CN114591877B

CN114591877B - 一株甲基杆菌和其发酵产物及其在抑制藻类生长中的应用

Info

Publication number: CN114591877B
Application number: CN202210496047.6A
Authority: CN
Inventors: 杨旭楠; 刘丛竹; 许玫英
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2042-05-09
Also published as: CN114591877A

Abstract

本发明公开了一株甲基杆菌和其发酵产物及其在抑制藻类生长中的应用，属于微生物技术领域。本发明甲基杆菌12‑2保藏编号为：GDMCC No：62327，菌株12‑2对近头状尖胞藻、蛋白核小球藻和铜绿微囊藻都有显著的抑藻效果，表明其抑藻谱丰富，在控制藻华的生物菌剂方面具有很强的应用潜力。

Description

一株甲基杆菌和其发酵产物及其在抑制藻类生长中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株甲基杆菌和其发酵产物及其在抑制藻类生长中的应用。

背景技术

由于水体富营养化和气候变暖，有害藻华的发生频率日益增加。藻类水华破坏水体生态系统、危害水产养殖业、威胁人类健康、恶化水域景观，是当前地表水污染防治的主要对象。目前，国内外治理藻类水华的方法主要包括物理法、化学法、生态法和生物法四种。①物理法（疏挖底泥、机械除藻、引水冲淤）具有方法简单、不引进二次污染、可防止外域生物入侵的优点，适于应急措施，但不能消除有毒藻类死亡后释放出的有毒物质，高成本而且不宜于大面积操作。②化学法（加入化学药剂杀藻、加入石灰脱氮等）具有操作简单、用量少、见效快、经济合理的优点，但容易造成二次污染，对水环境、生态环境及水生生物都有损害。③生态法（水生植被恢复、生物浮岛技术）具有环境和生态效益的优点，但存在引入外来物种的风险，且操作复杂，运行时间长。④生物法（抑藻细菌）具有快速、简单、经济、高效、安全、无药残的优点。抑藻细菌指可抑制藻类生长，或能破坏藻细胞的各种细菌群，它们在裂解水华蓝藻、调控有害蓝藻生物量及调节水生态系统与初级生产力水平等方面发挥着重要作用。因此，筛选并应用高效抑藻细菌治理藻类水华受到越来越多的关注。

抑藻细菌的作用机理分为直接作用和间接作用，主要有3种作用方式，①细菌直接接触藻细胞，破坏藻体结构，从而杀死藻细胞。②细菌与藻类竞争营养物质，抑制藻体生长。③细菌释放抑藻活性物质，抑制藻类正常生理活动。据文献报道，大部分抑藻细菌的作用方式为第三种。现已知的抑藻细菌主要来自芽孢杆菌Bacillus、链霉菌Streptomyces、假单胞菌Pseudomonas、噬胞菌属Cytophaga、假交替单胞菌属Pseudoalteronionas、交替单胞菌属Alteromonas、腐螺旋菌属Saprospia等，大约70%的菌株具有间接抑藻性能。然而，目前关于甲基杆菌（Methylobacterium sp.）在抑制藻类生长的报道较少。

发明内容

为此，本发明的目的在于提供一株甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2及其在抑制藻类生长中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2，其保藏编号为：GDMCC No：62327。

本发明的第二个目的是提供一种制剂，包含上述甲基杆菌12-2或其发酵培养物。

优选地，所述的发酵培养物是将由甲基杆菌12-2经培养制得的发酵液或去除菌体的发酵液，如将发酵液离心、过滤，得到无菌滤液。

优选地，所述的培养，包括以下步骤：菌株甲基杆菌12-2用R2A培养基扩大培养，然后将菌液转接至R2A液体培养基中，在转速为180 r/min的摇床中30 ℃培养。

更优选地，是按体积比为1:50将菌液转接至液体培养基。

更优选地，所述R2A培养基的成分如下：0.25 g/L胰蛋白胨，0.5 g/L酵母浸粉，0.5g/L酸水解酪蛋白，0.25 g/L蛋白胨，0.5 g/L葡萄糖，0.5 g/L可溶性淀粉，0.3 g/L丙酮酸钠，0.1 g/L硫酸镁，0.3 g/L磷酸氢二钾，pH为7.2。

本发明的第三个目的是提供上述甲基杆菌12-2或制剂在抑制藻类生长中的应用。

优选地，所述的藻类为近头状尖胞藻（Raphidocelis subcapitata）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、丝藻（Ulothrixsp.）或斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明筛选出一株具有抑藻多样性的甲基杆菌12-2，菌株12-2可以抑制近头状尖胞藻、蛋白核小球藻、铜绿微囊藻、丝藻和斜生四链藻生长，叶绿素a去除率分别为89.82%、41.63%、30.76%、18.41%和15.47%，并且上述抑制藻类的类型此前未被报道，说明甲基杆菌的抑藻谱可能更为丰富，在生物菌剂具有很强的应用潜力。

保藏说明

本发明的Methylobacteriumsp. 12-2，于2022年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：62327。

附图说明

图1是甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2的菌落形态图。

图2是甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2的生长曲线图。

图3是甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2对不同藻种的抑藻效果图。

具体实施方式

以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。

实施例1 甲基杆菌（Methylobacteriumsp.）12-2的分离、鉴定和培养

本发明的甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2是从广东省广州市天河区华南农业大学洪泽湖中分离和纯化得到的，具体包括以下步骤：

（1）分离：采集华南农业大学洪泽湖水样，将其稀释至10⁵、10⁶、10⁷后涂布于藻粉无机盐培养基（1 g/L K₂HPO₄，0.5 g/L MgSO₄，0.5 g/L NH₄Cl，0.5 g/L KNO₃，0.1%微量元素，0.1%维生素，1%高纯螺旋藻粉（购自河南的万邦实业有限公司），其中微量元素的配方为10mL/L HCl，1.5 g/L FeCl₂·4H₂O，190 mg/L CoCl₂·6H₂O，100 mg/L MnCl₂·4H₂O，mg/L，70mg/L ZnCl₂，62 mg/L H₂BO₄，36 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，24 mg/L NiCl₂·6H₂O，17 mg/LCuCl₂·2H₂O，维生素的配方为2 mg/L叶酸，10 mg/L维生素B6，5 mg/L维生素B2，2mg/L维生素H，5 mg/L维生素B1，5 mg/L维生素B5，0.1 mg/L维生素B12，5 mg/L烟酸，5 mg/L对氨基苯甲酸，5 mg/L硫辛酸，溶剂为水，将各成分加入到水中，混合均匀灭菌制得），分离获得待试菌株12-2。

（2）鉴定：菌落如图1所示，使用细菌通用引物1492R和27F对单菌的16S rRNA基因片段进行扩增，并进行测序（生物工程上海股份有限公司）。所得两条正反序列用ContigExpress软件进行拼接，然后在GenBank数据库中比对分析。甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2的分子分类地位：菌株12-2的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，与Methylobacterium radiotolerans JCM2831相似度达99.89%，因此初步鉴定菌株12-2属于甲基杆菌，将其命名为Methylobacterium sp. 12-2。该菌于2022年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：62327。

（3）培养：菌株用R2A培养基（0.25 g/L胰蛋白胨，0.5 g/L酵母浸粉，0.5 g/L酸水解酪蛋白，0.25 g/L蛋白胨，0.5 g/L葡萄糖，0.5 g/L可溶性淀粉，0.3 g/L丙酮酸钠，0.1g/L硫酸镁，0.3 g/L磷酸氢二钾，pH为7.2）扩大培养，将100 µL的菌液转接到装有5 mL R2A液体培养基的试管中，在转速为180 r/min的摇床中30 ℃培养，每小时测定在600 nm波长处的吸光值（OD ₆₀₀），设3个平行。以OD ₆₀₀为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。用R2A液体培养基培养，菌株12-2的生长曲线如图2。

实施例2 甲基杆菌（Methylobacteriumsp.）12-2的抑藻广谱性

将铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、近头状尖胞藻（Raphidocelis subcapitata）和丝藻（Ulothrix sp.）分别转接到BG11培养基培养10 d后，将待试菌株甲基杆菌12-2（参照实施例1的（3）培养方法，使用稳定期的甲基杆菌12-2菌液）接种于含铜绿微囊藻、斜生四链藻、蛋白核小球藻、近头状尖胞藻和丝藻的BG11培养基（菌藻液体积比为1：9），在25 ℃、12 h昼/12 h夜、2500 lx的条件下培养4 d，每组设置3个平行。根据《水质叶绿素的测定分光光度法》中的丙酮提取法测定藻培养液的Chl-a浓度（公式(1)），再根据公式(2)计算抑藻率R（Chl-a去除率）。

公式(1)

其中，Chl-a为样品的叶绿素a浓度（mg/L）；OD为不同波长下的吸光度；L为比色皿光程（cm）；V₁为丙酮提取液体积（mL）；V₂为样品体积（L）。

公式(2)

其中，R为叶绿素a去除率（%）；Chl-a_对照组为藻液与无菌R2A培养基共培养后的叶绿素a浓度（mg/L）；Chl-a_实验组为藻液与菌液共培养后的叶绿素a浓度（mg/L）。

甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2能抑制近头状尖胞藻（Raphidocelis subcapitata）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、丝藻（Ulothrixsp.）和斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）的生长，叶绿素a去除率分别为89.82%、41.63%、30.76%、18.41%和15.47%（图3）。

以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。

对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一株甲基杆菌和其发酵产物及其在抑制藻类生长中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 956

<212> DNA

<213> 甲基杆菌12-2(Methylobacterium sp.)

<400> 1

ggggcctttg ccgccagctt aacaaatgca agtcgagcgg gcccttcggg gtcagcggcg 60

gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgcct tctggttcgg aataaccctg ggaaactagg 120

gctaataccg gatacgccct tttggggaaa ggtttactgc cggaagatcg gcccgcgtct 180

gattagctag ttggtggggt aacggcctac caaggcgacg atcagtagct ggtctgagag 240

gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300

gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt 360

agggttgtaa agctctttta tccgggacga taatgacggt accggaggaa taagccccgg 420

ctaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgctc ggaatcactg 480

ggcgtaaagg gcgcgtaggc ggcgttttaa gtcgggggtg aaagcctgtg gctcaaccac 540

agaatggcct tcgatactgg gacgcttgag tatggtagag gttggtggaa ctgcgagtgt 600

agaggtgaaa ttcgtagata ttcgcaagaa caccggtggc gaaggcggcc aactggacca 660

tcactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 720

acgccgtaaa cgatgaatgc cagctgttgg ggtgcttgca ccgcagtagc gcagctaacg 780

ctttgagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg 840

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccat 900

cctttgacat ggcgtgttac ccagagagat ctggggtccc cttcgggggc gcgcac 956

Claims

1.一种甲基杆菌（Methylobacterium sp.）12-2，其保藏编号为：GDMCC No：62327。

2.一种制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的甲基杆菌12-2或其发酵培养物，所述的其发酵培养物是由甲基杆菌12-2经培养制得的含有甲基杆菌12-2的发酵液。

3. 根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述的培养，包括以下步骤：菌株用R2A培养基扩大培养，将菌液转接到R2A液体培养基中，在转速为180 r/min的摇床中30℃培养；

所述R2A培养基的成分如下：0.25 g/L胰蛋白胨，0.5 g/L酵母浸粉，0.5 g/L酸水解酪蛋白，0.25 g/L蛋白胨，0.5 g/L葡萄糖，0.5 g/L可溶性淀粉，0.3 g/L丙酮酸钠，0.1 g/L硫酸镁，0.3 g/L磷酸氢二钾，pH为7.2。

4. 权利要求1所述的甲基杆菌12-2或权利要求2-3任一项所述的制剂在抑制藻类生长中的应用，所述的藻类为近头状尖胞藻（Raphidocelis subcapitata）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、丝藻（Ulothrix sp.）或斜生四链藻（Tetradesmus obliquus）。