CN114181863B - 一种紫色杆菌属菌株e1及其制备方法和在降解邻苯二甲酸酯上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种紫色杆菌属菌株E1及其制备方法和在降解邻苯二甲酸酯上的应用，本发明富集驯化筛选到一株邻苯二甲酸酯降解菌，命名为紫色杆菌属菌株E1，与Janthinobacterium属有99％的同源性。保藏编号：CGMCC No.23969；与现有技术相比，本发明提供的紫色杆菌属菌株E1，能够降解邻苯二甲酸酯，在重金属胁迫的条件下，降解率仍然达到90％以上。菌株E1的降解基因稳定性强，且可能存在一定的抗性基因，为解决生态环境的复合污染提供了新的途径。

Description

一种紫色杆菌属菌株E1及其制备方法和在降解邻苯二甲酸酯 上的应用

技术领域

本发明属于微生物降解领域，具体涉及一种紫色杆菌属菌株E1及其制备方 法和在降解邻苯二甲酸酯上的应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalates esters，PAEs)，是一类脂溶性塑化剂，俗 称酞酸酯，一般由邻苯二甲酸酐与对应醇类在酸催化下通过酯化形成的，是广 泛添加于塑料制品中增加柔韧性的一类高分子材料助剂，基本结构是由一个芳 烃环和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，是一类不溶于水，易溶于甲醇、乙醚 等有机溶剂的中等极性物质，具有流动性大、凝固点低和在环境中残留时间长， 容易在生物中富集的特点。邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸(2-乙基) 己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate， DEP)是目前工业上使用量较多的4种塑化剂。PAEs与塑料分子的结合方式不 是共价键而是范德华力或氢键，呈游离态，因此随着时间推移，会从塑料制品 内向外迁移至外界环境，近年来，在大气、土壤、水体中都检测到该物质的残 留。存在于环境介质中残留的PAEs不仅对生态系统造成危害影响动植物生长， 同时通过动植物的生物富集作用积累，通过食物链传递，危害人类健康。

邻苯二甲酸酯是一种可干扰生物体内分泌的化学物质，对人体具有肝肾毒 性、生殖毒性和“三致”毒性，使胎儿间质细胞发育紊乱，导致男性生殖道异常， 出现癌症、畸形以及内分泌系统紊乱等现象，邻苯二甲酸酯由于其分子结构及 化学性质导致在自然环境中水解和光解速度缓慢，在工业上往往采用物理吸附 法或氧化去除法来降低废水废料中邻苯二甲酸酯的含量，但存在操作繁琐、催 化剂成本高、可能产生二次污染的问题。

微生物降解具有绿色、高效、低成本的特点，从20世纪初以来在污泥、土 壤、水体中已发现多种能够降解PAEs的微生物，对降解途径、降解酶基因有一 定的研究基础。但是仅局限于对降解菌单一功能的研究，在复杂环境实际应用 方面比较欠缺。尚未见到关于菌株在重金属胁迫条件下降解研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种紫色杆菌属菌株E1及其制备方法，富集驯化筛 选到一株邻苯二甲酸酯降解菌，命名为E1，与Janthinobacterium属有99％的同 源性。

本发明领域目的在于提供一种紫色杆菌属菌株E1在降解邻苯二甲酸酯上的 应用，在重金属胁迫的条件下，对邻苯二甲酸(2-乙基)己酯降解率仍然达到 90％以上。

本发明具体技术方案如下：

一种紫色杆菌属菌株E1，保藏编号：CGMCC No.23969，所述紫色杆菌属 菌株E1已经于2021年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.23969，建议的分类命名为 Janthinobacterium psychrotolerans。

所述紫色杆菌属菌株E1的16SrDNA基因序列表如SEQUENCE LISTING <400>1所示。

紫色杆菌属菌株E1的菌落为圆形，淡红色，表面粗糙，边缘平整，菌体大 小为1.5-2μm，两端钝圆，短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢，能发酵葡萄糖、 蔗糖，不能发酵乳糖，具有分解淀粉的能力，过氧化氢酶、脲酶均为阳性，无 反硝化作用，无明胶水解作用。

本发明提供的一种紫色杆菌属菌株E1的制备方法，包括以下步骤：

1)称取芜湖市垃圾厂的土壤样本5±0.1g加入100mg/L含DEHP的MSM 液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养7d，将该培养液转接到新鲜的100ml MSM 液体培养基中，此时培养基的DEHP含量增加至200mg/L，同样条件下继续培 养7d，如此重复，每次转接DEHP的浓度都增加100mg/L，直至DEHP浓度增 加到800mg/L，富集驯化结束；

2)将富集后的培养液均匀涂布在DEHP浓度为100mg/L的MSM平板上， 30℃培养5d后，挑选生长良好的菌落到新的MSM培养基上划线培养，直至出 现单菌落，显微镜检法确定单菌落纯度后，将获得的菌株E1斜面4℃保存备用。

本发明提供的一种紫色杆菌属菌株E1在降解邻苯二甲酸酯上的应用。用于 降解DEHP、DBP、DEP、DMP。

本发明还提供一种紫色杆菌属菌株E1在重金属胁迫下降解邻苯二甲酸酯的 应用。尤其是在Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺或Cd²⁺存在条件下降解邻苯二甲酸酯的应用。 所述重金属浓度为0-100mg/L。

本发明还提供一种紫色杆菌属菌株E1在污染物存在条件下降解邻苯二甲酸 酯的应用。尤其是在2-OH吡啶或丙草胺存在条件下降解邻苯二甲酸酯的应用。 所述污染物浓度为0-100mg/L。

与现有技术相比，本发明提供的紫色杆菌属菌株E1，在重金属胁迫的条件 下，降解率仍然达到90％以上。菌株E1的降解基因稳定性强，且可能存在一定 的抗性基因，为解决生态环境的复合污染提供了新的途径。

附图说明

图1为LB平板上E1菌落图；

图2为菌株E1革兰氏染色形态图(10×100)；

图3为菌株E1扫描电镜形态图；

图4为基于菌株E1 16SrDNA序列和Janthinobacterium模式菌株的序列构 建的系统发育树；

图5为邻苯二甲酸酯标样的标准曲线；

图6为菌株E1对DEHP、DBP、DMP、DEP的降解情况；

图7为培养6d内菌株E1对DEHP的降解动态；

图8为菌株E1对不同初始浓度DEHP的降解曲线；

图9为不同pH对菌株E1生长及降解DEHP的影响；

图10为不同盐浓度对菌株E1生长及降解DEHP的影响；

图11为不同温度对菌株E1生长及降解DEHP的影响；

图12为不同金属离子及浓度对E1降解DEHP的影响；

图13为2-OH吡啶和丙草胺对E1降解DEHP的影响。

具体实施方式

本发明使用的试剂如下:

邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate，DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸二 (2-乙基己基)酯(di 2-ethylhexyl phthalate，DEHP)、四种邻苯二甲酸酯均购 自Macklin(AR，＞99％)，用甲醇配成10g/L的母液备用。正己烷(AR，>99％)、 甲醇(HPLC)(购自安耐吉化学)，无水硫酸铜(AR)、七水合硫酸锌(AR)、八水 合硫酸镉(AR)、三水合醋酸铅(AR)用蒸馏水配成1g/L的母液，灭菌后备用。其 余药品没有特殊说明均为分析纯。

培养基的制备方法如下：

LB培养基(g/L)：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，固体添加琼脂15g， 加蒸馏水定容至1L，pH 7.2-7.4，在121℃下高压灭菌30min，即得。

无机盐(MSM)培养基(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 7.60g，(NH4)₂SO₄ 2.0g，CaCl₂ 0.02g，KH₂PO₄ 4.0g，MgCl₂·6H₂O 0.34g，FeCl₂·4H₂O 0.0028g，Na₂MoO₄·H₂O 0.0024g，MnCl₂·2H₂O 0.0015g，固体添加琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，pH 7.2-7.4，在121℃下高压灭菌30min，即得。

制作含有PAEs的培养基时，待培养基温度降至室温后，再按比例添加PAEs， 防止高温对底物的破坏。

一种紫色杆菌属菌株E1的制备方法，包括以下步骤：

1)DEHP降解菌的富集驯化：

称取5g±0.1g土壤加入100mL含有100mg/L含DEHP的MSM液体培养 基中，30℃、150rpm振荡培养7d。将该培养液转接到新鲜的100ml MSM液 体培养基中，此时培养基的DEHP含量增加至200mg/L，同样条件下继续培养 7d。如此重复，每次转接DEHP的浓度都增加100mg/L，直至DEHP的浓度增 加为800mg/L，富集驯化结束。

2)DEHP降解菌分离纯化及鉴定

将富集后的培养液均匀涂布在DEHP浓度为100mg/L的MSM平板上，30℃ 培养，5d后出现菌落。挑选生长良好的单菌落到新的固体MSM培养基上划线 培养，直至出现单菌落，显微镜检法确定单菌落纯度后，将获得的菌株E1斜面 4℃保存备用。

分子学鉴定：

DNA的提取：取菌株E1培养至对数期的菌液1mL，置于离心机10000r/min 离心3min后用无菌水洗涤收集菌体，用细菌DNA提取试剂盒(TIA Namp Bacteria DNA Kit)提取DNA。

PCR扩增反应体系：

利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，

1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)扩增菌株的16S r DNA序列

PCR反应体系(50μL)：

PCR产物的回收与测序PCR：

产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后利用DNA回收试剂盒对 1400-1500bp的扩增产物进行回收，送至安徽通用公司测序。

菌株的系统发育分析：

16S r DNA序列是原核生物基因组内部比较保守的序列，通过构建进化树进 行系统发育分析，可以用来分析菌株之间的亲缘关系。将测的16S r DNA序列 提交到Gen Bank数据库，通过BLAST在NCBI的NR数据库中检索与其同 源的序列，挑选合适的序列，在MEGA6.0软件上用Neighbor-Joining(邻接法) 构建系统发育树，确定菌株的种属。

实施例2

一种紫色杆菌属菌株E1对DEHP的降解应用，具体如下：

DEHP、DBP、DEP、DMP标准曲线的制备：

用甲醇配浓度为0、25、50、100、200mg/L的DEHP标准样品，过0.22μm 有机相滤膜，做HPLC分析，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做回归 曲线拟合分析，多次重复试验直至R²>0.99，备用。DBP、DEP、DMP按照同样 的方法制作标准曲线。

高效液相色谱法(HPLC)条件：色谱柱：agilent色谱柱(250mm*4.6μm)，流 动相：甲醇:水＝90:10，检测器：紫外检测器，波长228nm，柱温：35℃，流速： 0.8mL/min，进样量：10μL。

邻苯二甲酸酯(DEP、DMP、DBP、DEHP)各浓度水平的峰面积与其浓度在 所建立的色谱条件下进行HPLC测定，呈现良好的线性关系，R²>0.99，结果如 图5。利用获得的线性关系，方便检测后续菌种降解后DEHP、DBP、DEP、DMP 等的残留浓度。

菌株E1对DEHP、DBP、DEP、DMP降解率的测定：

1)种子菌悬液的制备

挑取菌株E1于LB液体培养基中，30℃，150rpm，振荡培养至对数期 (OD₆₀₀＝0.7)，此菌液作为种子菌液，用于以下降解测定。取1ml菌液，6000rpm， 离心5min，弃上清，加入1mL已灭菌的MSM的培养基，同等条件下离心，弃 上清，重复操作三次，充分洗涤菌体，最后用MSM培养基调OD_600nm＝1，获得 菌悬液。

2)培养及样品前处理

将步骤1)制备的菌悬液以5％体积比接种于DEHP浓度为400mg/L的100 ml MSM培养基中150rpm，30℃下培养6d(pH＝7，盐度是0的条件下培养)； 以不接菌同等浓度DEHP的MSM培养基在相同条件下培养为对照组。将培养6 天的培养液转入50mL离心管中，8000rpm，10min，去除菌体，将上清液倒入 分液漏斗中，加入等量的正己烷，并用10mL正己烷洗涤培养所用的容器和离 心管后并入分液漏斗；振荡分液漏斗5min后静置10～15min使完全分层，留水 相加入等量正己烷萃取，该萃取过程重复3次。收集分液漏斗中的正己烷于鸡 心瓶中，在70℃，42r/min条件下旋转蒸发回收正己烷，结束后用10mL甲醇重 溶鸡心瓶中的DEHP、DBP、DEP、DMP。重溶样品通过0.22μm有机相注射器 滤膜过滤，置于棕色上样品瓶内，用高效液相色谱仪测定样品中DEHP的残留 量。对照组也按照相同的方法进行检测DEHP的残留量。

降解率测定方法：降解率(％)＝(1-A₁/A₀)×100；

A₁为菌株E1处理后DEHP的残留浓度，A₀为对照处理DEHP的残留浓度。

对DEHP的降解率为96.8％。

将DEHP分别替换为DBP、DEP、DMP，按照上述相同的方法进行测试。

DEHP是由一个芳烃环和两个非线性脂肪侧链组成，其非线性脂肪侧链比 DBP、DMP更为复杂，菌株不仅可以降解DEHP，培养6d对DBP、DEP和DMP 降解率分别为98.8％、99.6％和70.6％，降解情况如图6所示。。

菌株E1生长曲线及对DEHP降解变化的测定：

按照上述方法，再次进行实验：将菌株E1的菌悬液以5％的体积比接种 DEHP初始浓度为400mg/L的100ml MSM培养基中，150rpm，30℃下培养6d， 每隔1d取一次样，共6d。用分光光度计测OD_600nm表示菌株生长情况，用HPLC 检测DEHP残留量。

菌株E1对DEHP的降解率与生长情况成正相关，6d后，菌株E1对初始浓 度400mg/L的DEHP降解率可达99.5％，见图7。菌株生长延滞期较短，前2 天菌体生长迅速，第3天菌体数目达到峰值，培养2～4天DEHP的降解速率最 快，第5天后降解速率缓慢，可能碳源含量减少，营养不足，菌株进入衰退期， 降解速率下降。

菌株降解动力学拟合分析：

为了进一步了解菌株对DEHP的降解规律，将菌悬液以5％的体积比接种于 DEHP初始浓度分别为300、600、900、1200mg/L的100ml MSM培养基中，30℃， 150rpm，培养120h，每隔24h取样，使用HPLC分析计算DEHP残留浓度， 与降解时间的变化做回归分析，求出残留浓度与降解时间的降解动力学方程。

菌株E1降解动力学拟合分析：

使用指数模型建立不同初始浓度DEHP降解动力学数学模型见式(1)，对 该指数模型进行对数转换，结果见式(2)，且降解反应的半衰期(t_1/2，h)的计 算如式(3)，计算得出DEHP降解菌在不同初始质量浓度DEHP的降解动力学 方程如表1。浓度在300～1200mg/L半衰期均在40～60h，菌株E1的降解能力稳 定，降解能力较强。

C_t＝C₀·e^-kt (1)

ln^Ct＝﹣kt+A (2)

T_1/2＝ln(2/k) (3)

注：式中C₀表示DEHP初始质量浓度；C_t表示t时刻DEHP质量浓度；k表示 DEHP降解速率常数；A为常数。

表1降解菌株E1对不同初始质量浓度DEHP的降解动力学方程

DEHP初始底物浓度为300、600、900、1200mg/L时降解曲线如图8。 DEHP浓度在300～1200mg/L时对E1的生长没有明显的抑制作用，其降解符合 一级动力学方程。

菌株生长条件优化：

将菌悬液以5％的体积比接种于DEHP初始浓度为400mg/L的100ml MSM 培养基内，150rpm的条件下振荡培养5d，用分光光度计测OD_600nm的吸光值， HPLC检测PAEs的残留浓度，改变培养的盐浓度、温度和pH，分析最适生长 盐浓度、温度和pH，具体控制条件如下：

盐浓度条件优化：上述条件下，设置pH为7、温度为30℃，盐浓度梯度为 0％、2％、4％、6％、8％、10％，按NaCl质量调节盐浓度。

温度条件优化：上述条件下，设置pH为7、盐浓度为0％，温度10℃、20℃、 30℃、40℃、50℃，设置摇床温度控制不同温度。

pH条件优化：上述条件下，设置盐浓度为0％、温度为30℃，pH梯度为4、 5、6、7、8、9，用1M的NaOH，2M的HCl调节pH。

pH对菌株E1降解DEHP的影响:

由图9可知，菌株E1降解DEHP的最适pH为7，降解率为98.8％，pH为 4-6菌株E1降解率不足50％，生长情况差，说明菌株对酸性敏感，原因可能是 高H⁺浓度引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏相关酶的活性，但在 碱性条件下生长良好，在pH＝9时降解率依然可以达到90％以上，说明菌株耐受 碱的能力强，有关的降解酶在碱性条件下也可能存在较强的活性，菌株E1在pH 7-9的环境具有良好的适应能力，有较好的应用潜力。

盐度对菌株E1降解DEHP的影响：

由图10可知，菌株E1降解DEHP的最适盐浓度为2％，降解率为99.8％， 菌株在0～2％盐浓度条件下生长好，属于非嗜盐菌，而高盐条件会破坏菌体渗透 压平衡，抑制菌体内的生理生化反应，从而影响菌体的生长。

温度对菌株E1降解DEHP的影响：

由图11可以看出，菌株E1的最适生长温度为30℃，在20℃、40℃仍然保 持80％左右的降解率，温度适应范围广。

重金属离子对菌株E1降解DEHP的影响：

将菌悬液以5％的体积比接种于分别含有Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺浓度为0、 25、50、100mg/L，DEHP初始浓度为400mg/L的100ml MSM培养基内，30℃、 150rpm的条件下振荡培养5d，之后用分光光度计测OD_600nm的吸光值，HPLC 检测DEHP的残留浓度。

上述实验结果如图12可见，除Cu²⁺离子外，菌株E1对其他三种金属离子 具有较强的耐受能力，在重金属胁迫的条件下，降解率仍然达到90％以上。菌 株E1的降解基因稳定性强，且可能存在一定的抗性基因，为解决生态环境的复 合污染提供了新的途径。

2-OH吡啶和丙草胺对E1降解DEHP的影响：

将菌悬液以5％的体积比接种于分别含有2-OH吡啶、丙草胺浓度为0、25、 50、100mg/L，DEHP初始浓度为400mg/L的100ml MSM培养基内，30℃、150rpm的条件下振荡培养5d，之后用分光光度计测OD_600nm的吸光值，HPLC 检测PAEs的残留浓度。

上述实验结果如图13可见，污染物2-OH吡啶对于菌株生长基本无影响， 甚至在一定程度上可以促进DEHP的降解，原因可能是其与PAEs有相似的环状 结构，且结构简单毒性较小。常见除草剂丙草胺作为一种细胞抑制剂，对E1降 解DEHP起到抑制作用，浓度越高抑制作用越强，但在25及50mg/L的浓度下， 对DEHP降解率仍然可以达到50％，说明菌株E1具有一定对抗环境污染物的能 力。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种紫色杆菌属菌株E1及其制备方法和在降解邻苯二甲酸酯上的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 菌株E1

<400> 1

catgcaagtc gaacggcagc acggagcttg ctctggtggc gagtggcgaa cgggtgagta 60

atatatcgga acgtaccctg gagtggggga taacgtagcg aaagttacgc taataccgca 120

tacgatctac ggatgaaagt gggggatcgc aagacctcat gctcgtggag cggccgatat 180

ctgattagct agttggtagg gtaaaagcct accaaggcat cgatcagtag ctggtctgag 240

aggacgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 300

gggaattttg gacaatgggc gcaagcctga tccagcaatg ccgcgtgagt gaagaaggcc 360

ttcgggttgt aaagctcttt tgtcagggaa gaaacggtgg gagctaatat ctcctgctaa 420

tgacggtacc tgaagaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480

gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgtg cgcaggcggt tttgtaagtc 540

tgatgtgaaa tccccgggct caacctggga attgcattgg agactgcaag gctagaatct 600

ggcagagggg ggtagaattc cacgtgtagc agtgaaatgc gtagatatgt ggaggaacac 660

cgatggcgaa ggcagccccc tgggtcaaga ttgacgctca tgcacgaaag cgtggggagc 720

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccctaaacga tgtctactag ttgtcgggtc 780

ttaattgact tggtaacgca gctaacgcgt gaagtagacc gcctggggag tacggtcgca 840

agattaaaac tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggtggatgat gtggattaat 900

tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctaccc ttgacatggc tggaatcccc gagagattgg 960

ggagtgctcg aaagagaacc agtacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cattagttgc tacgaaaggg 1080

cactctaatg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca 1140

tggcccttat gggtagggct tcacacgtca tacaatggta catacagagc gccgccaacc 1200

cgcgaggggg agctaatcgc agaaagtgta tcgtagtccg gattgtagtc tgcaactcga 1260

ctgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gtcgcggtga atacgttccc 1320

gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagcgggt tttaccagaa gtaggtagct 1380

taaccgcaag gagggcgcta ccac 1404

Claims (8)

1.一种紫色杆菌属菌株E1，保藏编号：CGMCC No.23969。

2.根据权利要求1所述的紫色杆菌属菌株E1，其特征在于，所述紫色杆菌属菌株E1的16SrDNA基因序列表如SEQ ID NO: 1所示。

3.一种权利要求1或2所述的紫色杆菌属菌株E1在降解邻苯二甲酸酯上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于降解DEHP、DBP、DEP 或DMP。

5.一种权利要求1或2所述的紫色杆菌属菌株E1在重金属胁迫下降解邻苯二甲酸酯的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重金属离子为Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺或Cd²⁺。

7.一种权利要求1或2所述的紫色杆菌属菌株E1在污染物存在条件下降解邻苯二甲酸酯的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述污染物为2-OH吡啶或丙草胺。

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