CN115960751A - 一株海迪茨氏菌yb079及其在生物脱氮上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株海迪茨氏菌YB079,该菌株分离于含氮废水的脱氮系统的活性污泥,具有较好的生物脱氮能力。菌株YB079在好氧条件下,氨氮去除能力最强;在厌氧,好氧,静置培养条件下,均能有效的去除硝态氮和亚硝态氮。能够在120h内使初始浓度为600 mg/L氨氮的去除率达57.99%;初始浓度为600Lmg/L亚硝氮全部去除;初始浓度为325mg/L的硝态氮去除率为78.28%。能在114小时内将氮污染污泥中初始浓度为110mg/L氨氮,65mg/L硝态氮,170mg/L亚硝氮去除率达81.24%,92.77%,91.78%。能在114小时内将氮污染餐厨滤液中初始浓度为270mg/L氨氮,190mg/L硝态氮,390mg/L亚硝氮去除率达100%,98.51%,100%。
Description
技术领域
本发明涉及一株菌株海迪茨氏菌YB079(
Dietzia maris YB079)及其在含氮污水生物脱氮处理中的应用,属于环境微生物技术领域。
背景技术
随着社会的飞速发展,工业,农业,生活中的含氮废水的排放量逐渐增多,导致了人为输送了过多营养元素,从而产生一系列不良的影响,使生态系统多样性遭到了破坏,如水体中含氮量过高会造成水体富营养化饮用含氮量较高的水还容易致突变、致癌和致畸,如今,含氮废水的来源变得更加广泛,排放量也变得越来越多,对生态环境产生了很大的影响,对生态系统构成了严重的威胁。水体中的氮素主要以氨态氮(NH4 +-N)、硝态氮(NO3 --N)、亚硝态氮(NO2 --N)、有机氮四种不同的形态存在。自然界中各种形式的氮素能够在微生物的影响下完成相互转化,因此,微生物脱氮修复水环境已经成为目前研究的热点领域。
在脱氮技术的开发利用中,目前含氮废水应用较多的脱氮技术主要可以分为为物理化学法和生物法。物理化学法虽然脱氮效率高,但是运行成本也高并且化学反应后的产物可能会造成二次污染,因此生物脱氮技术将具有更大的应用前景。不断获取高效的生物脱氮菌株以及开发配套的脱氮工艺,成为进一步提高废水生物脱氮效率的关键因素。特别是针对氨氮废水中,寻找一种能够同时具有氨氧化和反硝化能力的菌株,对提高废水氨氮的去除效率具有重要的贡献。
发明内容
本发明提供一株可用于污水生物脱氮的海迪茨氏菌YB079 (
Dietzia marisYB079),及其在含氮废水生物脱氮中的应用。
一株海迪茨氏菌YB079,已于2022年8月保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国. 武汉. 武汉大学,保藏编号为:CCTCC M 20221251。分类命名为
Dietzia marisYB079,保藏日期:2022年8月8日。
所述YB079菌株的16S rDNA测序结果见SEQ ID NO.1所示。
所述菌株YB079的培养方法为:
(1)保藏菌株活化。该菌株可培养于LB培养基中。-80℃保藏的YB079菌株,利用无菌竹签,挑取少量菌株冰渣,置于含LB固体培养基的培养平皿上,利用无菌竹签划线。将划线接种好的培养平皿倒置于28℃生化培养箱中,培养27-36h即可长出YB079菌落,其形态为:菌落偏橙红色,圆形不透明,光滑,边缘整齐。
(2)菌株扩大培养。菌株扩大培养于DM培养基中。培养基成分为(1L体积):KNO31g(或NH4Cl 1.2g,或NaNO2 1.5g);琥珀酸钠 16.88g;Na2HPO4·12H2O 10.55g;KH2PO4 1.5g;MgSO4·7H2O 0.1g;微量元素2.0 mL;pH 7.2-7.5,蒸馏水定容1L。微量元素(1L体积):Na2EDTA 50g,CaCl2 5.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4 5g,ZnSO4·7H2O 2.2g,CuSO4·5H2O1.57g,CoCl2·6H2O 1.6g,蒸馏水1L。培养温度为28℃,可在好氧条件,静置条件,厌氧条件培养。
所述的菌株在含氮污水中生物脱氮上的应用。
作为一个事实方案,所述的菌株在餐厨垃圾渗滤液、或污染池塘底泥中进行生物脱氮上的应用。
所述的菌株在去除含氮废水中的氨态氮、硝态氮、亚硝态氮中的一种或多种上的应用。
所述的菌株在氧化氨态氮、还原硝态氮、还原亚硝态氮中的一种或多种来实现含氮废水中的应用。
所述含氮废水去除过程中在好氧或空气静置环境中进行;或者在厌氧环境下去除硝态氮、亚硝态氮中的一种或两种。
所述的好氧条件为恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,用于菌株YB079氧化氨。
所述静置条件为置于空气中静置培养,用于菌株YB079还原硝酸盐或亚硝酸盐。
所述厌氧条件为:接种的菌液,置于厌氧培养罐中,除氧后密封培养,用于菌株YB079还原硝酸盐或亚硝酸盐。
惊奇的发现,所述菌株YB079在好氧条件下,氨氮去除能力最强;在厌氧条件下,菌株不能去除氨氮;在静置培养状态下,具有除去氨氮能力。
事实上,所述菌株YB079在厌氧,好氧,静置培养条件下,均能有效的去除亚硝态氮。
难以置信的是所述菌株YB079在厌氧,好氧,静置条件下,均能有效的去除硝态氮。
本发明还提供一种生物脱氮药剂,该药剂包含所述的细菌菌株海迪茨氏菌YB079,分类命名
Dietzia maris YB079,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号CCTCC NO:M 20221251,保藏日期:2022年8月8日。
所述的生物脱氮药剂在含氮污水中生物脱氮上的应用,所述的含氮污水包括餐厨垃圾渗滤液、或污染池塘底泥。
所述的菌株在去除含氮废水中的氨态氮、硝态氮、亚硝态氮中的一种或多种上的应用,所述含氮废水去除过程中在好氧或空气静置环境中进行;或者在厌氧环境下去除硝态氮、亚硝态氮中的一种或两种。
所述的好氧条件为恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,用于菌株YB079氧化氨。
所述静置条件为置于空气中静置培养,用于菌株YB079还原硝酸盐或亚硝酸盐。
所述厌氧条件为:接种的菌液,置于厌氧培养罐中,除氧后密封培养,用于菌株YB079还原硝酸盐或亚硝酸盐。
所述的菌株YB079在水样生物脱氮上的应用。
同样的,所述菌株YB079在好氧条件下,氨氮去除能力最强;在厌氧条件下,菌株不能去除氨氮;在静置培养状态下,具有除去氨氮能力。
与此同时,所述菌株YB079在厌氧,好氧,静置培养条件下,均能有效的去除亚硝态氮。
难以置信的是,所述菌株YB079在厌氧,好氧,静置条件下,均能有效的去除硝态氮。
所述的菌株YB079在餐厨垃圾渗滤液中生物脱氮的应用。
将所述菌株YB079直接接种于氮污染的餐厨垃圾渗滤液中进行生物脱氮,接种量为0.4-0.6 OD/25mL垃圾渗滤液。渗滤液初始氨氮的浓度为270mg/L时,在114小时内将氨氮全部去除。初始硝态氮的浓度为190mg/L时,在114小时内的去除率为98.51%。初始亚硝氮的浓度为390mg/L时,在114小时内将亚硝氮全部去除。菌株的OD值在114小时也可从0.832增长至5.78。
所述的菌株YB079在污染池塘底泥中生物脱氮的应用。将所述菌株YB079直接接种于氮污染的池塘底泥中进行生物脱氮,接种量为0.4-0.6 OD/25g 污染池塘底泥。底泥中初始氨氮的浓度为110mg/L时,在114小时内氨氮的去除率为81.24%。初始硝态氮的浓度为65mg/L时,在114小时内硝态氮的去除率为92.77%。初始亚硝氮的浓度为170mg/L时,在114小时内亚硝氮的去除率为91.78%。
附图说明
图1 YB079的菌株形态图。
图2 YB079的扫描电镜图。
图3 YB079菌株基于16S rDNA的系统发育树。
图4 YB079在不同氧气条件下生长情况。
图5 YB079在不同氧气条件下的氨氮降解能力(A)和菌株生长情况(B)。
图6 YB079在不同氧气条件下的亚硝氮降解能力(A)和菌株生长情况(B)。
图7 YB079在不同氧气条件下的硝氮降解能力(A)和菌株生长情况(B)。
图8 YB079在不同氨氮浓度下的氨氮降解能力。
图9 YB079在不同亚硝态氮浓度下的亚硝态氮降解能力。
图10 YB079在不同硝态氮浓度下的硝态氮降解能力。
图11 YB079在餐厨垃圾渗滤液中氮降解情况(A)和菌株生长情况(B)。
图12 YB079在池塘污泥中氮降解情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述,但是本领域的技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
菌株YB079的分离和鉴定
取本实验室(三峡大学生物工程学科实验室)含氮废水的脱氮处理活性污泥500ml,加入富集培养基3.5L(富集培养基配方为: NH4Cl 1.2g,NaNO2 1.5g,NaHCO3 0.5g,KHCO3 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,CaCl2·2H2O 0.136g,KH2PO4 0.027g,微量元素1 1mL,微量元素2 1.25mL,自来水1L。微量元素1:EDTA 1.25g,FeSO4 1.25g,蒸馏水250mL。微量元素2:EDTA 1.25g,ZnSO4·7H2O 0.1075g,CoCl2·6H2O 0.06g,MnCl2·4H2O 0.2475g,CuSO4·5H2O 0.0625g,NaMoO4·2H2O 0.055g,NiCl2·6H2O 0.0475g,H3BO3 0.0035g,蒸馏水250mL。),所有上述物质均置于全自动发酵控制系统的5L培养罐中富集培养,设置温度为28℃,转速为50rpm,pH维持在7.0-8.0之间,每当pH值低于7.0后用NaOH溶液调节pH到7.0以上。每2天取出1L发酵液,同时注入新鲜富集培养液1L。同时检测出料液,以及补料后培养液中氨氮、硝氮、亚硝氮的浓度,获取富集培养物对氨氮、硝氮、亚硝氮的去除效率。当富集培养物对氨氮、硝氮、亚硝氮的去除效率稳定后,将富集培养物取出,用无菌水分别将富集培养物稀释至10-2,10-3,10-4三个梯度,分别取200μL悬液涂布在灭菌的硝化细菌固体培养基中(硝化培养基配方为: NH4Cl 0.5 g;C4H4Na2O4 3.0 g;MgSO4·7H2O 3.0 g;K2HPO4 4.8 g;NaCl 2.0 g;MnSO4·4H2O 0.05g;FeSO4 0.05g;琼脂 20g;蒸馏水1L),于28℃培养箱中进行培养,挑取不同形态的菌株13株作为候选菌,至硝化细菌固体培养基平板上划线纯化培养,每个菌株分离纯化培养3-5次,获得各菌株的纯培养。
菌种保藏:菌种保藏使用甘油管法,每个纯菌株保存两份。将纯化好的菌株接种于LB液体培养基中,于28℃恒温培养箱培养至菌液OD600大于1.0,作为待保藏菌液;将浓度为60%的甘油和1.5ml Eppendorf 管事先灭菌,然后将甘油和上述菌液1:2加入管中,混匀,封好管口,做好标记,放于冰格中保存在-80℃冰箱。其中LB培养基配方为:胰蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,NaCl 10.0g, pH 7.2-7.5,蒸馏水1L。
把上述筛选出的菌株分别放到分别以氯化铵,硝酸钾,亚硝酸钠为氮源的DM培养基中培养,以氨氮,硝态氮,亚硝氮的去除率作为指标进行筛选,选取氨氮,硝态氮,亚硝氮去除率均较高的菌株作为本发明的菌株。其中氨氮DM培养基配方为: NH4Cl 1.2g;琥珀酸钠 16.88g;Na2HPO4·12H2O 10.55g;KH2PO4 1.5g;MgSO4·7H2O 0.1g;微量元素2.0 mL;pH7.2-7.5,蒸馏水1L。微量元素:Na2EDTA 50g,CaCl2 5.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4 5g,ZnSO4·7H2O 2.2g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.6g,蒸馏水1L。硝态氮DM培养基配方为: KNO3 1 g;琥珀酸钠 16.88g;Na2HPO4·12H2O 10.55g;KH2PO4 1.5g;MgSO4·7H2O0.1g;微量元素2.0 mL;pH 7.2-7.5,蒸馏水1L。微量元素:Na2EDTA 50g,CaCl2 5.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4 5g,ZnSO4·7H2O 2.2g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.6g,蒸馏水1L。亚硝氮DM培养基配方为: NaNO2 1.5g;琥珀酸钠 16.88g;Na2HPO4·12H2O10.55g;KH2PO4 1.5g;MgSO4·7H2O 0.1g;微量元素2.0 mL;pH 7.2-7.5,蒸馏水1L。微量元素:Na2EDTA 50g,CaCl2 5.5g,MnCl2·4H2O 5.06g,FeSO4 5g,ZnSO4·7H2O 2.2g,CuSO4·5H2O 1.57g,CoCl2·6H2O 1.6g,蒸馏水1L。最终获得YB079菌株。
所获菌株YB079的菌株形态结果见图1,菌落形态特征:菌落偏橙红色,为圆形不透明,光滑,边缘整齐。
使用扫描电子显微镜观察菌株YB079的形态,菌株呈短杆状或球状。结果如图2所示。
将YB079菌株培养2-3d,收集3OD菌体量,使用细菌DNA提取试剂盒提取DNA,利用细菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.2),1492R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.3)对其进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳(1%)验证;扩增的PCR产物由上海生工生物技术公司进行测序分析。获得菌株16S rDNA序列结果如该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
所获测序结果与GenBank数据库中已有的16S rDNA序列进行比对,获取相似序列,并利用MEGA X进行系统发育树分析,所构建系统树见图3。结果显示该菌株的16S rDNA序列与数据库中海迪茨氏菌
Dietzia maris的16S rDNA序列相似率为100%。鉴定该菌株为
Dietzia maris。
实施例2
YB079菌株的生长特性
YB079菌在LB培养基中的生长情况见图4。将YB079接种于新鲜LB培养液中,分别置于好氧,静置,厌氧三种条件下培养,观察菌株的生长情况,比较YB079在不同氧含量条件下生物量(OD600)。结果表明,该菌在摇动条件下的生物量略高于静置条件下的生物量,显著高于厌氧条件下的生物量。在摇床培养条件下,菌株的OD值在67小时可从0.279达1.211,在静置培养条件下,菌株的OD值在67小时从0.268达0.721,而在厌氧培养条件下,OD增长缓慢,菌株的OD值在67小时仅从0.279达0.309。可见YB079在不同氧含量的条件下均能生长,而充足的氧气更与利于YB079的生长。其中,好氧条件为恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,静置条件为生化培养箱进行静置培养,厌氧条件为将装有菌液的试管装入厌氧罐中进行抽氧密封后,置于生化培养箱进行静置培养,培养温度均为28 ℃。
实施例3
氧气对YB079去除氮能力的影响
将YB079接种于DM培养液中,分别以NH4Cl、NaNO2、KNO3为氮源,分别置于好氧、静置、厌氧三种条件下培养,分别检测菌株去除氨氮,硝态氮,亚硝态氮的能力以及菌株的生长情况(OD600)。其中,好氧条件为恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,静置条件为生化培养箱进行静置培养,厌氧条件为将装有菌液的试管装入厌氧罐中进行抽氧密封后,置于生化培养箱进行静置培养,培养温度均为28 ℃。
YB079在好氧条件下,氨氮去除能力最强,在120小时将 440mg/L的氨态氮去除57.21%。在厌氧条件下,菌株不能去除氨氮。而在静置状态下,YB079在120小时去除氨氮38.24%。菌株在好氧条件下生长较快,静置培养,菌株生长较好,而在厌氧条件下生长较慢,具体结果见图5。
YB079在厌氧,好氧,静置条件下,均能有效的去除亚硝态氮,在120小时将720mg/L的亚硝态氮的分别去除100%、100%、97.52%。菌株在亚硝态氮为氮源的条件下,可以在好氧和静置培养条件下良好生长,而在厌氧条件下生长不佳,结果见图6。
YB079在厌氧,好氧,静置条件下,均能有效的去除硝态氮,在120小时将140mg/L的硝态氮的分别去除96.77%、99.94%、100%。而菌株的生长情况均为在好氧条件下增长较快,静置条件下生长较好,在厌氧条件下增长缓慢。结果见图7。
实施例4
不同氮浓度对YB079菌去除氮的影响
将YB079菌接种于分别含有100、200、400、600mg/L的氨氮的DM培养液中,定时检测样品中的氨氮浓度。YB079去除氨氮的能力,结果见图8。当培养液中氨氮的浓度为100、200mg/L时,在72、96小时氨氮能全部去除。当培养液中氨氮的浓度为400 mg/L时,在120小时内氨氮浓度能降低至68mg/L,去除率为82%。当培养液中氨氮的浓度为600 mg/L时,在120小时内氨氮浓度能降低至243mg/L,去除率为57.99%。可见全部降解所需要的时间随着氨氮浓度的升高而延长。YB079菌具有较高的去除氨氮的能力。
将YB079菌接种于分别含有200、400、600、800mg/L的亚硝态氮的DM培养液中,定时检测样品中的亚硝态氮浓度。YB079去除亚硝态氮的能力,结果见图9。当培养液中亚硝态氮的浓度为200、400、600mg/L时,在72、96和120小时内亚硝态氮能全部去除。当培养液中亚硝态氮的浓度为800 mg/L时,在120小时内亚硝态氮浓度能降低至590mg/L,去除率为25.3%。可见全部降解所需要的时间随着亚硝态氮浓度的升高而延长。YB079菌具有较高的去除亚硝态氮的能力。
将YB079菌接种于分别含有75、165、245、325mg/L的硝态氮的DM培养液中,定时检测样品中的硝态氮浓度。YB079去除硝态氮的能力,结果见图10。当培养液中硝态氮的浓度为75、165、245mg/L时,均能在120小时内将硝态氮全部去除。当培养液中硝态氮的浓度为325mg/L时,在120小时内硝态氮浓度能降低至71mg/L,去除率为78.28%。可见全部降解所需要的时间随着硝态氮浓度的升高而延长。YB079菌具有较高的去除硝态氮的能力。
实施例5
YB079菌在餐厨垃圾渗滤液中的去除氮的能力
餐厨垃圾渗滤液的制备方法:将餐厨垃圾装入桶中,加入适量去离子水,放置3天。取滤液,装入烧杯中,加入适量去离子水稀释,放入冰箱,待滤液中的油结块之后,除去油层。将剩下滤液8000r/min离心5min,收集上清液,再采用0.45μm水性滤膜,抽滤两次,收集滤液,将制得的滤液加入氯化铵0.5g/L,硝酸钾1g/L,亚硝酸钠1g/L,调节pH到7.5。取25mL滤液到100mL锥形瓶中,共制6瓶,121℃高压蒸汽灭菌20min。其中3瓶各加入0.4-0.6 OD值的菌接种液,另外3瓶不接种作为对照。将6瓶放入到28℃恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,在0、114小时取样,测定餐厨垃圾渗滤液中的氨氮,硝态氮,亚硝氮含量,结果见图11。
结果显示了YB079在114小时内对氮污染餐厨滤液中氨氮,硝态氮,亚硝氮去除情况。添加了菌株YB079的实验组,水样中初始氨氮的浓度为270mg/L时,能够将餐厨滤液中的氨氮完全去除;初始硝态氮的浓度为190mg/L时,在114小时内硝态氮的去除率为98.51%;初始亚硝氮的浓度为390mg/L时,能在114小时内将亚硝氮全部去除;菌株的OD值在114小时也可从0.832达5.78。而未添加菌株YB079的空白组氨氮,硝态氮,亚硝氮含量以及菌浓度基本没有变化。
实施例6
YB079菌在污染池塘底泥中的去除氮的能力
污染污泥的制备方法:从池塘中,取泥下10cm左右新鲜污泥。初步过滤掉树叶,树枝等体积大的杂物,然后通过过滤网获得实验所需的污泥。将制备的污泥取25g到100mL锥形瓶中,加入含氯化铵0.5g/L,硝酸钾1g/L,亚硝酸钠1g/L的去离子水 25ml,充分混匀,共制6瓶,调节pH到7.5。121℃高压蒸汽灭菌20 min,灭两次。其中3瓶各加入0.4-0.6 OD值的菌接种液,另外3瓶不接种作为对照。将6瓶放入到28℃恒温摇床进行摇动(200r/min)培养,在0、114小时取样,测定污泥中的氨氮,硝态氮,亚硝氮含量,结果见图12。
结果显示了YB079在114小时内对氮污染污泥中氨氮,硝态氮,亚硝氮去除情况。污泥中能够提取到的氮浓度较低,大部分没有提取出来可能是因为污泥所具有的吸附性太强,导致大部分氮被吸附在淤泥中。经过114小时,添加了菌株YB079的实验组,水样中初始氨氮的浓度为110mg/L时,在114小时内氨氮的去除率为81.24%;初始硝态氮的浓度为65mg/L时,在114小时内硝态氮的去除率为92.77%;初始亚硝氮的浓度为170mg/L时,在114小时内亚硝氮的去除率为91.78%。而未添加菌株YB079的空白组氨氮,硝态氮,亚硝氮含量基本没有变化。
Claims (10)
1.一株细菌菌株海迪茨氏菌YB079,分类命名Dietzia maris YB079,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号CCTCC NO:M 20221251,保藏日期:2022年8月8日。
2.根据权利要求1所述的菌株,其特征在于:该菌株的16S rDNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的菌株在含氮污水中生物脱氮上的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的菌株在餐厨垃圾渗滤液、或污染池塘底泥中进行生物脱氮上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的菌株在去除含氮废水中的氨态氮、硝态氮、亚硝态氮中的一种或多种上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的菌株在氧化氨态氮、还原硝态氮、还原亚硝态氮中的一种或多种来实现含氮废水中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述含氮废水去除过程中在好氧或空气静置环境中去除氨态氮;或者在好氧或空气静置或厌氧环境下去除硝态氮、亚硝态氮中的一种或两种。
8.一种生物脱氮药剂,其特征在于,该药剂包含权利要求1或2所述的细菌菌株海迪茨氏菌YB079,分类命名Dietzia maris YB079,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国.武汉.武汉大学,保藏编号CCTCC NO:M 20221251。
9.根据权利要求8所述的生物脱氮药剂,其特征在于,所述的生物脱氮药剂在含氮污水中生物脱氮上的应用,所述的含氮污水包括餐厨垃圾渗滤液、或污染池塘底泥。
10.根据权利要求9所述的生物脱氮药剂,其特征在于,所述的菌株在去除含氮废水中的氨态氮、硝态氮、亚硝态氮中的一种或多种上的应用,所述含氮废水去除过程中在好氧或空气静置环境中进行;或者在厌氧环境下去除硝态氮、亚硝态氮中的一种或两种。
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