CN113106041B - 一株假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株假单胞菌及其应用，其命名为假单胞菌MeP(Pseudomonas sp.MeP)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021368。本发明还提供了所述假单胞菌在降解邻甲酚和/或2，4‑二叔丁基酚中的应用；该假单胞菌可以同时发酵降解邻甲酚和2，4‑二叔丁基酚，避免了传统的酚类污染物处理方法中成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题，对人类健康和公共环境不会造成任何危害，对实验条件要求较低。

Description

一株假单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学、生物化学和发酵工程技术领域，特别涉及一株假单胞菌及其应用。

背景技术

假单胞菌是一类普遍存在的好氧(一些假单胞菌亦可利用硝酸盐与其他氮氧化合物进行无氧呼吸)、直或微弯的革兰氏阴性杆菌，是一类具有代谢多样性、分布广泛种类多样的环境微生物，因其超强的适应力存在于不同的生境中。其中，研究得最多的是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，可以感染昆虫、线虫、植物、哺乳动物，其中也包含人类。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)可用来降解有毒垃圾(如芳香族与氯化化合物)。随着社会工业和经济水平的不断发展，焦化、印染、石化等行业生产过程中产生大量的含酚废水被肆意排放到环境中，使得经处理过后的废水依然无法达到规定的排放标准，因而各界的受到广泛关注。含酚废水的成分以苯酚和甲酚为主，邻/间/对甲酚常同时存在，是我国法规中规定的重点监控环境污染物之一。

目前所使用的去除废水中酚类污染物的方法，可以大致分为化学法、物理法、生物法。通过其中的一种或者几种方法组合，能够有效的去除酚类污染物。其中化学法和物理法以下几种工艺较为成熟：化学氧化法、化学沉淀法、光催化法、萃取法和吸附法，但以上几种方法均存在成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题，对人类健康和公共环境容易造成危害。生物法是近年来新兴的含酚废水处理方法，目前大多采用传统的活性污泥法处理废水中的酚类污染物，但该法仅针对水溶性较好，毒性不高的苯酚有一定的降解效果，对甲酚这一类溶解度低，毒性较大的物质的降解能力有限，且此方法对废水负荷波动及冲击的适应能力较差。为了强化现有技术方案，筛选出具有高降解效率以及耐受高毒性污染物质菌株的研究方兴未艾。据报道，在自然界中，能够降解苯酚等酚类物质的微生物主要有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和红球菌属(Rhodococcus)等。

但上述这些菌株普遍存在环境适应能力弱、对甲酚等高毒性酚类物质耐受差、降解效率低等问题。因此筛选能耐受高浓度范围以及邻甲酚等高毒性底物同时能降解2，4-二叔丁基酚的高效降解菌株或混合菌系，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明目的是提供一株假单胞菌及其应用，该株假单胞菌能同时降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚。

在本发明的第一方面，提供了一株假单胞菌，所述假单胞菌的保藏编号为：CCTCCNO：M 2021368。

在本发明的第二方面，提供了所述的假单胞菌在降解邻甲酚中的应用。

在本发明的第三方面，提供了所述的假单胞菌在降解2，4-二叔丁基酚中的应用。

在本发明的第四方面，提供了所述的假单胞菌在降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚中的应用。

在本发明的第五方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：

将所述的假单胞菌进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

在本发明的第六方面，提供了采用所述的假单胞菌降解邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚的方法，所述方法包括：

将所述的假单胞菌或者所述的发酵菌剂加入到以邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚为碳源的无机盐液体培养基中培养，以使所述的假单胞菌利用所述碳源进行生长。

进一步地，所述无机盐液体培养基的pH为7.0～9.0。

进一步地，所述培养的温度为30℃～35℃。

进一步地，所述邻甲酚在所述无机盐液体培养基中的终浓度为200mg/L～800mg/L。

进一步地，所述2，4-二叔丁基酚在所述无机盐液体培养基中的终浓度为200mg/L～800mg/L。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明提供的一株假单胞菌及其应用，该假单胞菌可以同时发酵降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚，避免了传统的酚类污染物处理方法中成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题，对人类健康和公共环境不会造成任何危害，对实验条件要求较低。该假单胞菌可永久保存，为今后的机理研究和更进一步的产业应用打下基础。

本发明的假单胞菌的保藏日期为2021年4月12日，保藏编号为CCTCC NO：M2021368。其分类命名为假单胞菌MeP(Pseudomonas sp.MeP)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是该假单胞菌(图中命名为MeP)的系统发育树；

图2是该假单胞菌的扫描电镜图；

图3是不同邻甲酚初始浓度条件下该假单胞菌对邻甲酚的降解效率；

图4是不同培养温度条件下该假单胞菌对邻甲酚的降解效率；

图5是不同培养基初始pH值条件下该假单胞菌对邻甲酚的降解效率；

图6是不同培养基初始pH值条件下该假单胞菌对2，4-二叔丁基酚的降解效率。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本申请发明人从采集于湖北黄石某焦化厂土壤中筛选到一株微生物，发现该菌株具有同时降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚的能力，该细菌经菌落形态、生化及16S rRNA测序分析，该菌株与假单胞菌属(Pseudomonas)多个的菌株同源性均在96％以上，结合生理生化特性，初步确定该菌株属假单胞菌属(Pseudomonas)，并命名为假单胞菌MeP菌株(Pseudomonas sp.MeP Strain)。

本发明的假单胞菌能利用邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚作为碳源进行生长繁殖；假单胞菌能耐受浓度高达800mg/L的邻甲酚，能耐受浓度高达800mg/L的2，4-二叔丁基酚；本发明实施例的假单胞菌对200mg/L的邻甲酚的降解率为100％；本发明实施例的假单胞菌在pH为7.0的条件下对300mg/L的邻甲酚的降解率为36.8％。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株假单胞菌及其应用进行详细说明。

实施例1菌株MeP的定向富集分离与鉴定

1、菌株MeP的定向富集分离

取湖北黄石某焦化厂土壤50g，置于100mL无机盐液体培养中振荡培养，富集其中的微生物。富集培养一周后，取适量上清液，梯度稀释涂布于以邻甲酚为单一碳源的无机盐固体培养基中，其中邻甲酚浓度为300mg/L。培养7d后，挑取平板上不同的菌落，于新的以邻甲酚为单一碳源的无机盐固体培养基上划线分离，以确认其降解能力。待长出菌落后再挑取单菌落于LB固体培养基上，平板划线分离纯化获得该菌株的纯培养物。

2、菌株MeP的鉴定

(1)菌株MeP的菌体及菌落形态特征

将-80℃冰箱中甘油保藏的菌株MeP菌液在冰上解冻，用接种环取一环菌液在LB琼脂平板上进行划线，将培养皿倒置于恒温培养箱中30℃培养24h左右，观察菌落形态。取LB琼脂平板上长出的单菌落，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态，结果为革兰氏阴性菌；扫描电镜图如图2所示。

(2)遗传学特征

取该假单胞菌，于LB液体培养基中扩大培养，取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组。将提取得到的基因组，用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR体系为：2x Taq Plus PCR Master Mix 25μL、ddH2O 19μL、通用引物27F 2μL、通用引物1492R 2μL、模板DNA2μL。取PCR扩增得到的产物10μL，于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳检测，确认有清晰明亮的条带后将剩余的PCR产物送测序公司测序，测序结果如SEQ ID NO:1所述。

将测序结果与Blast搜索程序从数据库(NCBI)中基因序列进行比对分析，并构建系统发育树(图1所示)。发现MeP菌株与模式菌株Pseudomonas stutzeri(ATCC 17588)同源性达到了96％。结合生理生化特性，确定菌株MeP为假单胞菌属，并命名为假单胞菌MeP菌株(Pseudomonas sp.MeP Strain)，并于2021年4月12日于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2021368。

实施例2邻甲酚的降解与降解率的测定

1、不同温度下的邻甲酚的降解及回收

培养该假单胞菌(Pseudomonas sp.)的培养基为以邻甲酚为单一碳源的MSM液体培养基。每升MSM液体培养基中含有成分：KH₂PO₄ 338.8mg，(NH₄)₂SO₄ 234.0mg，Na₂CO₃100.0mg，CaCl₂ 3.9mg，MgSO₄·7H₂O 59.3mg，Na₂HPO₄·12H₂O 890.7mg，FeSO₄ 0.3mg，FeCl₂·4H₂O 1.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.19mg，MnSO₄·7H₂O 0.1mg，ZnCl₂ 0.07mg，NiCl₂·6H₂O0.024mg，NaMoO₄·2H₂O 0.024mg，MnCl₂·4H₂O 0.006mg，CuCl₂·2H₂O 0.002mg，胰蛋白胨500mg。

1)将该假单胞菌接种在含有50mL液体LB培养基中，30℃摇床震荡培养过夜活化。本实施例中假单胞菌的的添加量为2％，即在50mL中加入1mL菌液。

2)将培养过夜后的菌液6000rpm离心10min，弃上清，用无菌水重悬，再次以6000rpm离心10min，弃上清，加无菌水重悬。将重悬得到的菌液OD₆₀₀调至1.0，按6％(V/V)的接种量转接于含有50mL以邻甲酚为单一碳源的MSM培养基的250mL三角摇瓶中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃，200rpm摇床震荡培养7d。

3)培养7d后，向三角摇瓶中加入10mL的二氯甲烷萃取，倒入分液漏斗中，充分振荡，静置待液体分层后将下层有机相转入离心管中，上层水相再次倒入三角瓶中，重复萃取一次。

4)将两次萃取得到的共20mL萃取物离心，将上层残留的水分用移液器吸干。

5)将两次所得的萃取物定容至20mL。

6)取1mL所得的邻甲酚的二氯甲烷溶液用0.45μm的有机过滤器滤去杂质，制得待测样品。

(2)邻甲酚降解率的测定

1)将得到的待测样品用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，根据事先所测得的峰面积与浓度的标准曲线计算其浓度。

2)所用的GC-MS仪器型号是4500GC-3200MS；所用色谱柱是HP5 30m×0.25mm，载气为氦气，进样温度280℃，升温程序为60℃恒温3min，20℃/min升温到290℃保持10min，进样量1μL。

3)以不加邻甲酚为对照组1，其他步骤均同上；对照组1所测得的浓度为C₁，实验组所测得的浓度为C₂，则最终邻甲酚的降解率为(C₁-C₂)/C₁。即本发明实施例的实验组降解率是扣除了对照组的(即扣除了自然损耗和萃取过程中的损耗)的相对降解率。

在假单胞菌的的添加量为6％；培养温度为30℃，培养基初始pH为7.0的条件下，分别测定在邻甲酚的浓度分别为200、300、400、600、800mg/L下，一周后定时取样检测，降解率如表1和图3所示。

表1

由上可知，本发明实施例的假单胞菌对200mg/L的邻甲酚的降解率为100％。

2、不同温度下的降解率

1)实验组2：采用上述方法在假单胞菌的的添加量为6％，邻甲酚的浓度为300mg/L，培养基初始pH为7.0的条件下，在培养温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃下测定降解率；

2)以不加邻甲酚为对照组2，其他步骤均同上实验组2；对照组2所测得的浓度为C₁，实验组所测得的浓度为C₂，则最终邻甲酚的降解率为(C₁-C₂)/C₁。一周后定时取样检测，降解率如表2和图4所示。

表2

3、不同pH下的降解率

1)实验组3：采用上述方法在假单胞菌的的添加量为6％，邻甲酚的浓度为300mg/L，培养温度为30℃的条件下，分别在培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，7d测定降解率如表3所示。

2)以不加邻甲酚为对照组3，其他步骤均同上实验组3；对照组:3所测得的浓度为C₁，实验组所测得的浓度为C₂，则最终邻甲酚的降解率为(C₁-C₂)/C₁。一周后定时取样检测，降解率如表3和图5所示。

表3

4、现有技术中的常用的假单胞菌具体为施氏假单胞菌N2在30℃、邻甲酚的浓度为200mg/L的条件下，邻甲酚的降解率仅为11.38％。

实施例3假单胞菌MeP对2，4-二叔丁基酚降解能力的探究

1、培养该假单胞菌(Pseudomonas sp.)的培养基为以2，4-二叔丁基为单一碳源的MSM液体培养基。每升MSM液体培养基中含有成分：KH₂PO₄ 338.8mg，(NH₄)₂SO₄ 234.0mg，Na₂CO₃ 100.0mg，CaCl₂ 3.9mg，MgSO₄·7H₂O 59.3mg，Na₂HPO₄·12H₂O 890.7mg，FeSO₄0.3mg，FeCl₂·4H₂O 1.5mg，CoCl₂·6H₂O 0.19mg，MnSO₄·7H₂O 0.1mg，ZnCl₂ 0.07mg，NiCl₂·6H₂O 0.024mg，NaMoO₄·2H₂O 0.024mg，MnCl₂·4H₂O 0.006mg，CuCl₂·2H₂O0.002mg，胰蛋白胨500mg。

1)将该假单胞菌接种在含有50mL液体LB培养基中，30℃摇床震荡培养过夜活化。

2)将培养过夜后的菌液6000rpm离心10min，弃上清，用无菌水重悬，再次以6000rpm离心10min，弃上清，加无菌水重悬。将重悬得到的菌液OD₆₀₀调至1.0，按6％(V/V)的接种量转接于含有50mL以2，4-二叔丁基酚为单一碳源的MSM培养基的锥形瓶中，30℃，200rpm摇床震荡培养7d。

3)测定7d后底物的降解效率：具体地，在假单胞菌的的添加量为6％，2，4-二叔丁基的浓度为300mg/L，培养温度为30℃的条件下，分别在培养基初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0下，7d定时测定降解率。

对照组4为不加假单胞菌，其他条件同实验组4，分别在培养基初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0；对照组4所测得的浓度为C₁，实验组4所测得的浓度为C₂，则最终邻甲酚的降解率为(C₁-C₂)/C₁。

一周后定时取样检测，降解率如表4和图6所示。

表4

由上可知，本发明实施例的假单胞菌在pH为7.0的条件下对300mg/L的邻甲酚的降解率为36.8％。而现有技术中的其他常用假单胞菌尚没有2，4-二叔丁基酚的降解能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

综上可知，本发明提供的一株假单胞菌可以同时发酵降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚，避免了传统的酚类污染物处理方法中成本高、过程复杂、技术难度高、二次污染严重等问题。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一株假单胞菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas)

<400> 1

cgaggctacc atgcagtcga gcggatgaat ggagcttgct ccctgattca gcggcggacg 60

ggtgagtaat gcctaggaat ctgcctggta gtgggggaca acgtttcgaa aggaacgcta 120

ataccgcata cgtcctacgg gagaaagtgg gggatcttcg gacctcacgc tatcagatga 180

gcctaggtcg gattagctag ttggcgaggt aaaggctcac caaggcgacg atccgtaact 240

ggtctgagag gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300

cagcagtggg gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga 360

agaaggtctt cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa gttaatacct 420

tgctgttttg acgttaccga cagaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt 480

aatacgaagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc 540

gttaagttgg atgtgaaagc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa actggcgagc 600

tagagtatgg cagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga 660

aggaacacca gtggcgaagg cgaccacctg ggctaatact gacactgagg tgcgaaagcg 720

tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcgactagcc 780

gttgggatcc ttgagatctt agtggcgcag ctaacgcatt aagtcgaccg cctggggagt 840

acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggcct tgacatgctg agaacctgcc 960

agagatggcg gggtgccttc gggaactcag acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020

gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag 1080

cacgttatgg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaagtc atcatggccc ttacggcctg ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca 1200

aagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tcccataaaa ccgatcgtag tccggatcgc 1260

agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtgaatca gaatgtcacg 1320

gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgctcc 1380

agaagtagct agtctaacct tcggggggac ggtaccacgg agtatca 1427

Claims (10)

1.一株假单胞菌，其特征在于，所述假单胞菌为假单胞菌MeP（Pseudomonas sp. MeP），所述假单胞菌的保藏编号为：CCTCC NO：M 2021368。

2.一种权利要求1所述的假单胞菌在降解邻甲酚中的应用。

3.一种权利要求1所述的假单胞菌在降解2，4-二叔丁基酚中的应用。

4.一种权利要求1所述的假单胞菌在降解邻甲酚和2，4-二叔丁基酚中的应用。

5.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：

将如权利要求1所述的假单胞菌进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

6.一种利用权利要求1所述的假单胞菌降解邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的假单胞菌或者权利要求5所述的发酵菌剂加入到以邻甲酚或/和2，4-二叔丁基酚为碳源的无机盐液体培养基中培养，以使所述的假单胞菌利用所述碳源进行生长。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机盐液体培养基的pH为7.0～9.0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为30℃～35℃。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述邻甲酚在所述无机盐液体培养基中的终浓度为200 mg/L～800 mg/L。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述2，4-二叔丁基酚在所述无机盐液体培养基中的终浓度为200 mg/L～800 mg/L。

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