CN112048451A

CN112048451A - 一种柠檬酸杆菌及其在处理含硫酸盐废水处理中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法

Info

Publication number: CN112048451A
Application number: CN202010905169.7A
Authority: CN
Inventors: 郭楚玲; 柯常栋; 姜梦戈; 张思宇; 曾宇飞; 卢桂宁; 党志
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-01
Also published as: CN112048451B

Abstract

本发明公开了一种柠檬酸杆菌及其在处理含硫酸盐废水处理中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法。该柠檬酸杆菌具有硫酸盐还原的能力，其编号为Citrobacter sp.EBS8，2020年7月13日保藏于广东省微生物菌株保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:61090。该菌株能以乳酸作为碳源，在厌氧条件下能够还原硫酸盐(还原率100％)；菌株在初始pH为6‑8内均具有较强的硫酸盐还原能力，其最适初始pH为6.0。本发明的柠檬酸杆菌为兼性厌氧菌，好氧生长迅速，厌氧还原硫酸盐，易于培养，在处理含SO₄ ^2‑的废水(如酸性矿山废水)方面上有广泛应用。

Description

一种柠檬酸杆菌及其在处理含硫酸盐废水处理中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法

技术领域

本发明属于含硫酸盐废水处理领域，具体涉及一种柠檬酸杆菌及其在处理硫酸盐还原中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法。

背景技术

矿产资源的开发往往伴随着尾矿的生产，在自然风化及雨水冲刷下，暴露的尾矿会溶解出大量的重金属和硫酸盐进入水体，从而形成酸性矿山废水(Acid mine drainage,AMD)。AMD具有pH值低，硫酸盐含量高等特点，其中往往还含有大量的重(类)金属离子及其氰化物，如镉、砷、锌、镍、铅、铁等以及其氰化物。AMD的排放会污染矿区周边环境的地表水、地下水和土壤，严重威胁人类的健康和周围的生态环境。硫酸盐还原菌(Sulfate-reducingbacteria,SRB)广泛存在于自然界中，如AMD、海洋、土壤、河流沉积物等缺氧环境中，通过耦合氧化有机物能够将硫酸盐还原为硫化物，其种类及形态结构多样，代谢方式较为丰富，在生态系统的硫循环和碳循环中起着极其重要的作用。在SRB的作用下，AMD中的SO₄ ^2-被还原成为S^2-，能够提高环境pH值，同时能够沉淀水体中的重金属(如Cd²⁺、Zn²⁺)；除还原硫酸盐以外，SRB还可利用Cr(VI)、U(VI)、Mn(IV)、Fe(III)等作为电子受体，利用SRB治理重金属污染废水已有报道。另外，S^2-也可将高价金属离子还原，例如Fe³⁺、CrO₄ ^2-等。因此可见，SRB在AMD环境中对元素(如Fe、S)迁移转化以及AMD的生物治理发挥着重要的作用。

过去人们常常认为传统SRB的生存条件是严格厌氧环境，氧气的存在会对SRB细胞产生毒害作用，近年来，属于肠杆菌科的柠檬酸杆菌属(Citrobacter)多次被发现具有硫酸盐还原能力。相比于传统SRB的厌氧环境需求，这类细菌可以在有氧条件下快速生长，在厌氧条件下快速还原硫酸盐，在含有硫酸盐的废水处理中具有巨大的潜能。传统筛选具有硫酸盐还原能力的菌株的方法主要是通过选择性培养基进行富集，再经过固体—液体培养基交替筛选分离纯化菌株，该方法对于筛选微生物较为实用，但其筛选过程也较为繁琐、周期长。因此，改进筛选微生物的方法对于指导微生物的选育、分离、纯化尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种柠檬酸杆菌及其在处理含硫酸盐废水处理中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法。

本发明旨在提供一种从矿区底泥筛选柠檬酸杆菌的方法。

本发明另一目的在于研究具有硫酸盐还原能力的柠檬酸杆菌对碳源的利用能力及对pH的适应能力。

本发明采用透析袋富集和固体—液体培养基交替筛选的方法获一株具有硫酸盐还原能力的柠檬酸杆菌。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明筛选获得的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.EBS8，于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌株保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:61090。其分类学特征为：(1)革兰氏阴性兼性厌氧菌，分类上属于Enterobacteriaceae柠檬酸杆菌属(Citrobacter)；(2)细胞形状为短棒状、长1-3μm、宽0.5-1μm(如图1a和图1b所示)。

本发明提供的柠檬酸杆菌，其16s rRNA序列如SEQ ID N0:1所示，记录在美国国家生物技术信息中心，归档登录号为MN 420979。即16s rRNA序列NCBI登录号：MN 420979。该16s rRNA序列是通过美吉生物公司测序鉴定得到的。

本发明提供的柠檬酸杆菌能应用在处理含硫酸盐的废水中。

本发明提供的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，包括如下步骤：

(1)将广东省大宝山矿区横石河流域的沉积物，在厌氧条件下采用Postgate B型培养基进行硫酸盐还原菌的富集培养，若培养基的颜色变为黑色，则富集培养成功，得到硫酸盐还原菌群落；若培养基的颜色没有变为黑色，则富集培养失败，重新将广东省大宝山矿区横石河流域的沉积物进行富集培养处理；

(2)将施氏矿物包裹在透析袋中，封口，浸泡在液体培养基中；然后将步骤(1)所述硫酸盐还原菌群落接种至液体培养基中，施氏矿物与硫酸盐还原菌群落形成物理隔绝，进行共培养处理，收集菌种，得到单一优势群落；

(3)将步骤(2)所述单一优势群落重悬为菌悬液(OD₆₀₀为0.3-0.4)，然后采用平板划线的方式接种至固体Postgate B型培养基上，分别于厌氧条件和有氧条件下进行培养，若厌氧条件下菌种颜色呈黑色且有氧条件下菌种颜色呈白色，则步骤(2)所述单一优势群落具有硫酸盐还原能力；

(4)挑取步骤(3)中在厌氧条件下呈黑色的菌种，分别接种至液体培养基中，在避光条件下进行厌氧培养；然后选取颜色变为黑色的培养液采用平板划线的方式接种至固体Postgate B型培养基上，得到柠檬酸杆菌单一菌株。

进一步地，步骤(1)所述Postgate B型培养基的配方为：0.5±0.05g/L KH₂PO₄、1.0±0.05g/L NH₄Cl、1.0±0.05g/LNa₂SO₄、0.5±0.05g/L MgSO₄、1.0±0.05g/L酵母提取物、0.1±0.02g/L CaCl₂·6H₂O、0.5±0.05g/L FeSO₄·7H₂O和2.1±0.5g/L乳酸钠。

若使用质量分数为60％的乳酸钠溶液进行配制Postgate B型培养基，则PostgateB型培养基含有3.5±0.5g/L乳酸钠(质量分数为60％)。

进一步地，步骤(1)所述Postgate B型培养基为液体培养基，Postgate B型培养基的pH值为5.6。

进一步地，步骤(1)所述富集培养的温度为25℃，富集培养的时间为7d。

进一步地，步骤(2)所述透析袋的截留分子量为8-14kDa；所述液体培养基为Postgate B型培养基；所述共培养处理的温度为30℃，共培养处理的时间为20天。

优选地，步骤(2)所述透析袋可以采用美国的Viskase公司生产的透析袋，其可透过分子量：8000—14000Da，直径40mm。

进一步地，步骤(3)所述菌悬液的浓度OD₆₀₀为0.3-0.4；步骤(3)中所述培养基为固体Postgate B型培养基；所述固体Postgate B型培养基为在步骤(1)所述Postgate B型培养基加入1.5-2.0％琼脂配制得到的；厌氧条件和有氧条件下培养的温度均为30℃，厌氧条件和有氧条件下培养的时间均为3-4d。

若无特殊说明，Postgate B型培养基中均含有FeSO₄·7H₂O作为指示剂，在该指示剂下，柠檬酸杆菌表现为黑色。

进一步地，步骤(4)所述液体培养基为Postgate B型培养基(成分与步骤(1)所述Postgate B型培养基相同，但不含FeSO₄·7H₂O)；所述厌氧培养的温度为30℃；所述厌氧培养的时间为5-7d。

本发明提供的柠檬酸杆菌可采用场发射扫描电镜(SEM)观察菌株形貌。SEM表征处理具体方法为：将菌液经8000rpm、4℃离心后，依次为30％、50％、70％、85％、95％的乙醇各一次(梯度浓度乙醇采用磷酸盐缓冲液进行配置)，100％乙醇脱水2次，最后采用乙酸异戊酯洗涤2次。每个步骤均需要充分震荡，并保持20min以上，最后在8000×g下离心5min，弃去上清液，进行下一步处理。处理后的菌体经冷冻干燥后，取少量菌体置于铺好导电胶的样品盘上，进行120s的喷金处理，用场发射扫描电镜观察。

本发明提供的柠檬酸杆菌可采用如下方法进行硫酸盐还原的能力的评定。

将上述分离的柠檬酸杆菌接种至Postgate B型培养基(无FeSO₄·7H₂O)中，探究菌株在不同碳源下的利用能力及其对硫酸盐还原的能力。碳源分别设置乳酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠和乙酸钠作为反应体系中唯一碳源，乳酸钠添加量为30mmol/L，将其他种类碳源按照COD浓度进行归一化处理，即控制碳源浓度统一为2.88g COD/L。培养基中其余物质不变，调节初始pH均为5.6。同时去除抗坏血酸及酵母提取物，避免其中所含有机物质的干扰。

将上述分离的柠檬酸杆菌接种至Postgate B型培养基(无FeSO₄·7H₂O)中，探究菌株在不同pH的适应能力及其对硫酸盐还原的能力。采用乳酸钠作为唯一碳源，分别调节初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

不含有FeSO₄·7H₂O的Postgate B型培养基培养柠檬酸杆菌时，采用紫外分光光度计测定柠檬酸杆菌的OD₆₀₀反应菌株的生长状况。

采用离子色谱仪测定反应体系中SO₄ ^2-的还原利用情况。流动相采用碳酸盐缓冲溶液(3.5mmol/L Na₂CO₃/1.5mmol/L NaHCO₃)，流动相流速设置为1.2mL/min，样品进样量定为50μL。每次取0.5mL样品加超纯水稀释至5mL，并通过0.22μm滤膜去除颗粒物。

本发明发现了在广东省大宝山矿区横石河流域的多个不同pH采样点沉积物中均有Citrobacter的存在，且在pH小于3.0的AMD源头区域，Citrobacter sp.在属分类水平上的仍然有较高的相对丰度。Citrobacter对硫酸盐的还原能力使其在含SO₄ ^2-及多种重金属离子的废水处理工艺中具有良好的发展前景，因此，有必要筛选出单个菌株并对筛选菌株进行驯化，了解筛选菌株的环境适应能力及其硫酸盐还原性能，以便在含有硫酸盐的废水处理中发挥其巨大的潜能。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供了一种从矿区底泥筛选柠檬酸杆菌的方法，与传统筛选微生物的方法相比，该方法筛选过程相对简单、周期短、成本低。

(2)本发明筛选得到的柠檬酸杆菌为兼性厌氧菌，相比严格厌氧的SRB，具有在好氧条件下生长迅速，厌氧条件下有硫酸盐还原能力的特性，易于培养，在AMD修复治理中有着广泛的应用。

附图说明

图1a和图1b分别为实例3菌株在不同放大倍数下的SEM图像；

图2为实例4中菌株的部分16s rRNA序列(1444bp)和基于16s rRNA基因序列的系统发育树；

图3a和图3b分别为实例5中所得的在不同碳源条件下，细菌生长的OD₆₀₀和SO₄ ^2-浓度变化结果图；

图4a和图4b分别为实例6中所得到的在不同初始pH下，细菌生长的OD₆₀₀和SO₄ ^2-浓度变化结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

以下实施例使用的Postgate B型培养基的配方为：0.5±0.05g/L KH₂PO₄、1.0±0.05g/L NH₄Cl、1.0±0.05g/LNa₂SO₄、0.5±0.05g/L MgSO₄、1.0±0.05g/L酵母提取物、0.1±0.02g/L CaCl₂·6H₂O、0.5±0.05g/L FeSO₄·7H₂O和2.1±0.5g/L乳酸钠。所述固体Postgate B型培养基为在液体Postgate B型培养基加入1.5-2.0％琼脂配制得到的。

实施例1

将采集自广东省大宝山矿区横石河流域的沉积物样品，在厌氧条件下采用Postgate B型培养基进行硫酸盐还原菌的富集培养。为了模拟酸性矿山废水的酸性环境，调整磷酸根配比使其培养基pH值为5.6。用勺子挖取0.1～0.5克沉积物样品在超净台中转移到25mL厌氧管，并加入20mL除氧后经高压灭菌的Postgate B型培养基，橡胶塞压实密封后再铝封，保证与外部空气隔绝。整个操作过程中在厌氧操作箱中进行。接种完毕后转移到温度25℃恒温培养箱中进行培养7d。培养过程中通过观察其颜色是否变黑来判断是否富集成功，重复转接5次后，得到一个稳定的硫酸盐还原菌群落，保藏在4℃冰箱备用。

通过透析袋(Viskase，美国；可透过分子量：8000—14000Da，直径40mm)物理隔绝的方式，将矿物(如施氏矿物)包裹在透析袋中用尼龙绳封口，与上述富集的硫酸盐还原菌群落隔开培养。同时，设置无透析袋隔离的实验组，即微生物与矿物直接接触。通过16srRNA高通量测序发现无透析袋隔离组中微生物与施氏矿物共培养20天后，Desulfovibrio取代Citrobacter成为群落中的优势菌，而透析袋隔离组中则主要由Enterobacteriaceae科中的未知属构成一个单一优势群落(相对丰度超过90％)。收集透析袋隔离组的菌群，保藏在4℃冰箱备用。

实施例2

将透析袋隔离组中收集的菌群稀释至10^-3、10^-4、10^-5的菌悬液，在厌氧操作箱中取各稀释度菌悬液分别涂布至固体Postgate B型培养基上，一部分平板倒置于厌氧罐中，另一部分置于有氧培养箱中，厌氧条件和有氧条件下培养的温度均为30℃，厌氧条件和有氧条件下培养的时间均为3d，至菌落长出。挑取单菌落，接种于液体培养基上，于30℃、150rpm的摇床中厌氧培养5-7d，选取变黑色的厌氧管，再将厌氧管中菌液继续采用平板划线。经过3次固-液培养基交替筛选后，厌氧条件下在含有Fe²⁺和SO₄ ^2-的固体培养基上，目标菌株在一周后产生黑色菌落；好氧培养条件下菌落呈白色，出现此情况的原因有如下可能。

1)此菌株在好氧条件下不还原硫酸盐；2)好氧条件下生物还原产生的硫化物快速被氧气氧化。

进一步将平板上的菌落转接至液体培养基厌氧培养。与空白对照组(不加菌)相比，来自好氧平板的菌株消耗培养基中的营养物质，使培养基变得无色，未表现出硫酸盐还原能力；厌氧平板生长的菌落在液体培养基培养中可产生大量黑色硫化物，表明该菌落在厌氧条件下能还原硫酸盐，生成的硫化物(S^2-)与Fe²⁺反应形成FeS黑色沉淀物。

实施例3

取生长至对数期的菌液(OD₆₀₀为0.3左右)，在4℃、8000×g条件下离心5min，倒掉上清液。加入5mL 2.5wt％戊二醇溶液充分震荡后，置于4℃冰箱中2-4h。用10mmol/L磷酸盐缓冲液清洗3次后，采用乙醇梯度脱水，依次为30％、50％、70％、85％、95％的乙醇各1次(梯度浓度乙醇采用磷酸盐缓冲液进行配置)，100％乙醇脱水2次，最后采用乙酸异戊酯洗涤2次。每个步骤均需要充分震荡，并保持20min以上，最后在8000×g下离心5min，弃去上清液，进行下一步处理。处理后的菌体经冷冻干燥后，取少量菌体置于铺好导电胶的样品盘上，进行120s的喷金处理，用场发射扫描电镜观察。

本实例结果如图1a和图1b所示，用SEM观察到所分离的菌株细胞形状为短棒状、长1-3μm、宽0.5-1μm，缺少可支持细胞移动的鞭毛。

实施例4

将培养至对数期的菌液(OD₆₀₀为0.3左右)低温保存并转交至美吉生物测序公司，用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)的方式扩增菌株16s rRNA基因，利用27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)作为扩增引物，采用ABI 3730XL测序仪测序^[68]。所得16s rRNA基因序列在NCBI中采用BLASTN与已有菌株的基因序列进行同源性比对分析，而后选出相似度较高的菌株序列，用MEGA 7.0软件分析并通过邻结法(Neighbor-joining)建立系统发育树。

本实例中将此菌株的16s rRNA基因序列(如SEQ ID N0:1所示)上传到NCBI系统中，经与NCBI数据库中序列比对后，初步鉴定为柠檬酸杆菌属细菌(Citrobacter sp.)，并命名为Citrobacter sp.EBS8，NCBI登录号为MN 420979。用BLAST程序与已知菌株的基因序列进行同源性分析比对后，建立系统发育树(图2)。系统发育树中各分支上的数值是采用重抽样法(Bootstrap)重复检测500次后所得到的误差百分数。根据系统发育树分析得知，菌株EBS8与Citrobacter freundii strain Sr10(登录号：KX 279356)有97.84％的相似度。

实施例5

分别设置乳酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠和乙酸钠作为体系中唯一碳源，乳酸钠添加量为30mmol/L，将其他种类碳源按照COD浓度进行归一化处理，即控制碳源浓度统一为2.88g COD/L。以不加碳源作为对照组。其余物质与基础培养基一致，调节初始pH均为5.6。同时去除抗坏血酸及酵母提取物，避免其中所含有机物质的干扰。

将配置好的培养基分装在120mL厌氧瓶中，每瓶分装79mL，采用通高纯氮气(30min)的方式除去培养基中的溶解氧，用橡胶塞将瓶口塞住，并用铝盖压紧。置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌30min，冷却至室温，接种1mL菌液。最后将厌氧瓶转移至30℃、150rpm的摇床中培养。定时取样，用紫外分光光度计测定OD₆₀₀，并比较不同碳源条件下菌株的生长情况及体系中SO₄ ^2-含量。每个处理设置三个平行。

实施例结果如图3a和图3b所示，可知菌株EBS8可以利用乳酸、丙酮酸、柠檬酸作为碳源生长，但无法利用乙酸作为电子供体。仅当乳酸作为电子供体时EBS8表现出强SO₄ ^2-还原能力(还原率100％)，尽管丙酮酸和柠檬酸可以支持其生长，但丙酮酸作为碳源时仅还原了少量的SO₄ ^2-(还原率12.6％)。

实施例6

采用乳酸钠作为唯一碳源，分别调节初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。以不加菌作为对照组。其余实验步骤与实施例5相同。

图4a和图4b反映了不同初始pH条件下的菌株生长及SO₄ ^2-还原情况。结果显示，在初始pH为6.0、7.0和8.0时，EBS8在4～6天时生长达到对数期，此时硫酸盐还原速率最快，10天内体系中SO₄ ^2-已完全被还原。但是在初始pH为4.0、5.0、9.0的实验组中，EBS8几乎没有生长，也没有SO₄ ^2-被还原，表明该菌株在偏酸性或碱性环境中生长受到抑制。

本发明提供了一种从矿区底泥筛选柠檬酸杆菌的方法，与传统筛选微生物的方法相比，该方法筛选过程相对简单、周期短、成本低。本发明筛选得到的柠檬酸杆菌为兼性厌氧菌，好氧生长迅速，厌氧还原硫酸盐，易于培养，在处理含SO₄ ^2-的废水(如酸性矿山废水)具有广泛应用。

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种柠檬酸杆菌及其在处理含硫酸盐废水处理中的应用与柠檬酸杆菌的分离鉴定方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA/RNA

<213> 柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)

<400> 1

acatggcgca ggctacacat gcagtcgaac ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac 60

gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga aactgcccga tggaggggga taactactgg 120

aaacggtagc taataccgca taatgtcgca agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt 180

gccatcggat gtgcccagat gggattagct agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga 240

cgatccctag ctggtctgag aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac 300

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ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt aaagtacttt cagcgaggag gaaggcatta 420

aggttaataa ccttagtgat tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca 540

cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatccg 600

aaactggcag gctagagtct tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagagatct ggaggaatac cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca 720

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc 960

agagaactta gcagagatgc tttggtgcct tcgggaactc tgagacaggt gctgcatggc 1020

tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc 1080

ctttgttgcc agcgatccgg ccgggaactc aaaggagact gccagtgata aactggagga 1140

aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacgagta gggctacaca cgtgctacaa 1200

tggcatatac aaagagaagc gacctcgcga gagcaagcgg acctcataaa gtatgtcgta 1260

gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc 1320

agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380

tgggtgcaaa agaagtaggt agcttaacct tcgggagggc gcttaccact tggtatccaa 1440

ctgg 1444

Claims

1.一种柠檬酸杆菌，其特征在于，编号为Citrobacter sp.EBS8，2020年7月13日保藏于广东省微生物菌株保藏中心，地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:61090。

2.根据权利要求1所述的柠檬酸杆菌，其特征在于，其16s rRNA序列如SEQ ID N0:1所示，记录在美国国家生物技术信息中心，归档登录号为MN420979。

3.权利要求1-2任一项所述的柠檬酸杆菌在处理含硫酸盐的废水中的应用。

4.一种柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(3)将步骤(2)所述单一优势群落重悬为菌悬液，然后采用平板划线的方式接种至固体Postgate B型培养基上，分别于厌氧条件和有氧条件下进行培养，若厌氧条件下菌种颜色呈黑色且有氧条件下菌种颜色呈白色，则步骤(2)所述单一优势群落具有硫酸盐还原能力；

5.根据权利要求4所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述Postgate B型培养基的配方为：0.5±0.05g/L KH₂PO₄、1.0±0.05g/L NH₄Cl、1.0±0.05g/LNa₂SO₄、0.5±0.05g/L MgSO₄、1.0±0.05g/L酵母提取物、0.1±0.02g/L CaCl₂·6H₂O、0.5±0.05g/L FeSO₄·7H₂O和2.1±0.5g/L乳酸钠。

6.根据权利要求4所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述Postgate B型培养基为液体培养基，Postgate B型培养基的pH值为5.6。

7.根据权利要求4所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(1)所述富集培养的温度为25℃，富集培养的时间为7d。

8.根据权利要求4所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述透析袋的截留分子量为8-14kDa；所述液体培养基为Postgate B型培养基；所述共培养处理的温度为30℃，共培养处理的时间为20天。

9.根据权利要求4所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述菌悬液的浓度OD₆₀₀为0.3-0.4；步骤(3)中所述培养基为固体Postgate B型培养基；所述固体Postgate B型培养基为在步骤(1)所述Postgate B型培养基加入1.5-2.0％琼脂配制得到的；厌氧条件和有氧条件下培养的温度均为30℃，厌氧条件和有氧条件下培养的时间均为3-4d。

10.根据权利要求4-8任一项所述的柠檬酸杆菌的分离鉴定方法，其特征在于，步骤(4)所述液体培养基为不含FeSO₄·7H₂O的Postgate B型培养基，所述液体培养基除了FeSO₄·7H₂O以外，其余成分均与步骤(1)所述Postgate B型培养基相同；所述厌氧培养的温度为30℃；所述厌氧培养的时间为5-7d。