样中，进行微生物的培育，使微生物能附着在活性炭上增殖，最终使制成的微生物小球能非常快适应环境，水质净化效果更好，同时也能使固定化中的菌群分布更均匀。

Description

一种微生物培育及固定化的方法

技术领域

本发明属于生态工程和环境工程领域，涉及用于污染物降解的微生物培育及固定化包埋的方法。

背景技术

黑臭水体治理工程中水质改善的方法大致分为物理法、化学法和生物法三类。其中生物修复方法主要是利用微生物、植物或者原生动物降解、吸收、转化或清除环境污染，从而使得环境得到净化的一种修复方法。其中微生物净化技术是通过微生物的新陈代谢活动将水体中的污染物分解、转化，从而达到净化污水的目的。在污水治理方面，与物理法和化学法相比，微生物治理技术具有高效、节能、经济、绿色等优势。但无论是直接投加微生物菌剂或者培养土著微生物来净化水质，现有微生物治理技术都会遇到因微生物悬浮生长，而河水流动，使得微生物流失严重的问题。因此考虑将微生物进行固定，即用物理或者化学方法将游离微生物固定在载体上，使其高密度富集并保持活性，可有效防止菌体流失，提高抗冲击性能，具有效率高、反应易控制等优点。

微生物固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法和化学共价法等几种。其中，包埋法因具有方法简单、材料经济、化学稳定性好、微生物容量高和机械强度高等优点，受到众多研究者青睐。目前，微生物包埋方法使用的载体品种很多，包括天然高分子凝胶和合成有机高分子载体。其中聚乙烯醇PVA因无毒、价廉、抗微生物分解和机械强度高等特点受到重视，是目前应用较广的固定化载体之一，但其传质性能较差。而海藻酸钠SA则是固定化成型方便，但机械强度较差，易被微生物分解。当两者混合应用时，可避免固定化菌球的拖尾。但这些微生物固定化的小球仍存在以下几个问题：机械强度差，受曝气冲击影响大；由于微生物在培养过程中易形成大块的絮状体，导致在包埋过程中微生物分布不均匀；包埋过程中的搅拌、交联等步骤，对微生物存在损害，导致生成的固定化小球中的微生物活性降低，且需要更长时间才能体现效果的问题。

发明内容

针对上述的技术现状，本发明的目的是提供一种微生物培育及固定化的方法，具有制作成本低、操作简便的特点，并使制成的微生物小球能非常快适应环境，水质净化效果更好，同时也能使固定化中的菌群分布更均匀。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种微生物培育及固定化的方法，包括培育过程和固定化过程；从一开始培育就加入活性炭，使微生物均匀地附着在活性炭上，在后续的固定化过程中，活性炭对微生物起到保护作用。

进一步，包括对土著微生物的培育、对微生物菌剂的二次培养，菌群都可以从最初阶段就直接附着在活性炭上进行生长。

所述培育过程：取一定体积的水样，针对所需培养的微生物特性，在水中投加相应的营养物质。投加适量活性炭，曝气，并调节水体的pH值，使水样的pH值保持在7-9之间。经30-60天的培育后，将水体离心，得到带活性炭的高浓度微生物菌悬液。

进一步，本微生物培养过程中的微生物菌群，可以通过对地表水或生活污水中添加营养物质，从自然环境中的土著微生物菌群中，有针对性地培育出所需要的附着于活性炭生长的土著微生物菌群，也可通过对微生物菌剂加入活性炭，进行二次培养，获得附着于活性炭生长的微生物菌群。

进一步，所述营养物质包括C、N、P元素的营养物质，如碳酸根溶液，氯化铵溶液，磷酸二氢钾溶液等。根据培育的目标微生物特性，添加合适的营养盐。

进一步，所述活性炭为50-400目的活性炭，添加量为0.2-0.6％。

活性炭的添加能为微生物生长提供载体，微生物能与活性炭形成稳定的生物膜复合体，一方面能够提高微生物的抗冲击力，减轻后续在交联过程中对微生物造成的损伤；另一方面，在不添加载体时，悬浮生长的微生物易形成大块的絮状体，导致微生物难以与后续的PVA-SA溶液混合均匀，进而导致每个固定化小球内包埋的微生物数量可能相差较大，而添加活性炭后，微生物附着在活性炭上生长，不再产生絮状体，生物膜-活性炭复合体能均匀分布在液体中，可以使每个固定化小球包埋的微生物数量相对均匀。

此外，后续制备固定化小球时，适宜的活性炭浓度(例如0.2-0.6％)能增大固定化微生物颗粒的孔径、打通微孔通道使得一部分大分子量的有机分子通过，显著提升固定化小球的机械性能和传质性能。

固定化过程，制作聚乙烯醇-海藻酸钠(PVA-SA)溶液，将所获得的菌悬液混入溶液中，充分搅拌后，滴定小球至氯化钙-硼酸溶液中交联。

优选地，所述水样为地表水或生活污水，或微生物菌剂加入灭菌水中形成的水样。

在一种技术方案中，所述微生物菌为自养硝化细菌。

优选地，所述的营养物质，为氯化铵溶液、和磷酸二氢钾溶液，以及用于调节pH值的碳酸钠溶液。

优选地，所述活性炭为200目的活性炭，添加量为0.2％。

优选地，将聚乙烯醇、海藻酸钠与水混合，在90-95℃条件下搅拌成所述PVA-SA溶液，溶液中所述PVA含量为6％，SA为2％。

制作的混合溶液，所述PVA-SA溶液降温至30～35℃时，将所述的微生物菌悬液添加到所述PVA-SA溶液中，充分搅拌后制得混合溶液；

制作固定化小球，将所述混合溶液放置于针筒中，或滴定管中，滴定至氯化钙-硼酸溶液中进行交联。

将交联过程中的溶液放置4℃冰箱中，交联22-24小时。

将交联后的固定化小球取出，用清水清洗至中性，放入灭菌营养溶液中浸泡，并放入4℃冰箱中保存。

现有技术中，活性炭往往作为固定化的改性材料，用以增加聚乙烯醇小球的吸附能力。其中毕海涛等人在无机材料对PVA-H₃BO₃包埋固定化方法的改进中就发现添加活性炭后的固定化小球的吸附能力可以有效增加46倍。杨慧在添加吸附剂对包埋固定化凝胶小球性能的影响研究中也发现，加入少量活性炭能增加固定化微生物颗粒的孔径，达到吸附和包埋的双重效果。郝婧在包埋固定化脱氮菌群用于处理高氨氮废水的研究中也发现，活性炭的添加能影响固定化颗粒的成球性能、颗粒密度、机械强度和传质性能。但是对于从自然水体中进行土著微生物的培养，或者对采购而得的微生物菌剂的二次培养，尚没有从一开始就投加活性炭的先例。

由于采用上述技术方案，本发明获得的有益效果至少包括：

制备的每个固定化小球内包埋的微生物量更均匀：在已有的研究和专利中，活性炭的添加是为了提升固定化小球的机械性能和传质效果，基本上都是在固定化的环节才投加。本发明中强调，从最开始培育微生物时就在培养液中添加活性炭，这样微生物附着在活性炭上生长，不易产生絮状体，而是形成生物膜-活性炭复合体，能够均匀分布在液体中，能与PVA-SA溶液混合均匀，使每个固定化小球包埋的微生物数量相对均匀。

启动时间更短：活性炭的添加能为微生物生长提供载体，微生物能与活性炭形成稳定的生物膜复合体，能够提高微生物的抗冲击力，减轻后续因交联过程导致的微生物活性降低，从而使得固定化后的微生物能更快进入净化状态，启动时间更快。

净化效果更好：同不加活性炭的微生物固定化小球进行对比，加入活性炭后的固定化小球对水质净化效果明显更好。

在以往的研究中，活性炭往往作为固定化的改性材料，用于提升固定化小球的物理性能和吸附能力，并未考虑活性炭对微生物的保护；而且，目前大部分固定化包埋的菌是活性污泥或者是微生物的微生物菌剂，在固定化的过程中再投加入活性炭时，微生物已来不及在活性炭上附着生长，从而无法体现活性炭对微生物的保护作用。而在本发明中，将活性炭的引入提前到培育期间的步骤，这样即使采购了微生物菌剂，也可以通过二次培育，将活性炭同菌群很好的结合。也可以开发自然水体中的土著微生物，不需额外采购成本，即可以使微生物持续不断同活性炭行程稳定复合体，最终进行有效的固定化。

附图说明

图1为本发明实际实施例中所制成的固定化微生物小球图片。

图2为实际实施例中所制成的固定化微生物小球细节图片。

图3为本发明一种微生物培育及固定化方法制备的工艺流程示意图。

图4为本发明实际实施例中活性炭小球的氨氮日均去除速率同未加活性炭的固定化小球的氨氮日均去除速率的对比图。

图5为第二个实施例中离心得到的菌悬液图片。

图6为第二个实施例中制成的微生物固定化小球图片。

图7为第二个实施例中氨氮日均去除速率变化图。

图8为第三个实施例中离心得到的菌悬液图片。

图9为第三个实施例中制成的微生物固定化小球图片。

具体实施方式

本发明的微生物培育及固定化的方法，活性炭和微生物培育同步进行，活性炭从前期培育微生物菌时就投加，无论是通过对土著微生物的培育，还是对微生物菌剂的二次培养，菌群都可以从最初阶段就直接附着在活性炭上进行生长。另一方面，对微生物菌的保护效果更好：从一开始培育就加入活性炭，可以使微生物菌均匀地附着在活性炭上，在后续的固定化过程中，活性炭可以对微生物菌起到保护作用。

以下结合附图和实施例对本发明进一步加以说明。

图3所示的是本发明的一种微生物培育及固定化方法制备的工艺流程示意图。主要分为微生物培育部分和微生物固定化部分。微生物的菌剂种类根据所需处理的水质指标而相应选择，例如对于氨氮选择硝化细菌，对于硝酸盐氮选择硫自养反硝化菌。

实施例1

在本实施例中，选择培育河水中针对氨氮去除的土著硝化细菌。

微生物培育步骤包括：

步骤一、微生物水样准备；

选用自然河道中的河水，进行培育，用于得到针对氨氮去除的土著硝化细菌；

步骤二、加入活性炭；在1000ml水样中加入2g 200目活性炭，充分搅拌，得到活性炭混合溶液；

步骤三、持续曝气，营养盐和pH值调节；在接下去30-60日间，水样持续曝气，同时往其中不断加入氯化铵溶液和磷酸二氢钾溶液，并且测得溶液中的氨氮浓度；

其中，前7-10日的氨氮浓度起始浓度达到100mg/L,10日后氨氮起始浓度调整到200mg/L。当氨氮浓度在微生物的作用下降为0mg/L后，重新加入营养盐补充。同时一日1-2次测量水样pH值，通过加入碳酸钠饱和溶液调节，使水样pH值一直保持在7-9之间。整个硝化过程是一个产酸的过程，反应中pH值会越来越低，当pH值低于6以后，反应基本停止了，因此需要持续关注pH值，及时加碱；

步骤四、制作菌悬液；将培育了60天的1000ml水样在10000rpm的转速下离心3分钟，去除上清液后，最后得到约30ml左右的菌悬液；

步骤五、聚乙烯醇-海藻酸钠溶液制备；取6g聚乙烯醇、2g海藻酸钠与90ml水混合，在90-95℃条件下搅拌制成聚乙烯醇-海藻酸钠溶液；

步骤六、菌悬液加入；待聚乙烯醇-海藻酸钠溶液降温至30-35℃后，将离心后的菌悬液取10ml加入溶液中，充分搅拌后制得混合溶液；

步骤七、微生物小球滴定；使用50ml针筒，将混合溶液滴定至事先配置好的4％氯化钙-3％硼酸溶液中。充分搅拌发生凝胶化反应后，形成微生物小球；

步骤八、小球交联；将滴定后微生物小球浸泡在4％氯化钙-3％硼酸溶液中，进行交联，并放置在4℃冰箱中保存22-24小时，等待交联完成；

步骤九、洗涤保存。将溶液从冰箱中取出，用清水清洗，直至pH值回到7左右。取出小球，放入灭菌的河水中浸泡，并放入冰箱保存。

图1和图2所示的为该实施例中制成的微生物固定化小球。

氨氮去除试验：

将所制成的含有活性炭的微生物固定化小球约100g，同采用相同方式但未放活性炭进行培养的微生物固定化小球约100g，分别放入起始氨氮浓度约为180mg/L的500ml水样中，在室温条件下曝气，反应约10日。定期用纳氏试剂紫外光分光光度计法测量水样中的氨氮浓度。由图3可以发现，活性炭小球每日的氨氮下降速率可达50mg/L/天以上，而未放置活性炭的微生物固定化小球的每日下降速率仅为20mg/L/天左右。

经过活性炭培养的微生物固定化小球差不多第3日，基本就恢复了固定化之前水样培养期间氨氮去除速率，达到50mg/L/天以上。

实施例2

在本实施例中，选择对采购的商业化硝化细菌进行二次培养。

微生物培育步骤包括：

步骤一、微生物水样准备；

选用市面上采购的效果较好的商业化硝化细菌约10ml，投加入990ml灭菌河水中，进行二次培养；

步骤二、加入活性炭；在1000ml水样中加入4g 400目活性炭，充分搅拌，得到活性炭混合溶液；

步骤三、持续曝气，营养盐和pH值调节；在接下去30日内，水样持续曝气，同时往其中不断加入氯化铵溶液和磷酸二氢钾溶液，并且测得溶液中的氨氮浓度；

其中，前7-10日的氨氮浓度起始浓度达到100mg/L,10日后氨氮起始浓度调整到200mg/L。当氨氮浓度在微生物的作用下降为0mg/L后，重新加入营养盐补充。同时一日1-2次测量水样pH值，通过加入碳酸钠饱和溶液调节，使水样pH值保持在7-9之间；

步骤四、制作菌悬液；将培育了30天的1000ml水样在10000rpm的转速下离心3分钟，去除上清液后，最后得到约40ml左右的菌悬液；

步骤五、聚乙烯醇-海藻酸钠溶液制备；取6g聚乙烯醇、2g海藻酸钠与90ml水混合，在90-95℃条件下搅拌制成聚乙烯醇-海藻酸钠溶液；

步骤六、菌悬液加入；待聚乙烯醇-海藻酸钠溶液降温至30-35℃后，将离心后的菌悬液取10ml加入溶液中，充分搅拌后制得混合溶液；

步骤七、微生物小球滴定；使用电动滴定管，将混合溶液滴定至事先配置好的4％氯化钙-3％硼酸溶液中。充分搅拌发生凝胶化反应后，形成微生物小球；

步骤八、小球交联；将滴定后微生物小球浸泡在4％氯化钙-3％硼酸溶液中，进行交联，并放置在4℃冰箱中保存22-24小时，等待交联完成；

步骤九、洗涤保存。将溶液从冰箱中取出，用清水清洗，直至pH值回到7左右。取出小球，放入灭菌的河水中浸泡，并放入冰箱保存。

图5为该实施例中离心得到的菌悬液。图6为该实施例中制成的微生物固定化小球。

氨氮去除试验：

将所制成的含有活性炭的微生物固定化小球约10g，放入起始氨氮浓度约为180mg/L的500ml水样中，在室温条件下曝气，反应约10日。定期用纳氏试剂紫外光分光光度计法测量水样中的氨氮浓度。从图7可以发现，活性炭小球每日的氨氮下降速率可达20mg/L/天以上。

实施例3

在本实施例中，选择对生活污水中的土著硝化细菌进行培养。

微生物培育步骤包括：

步骤一、微生物水样准备；

取用生活污水约450ml，同550ml灭菌河水进行混合，准备对其中生活污水的土著硝化细菌进行培养；

步骤二、加入活性炭；在1000ml水样中加入6g 100目活性炭，充分搅拌，得到活性炭混合溶液；

步骤三、持续曝气，营养盐和pH值调节；在接下去50日内，水样持续曝气，同时往其中不断加入氯化铵溶液和磷酸二氢钾溶液，并且测得溶液中的氨氮浓度；

其中，前7-10日的氨氮浓度起始浓度达到100mg/L,10日后氨氮起始浓度调整到200mg/L。当氨氮浓度在微生物的作用下降为0mg/L后，重新加入营养盐补充。同时一日1-2次测量水样pH值，通过加入碳酸钠饱和溶液调节，使水样pH值保持在7-9之间；

步骤四、制作菌悬液；将培育了50天的1000ml水样在10000rpm的转速下离心3分钟，去除上清液后，最后得到约40ml左右的菌悬液；

步骤五、聚乙烯醇-海藻酸钠溶液制备；取6g聚乙烯醇、2g海藻酸钠与90ml水混合，在90-95℃条件下搅拌制成聚乙烯醇-海藻酸钠溶液；

步骤六、菌悬液加入；待聚乙烯醇-海藻酸钠溶液降温至30-35℃后，将离心后的菌悬液取10ml加入溶液中，充分搅拌后制得混合溶液；

步骤七、微生物小球滴定；使用50ml针筒，将混合溶液滴定至事先配置好的4％氯化钙-3％硼酸溶液中。充分搅拌发生凝胶化反应后，形成微生物小球；

步骤八、小球交联；将滴定后微生物小球浸泡在4％氯化钙-3％硼酸溶液中，进行交联，并放置在4℃冰箱中保存22-24小时，等待交联完成；

步骤九、洗涤保存。将溶液从冰箱中取出，用清水清洗，直至pH值回到7左右。取出小球，放入灭菌的河水中浸泡，并放入冰箱保存。

图8为该实施例中离心得到的菌悬液。图9为该实施例中制成的微生物固定化小球。

将所制成的含有活性炭的微生物固定化小球约100g，放入起始氨氮浓度约为180mg/L的500ml水样中，在室温条件下曝气，反应约20日。定期用纳氏试剂紫外光分光光度计法测量水样中的氨氮浓度。可以发现，活性炭小球每日的氨氮下降速率稳定在20mg/L/天左右。

本发明的应用，从微生物培育期间就同步加入活性炭，可以增加对微生物菌的保护，固定化时微生物分布更均匀，且微生物启动时间更短，水质净化效果更好。

上述相关说明以及对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些内容做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述相关说明以及对实施例的描述，本领域的技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种微生物培育及固定化的方法，包括培育过程和固定化过程；其特征在于：从一开始培育就加入活性炭，使微生物菌均匀地附着在活性炭上，在后续的固定化过程中，活性炭对微生物菌起到保护作用。

2.根据权利要求1所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：包括对土著微生物的培育、对微生物菌剂的二次培养，菌群都可以从最初阶段就直接附着在活性炭上进行生长。

3.根据权利要求1所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述培育过程：取一定体积的水样，针对所需培养的微生物特性，在水中投加相应的营养物质；投加入适量活性炭，持续曝气，并调节水体的pH值，使水样的pH值保持在7-9之间；经30-60天的培育后，将水体离心，得到带活性炭的高浓度微生物菌悬液。

4.根据权利要求3所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述营养物质包括含碳酸根溶液，氯化铵溶液，磷酸二氢钾溶液。

5.根据权利要求1所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述活性炭为50-400目的活性炭，添加量为0.2-0.6％。

6.根据权利要求1所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述固定化过程，制作聚乙烯醇-海藻酸钠(PVA-SA)溶液，将所获得的菌悬液混入溶液中，充分搅拌后，滴定小球至氯化钙-硼酸溶液中交联。

7.根据权利要求3所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述水样为地表水或生活污水，或微生物菌剂加入灭菌水中形成的水样。

8.根据权利要求3所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：所述活性炭为200目的活性炭，添加量为0.2％。

9.根据权利要求6所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：将聚乙烯醇、海藻酸钠与水混合，在90-95℃条件下搅拌成所述PVA-SA溶液，溶液中所述PVA含量为6％，SA含量为2％。

10.根据权利要求9所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于：制作的混合溶液，所述PVA-SA溶液降温至30～35℃时，将所述的微生物菌悬液添加到所述PVA-SA溶液中，充分搅拌后制得混合溶液。

11.根据权利要求3所述的微生物培育及固定化的方法，其特征在于，还包括：制作固定化小球，将所述混合溶液放置于针筒中，或滴定管中，滴定至氯化钙-硼酸溶液中进行交联；

将交联过程中的溶液放置4℃冰箱中，交联22-24小时；

将交联后的固定化小球取出，用清水清洗至中性，放入灭菌营养溶液中浸泡，并放入4℃冰箱中保存。

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