CN114806942A - 一株假单胞菌和其发酵产物及其在控制藻类生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株假单胞菌和其发酵产物及其在控制藻类生长中的应用，属于微生物技术领域。本发明假单胞菌2‑4保藏编号为：GDMCCNo：62329，菌株2‑4对蓝藻纲的铜绿微囊藻、绿藻纲多细胞斜生四链藻、单细胞丝藻和蛋白核小球藻都有显著的抑藻效果，抑藻谱丰富，在控制藻华的生物菌剂方面具有很强的应用潜力。本发明还提供了包含上述假单胞菌2‑4的发酵液、培养物或无菌滤液，并基于生态安全评估探索该溶藻细菌及其分泌物的抑藻效果与机制，为溶藻细菌控制藻类生长和治理藻类水华的应用实践提供参考。

Description

一株假单胞菌和其发酵产物及其在控制藻类生长中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株假单胞菌和其发酵产物及其在控制藻类生长中的应用。

背景技术

近年来，由于水体富营养化和气候变暖，有害藻华的发生频率日益增加。其中，有害微囊藻(如铜绿微囊藻)分泌的微囊藻毒素威胁饮用水安全，危害水生生态系统健康。2016年，“全球变化下有害藻华研究计划”正式启动，该计划旨在改进对藻华的认识和预测能力，更全面地开展藻华的防控与治理。目前，微生物控藻技术因其环境友好性而备受环境管理部门和研究者的关注。研究者分离筛选溶藻细菌，将其应用于富营养化鱼塘、虾养殖池塘、湖泊和河道等环境的藻华防控中，有效降低水体藻细胞数量或叶绿素a(Chlorophylla,Chl-a)浓度。因此，溶藻细菌具有广阔的应用前景。

溶藻细菌(algicidal bacteria)是一种以直接或间接的方式溶解破坏藻细胞结构或抑制藻生长的细菌。1942年Geitler最早发现了一株粘细菌(Polyangiumparasiticum)能够杀死刚毛藻(Chladophora sp.)，此后越来越多溶藻细菌被报道出来。至今共报道了5个门、78个属的溶藻细菌，其中报道菌株数目最多的是芽孢杆菌(Bacillusspp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)。假单胞菌因其较高的抑藻效率得到广泛关注。Wang等分离了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosaACB3)对铜绿微囊藻抑藻率可达97.50％。黄姿等发现了一株假单胞菌(Pseudomonassp.Z3)对状亚历山大藻(Alexandrium catenella)抑藻率为95.00％。赵传鹏等研究了一株假单胞菌对铜绿微囊藻培养液和太湖水样的抑藻效果，1d后抑藻率分别为91.00％和85.90％。Zhou等发现一株铜绿假单胞菌通过分泌代谢物质阻碍了铜绿微囊藻细胞内蛋白质和碳水化合物的合成，并通过膜脂过氧化来破坏铜绿微囊藻的细胞膜，7d后Chl-a去除率为83.84％。据统计，假单胞菌属溶藻细菌可抑制金藻门(Chrysophyta)、褐藻门(Ochrophyta)、蓝藻门(Cyanobacteria)、绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Bacillariophyta)、甲藻门(Pyrroptata)共6个门的25个属的藻生长，其抑藻多样性仅次于芽孢杆菌，具有很强的应用潜力。然而，假单胞菌属中存在较多条件致病菌，如溶藻效率较高的铜绿假单胞菌是一种水源性和食源性的条件致病菌，可引起人类呼吸道感染、伤口感染、菌血症和败血症等。因此，在使用溶藻细菌控制藻华实践中应充分考虑其生态环境风险。

近年来，研究者们开始研究溶藻细菌的生态环境风险。潘瑞松等发现溶藻细菌Bacillus sphaericu Y1菌液对发光细菌具有轻微的急性毒性。孔赟等用发光细菌检验了溶藻细菌Streptomyces sp.HJC-D1的过滤发酵液，发现溶藻细菌分泌物同样具有一定的急性毒性。而童晶发现溶藻细菌Arenibacter sp.A61的无菌滤液对大型溞(Daphnia magna)、褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)和南美白对虾(Penaeus vannamei)没有产生急性活动抑制。吴培枫等用斑马鱼(Brachydanio rerio)和小鼠对溶藻细菌Halomona sp.DH-e的无菌滤液进行急性毒性检验，结果表明菌分泌物低毒或无毒。然而，目前关于溶藻细菌生态风险的研究仍然较少，且大多数研究报道的高抑藻率是在溶藻细菌投入量较高的条件下获得的，未充分考虑高浓度溶藻细菌的潜在生态环境风险。因此，有必要针对溶藻细菌的应用特性，开展抑藻效果与溶藻细菌风险相关联的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种溶藻细菌假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4，基于生态安全评估探索该溶藻细菌及其分泌物的抑藻效果与机制，以期为溶藻细菌控制藻类生长和治理藻类水华的应用实践提供参考。

本发明的第一个目的是提供一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4，其保藏编号为：GDMCC No：62329。

假单胞菌2-4的形态和生理生化特征：用R2A固体培养基培养菌株2-4，菌落乳白色，中心凸起，不规则片状，表面粗糙不光滑无光泽，菌落直径为(1.80±0.62)mm，有类似生姜气味，1d后菌落周围有荧光绿色色素，7d后荧光绿色褪去。在扫描电子显微镜下观察2-4菌体为杆状，菌体长为(1.53±0.21)μm，宽为(0.52±0.06)μm。菌株2-4是革兰氏阴性菌，不能氧化氨和还原苋菜红，能够还原硝酸盐和产气，4d后总氮脱氮率为73.49％。结合生理生化特征分析，进一步鉴定菌株2-4为假单胞菌。用R2A液体培养基培养，细菌2-4的生长曲线，第0–3h细菌处于迟缓期，第3–8h细菌处于对数期，第9h细菌开始达到稳定期。

假单胞菌2-4的分子分类地位：菌株2-4的16S rRNA基因序列在GenBank的登录号为OK465191，与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa NBRC12689)相似度达99.6％，因此初步鉴定菌株2-4属于假单胞菌，将其命名为Pseudomonas sp.2-4。

本发明的第二个目的是提供一种制剂，包含上述假单胞菌2-4、或其发酵培养物或代谢产物。

具体地，所述的发酵培养物是将由假单胞菌2-4经培养制得的发酵液或去除菌体的发酵液，如将发酵液离心、过滤，得到无菌滤液，所述的过滤是用针式滤头(0.22μm)过滤；

优选地，所述的培养，包括以下步骤：菌株假单胞菌2-4用R2A培养基扩大培养，然后将菌液转接至R2A液体培养基中，在转速为180r/min的摇床中30℃培养；

更优选地，是按体积比为1:50将菌液转接至液体培养基；

更优选地，所述R2A培养基的成分如下：0.25g/L胰蛋白胨，0.5g/L酵母浸粉，0.5g/L酸水解酪蛋白，0.25g/L蛋白胨，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L丙酮酸钠，0.1g/L硫酸镁，0.3g/L磷酸氢二钾，pH为7.2。

本发明的第三个目的是提供一种假单胞菌2-4分泌的抑藻物质，其分子量小于500Da，可被高温和强酸强碱破坏而失活。

本发明的第四个目的是提供上述假单胞菌2-4、制剂和/或抑藻物质在抑制藻类生长中的应用。

优选地，所述的藻类为铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、斜生四链藻(Tetradesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)或丝藻(Ulothrixsp.)。

优选地，所述的制剂是假单胞菌2-4的发酵液，其以体积浓度≤1.5％的比例加入到藻类培养体系中。

优选地，所述的制剂是将假单胞菌2-4的发酵液离心、过滤，得到无菌滤液，无菌滤液以体积浓度≤10％的比例加入到藻类培养体系中。

优选地，所述的假单胞菌2-4抑制铜绿微囊藻的条件为4.50×10⁶个-6.75×10⁶个/mL，菌液接种量10％-15％，pH9-10；更优选地，所述的假单胞菌2-4抑制铜绿微囊藻的条件为藻细胞数目4.50×10⁶个/mL，菌液接种量15％，pH10。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明筛选出一株具有抑藻多样性的假单胞菌2-4，菌株2-4对蓝藻纲的铜绿微囊藻、绿藻纲多细胞斜生四链藻、单细胞丝藻和蛋白核小球藻都有显著的抑藻效果，4d内其Chl-a去除率分别为93.32％、72.25％、22.69％和40.95％。其中对斜生四链藻、蛋白核小球藻和丝藻的抑制效果此前未被报道，说明假单胞菌的抑藻谱可能更为丰富，也说明假单胞菌作为控制藻华的生物菌剂具有很强的应用潜力；

(2)本发明提供的假单胞菌2-4菌液抑藻的优选条件：藻细胞数目4.50×10⁶个/mL，菌液接种量15％，pH10，这时菌株2-4对Chl-a的去除率(抑藻率)为92.81％；

(3)本发明提供的菌液、无菌滤液、清洗后的菌细胞均具有抑藻作用，4d后Chl-a去除率分别为93.10％、60.34％和10.62％，说明菌株2-4可分泌抑藻物质，进而抑制藻细胞的活性或破坏藻细胞，也即本发明提供了直接和间接抑藻的方式；

(4)本发明通过温度和pH条件检验了菌株2-4无菌滤液(分泌物)的抑藻功能稳定性：无菌滤液中的抑藻活性成分可被高温和强酸强碱破坏而失活，菌株2-4分泌的主要抑藻活性物质分子量小于500Da，为实际应用提供了理论基础；

(5)本发明提供的菌株2-4菌液抑藻的较佳体积浓度≤1.5％，既能达到抑藻效果(体积浓度为1.5％，抑藻率为90.60％)，又能显示出较低的水生生物毒性；

(6)本发明提供的菌株2-4无菌滤液抑藻的较佳体积浓度≤10％，既能达到抑藻效果(体积浓度为10％，抑藻率为82.98％)，又能显示出较低的水生生物毒性。

保藏说明

本发明的Pseudomonas sp.2-4，于2022年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：62329。

附图说明

图1是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4在固体培养基上的菌落形态图。

图2是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的扫描电镜图，标尺值为5μm。

图3是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的生长曲线图。

图4是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4基于16S rRNA基因序列的系统进化树图。

图5是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4对不同藻种的抑藻效果图。

图6是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4对铜绿微囊藻的动力学降解曲线图。

图7是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4对铜绿微囊藻的抑藻作用方式图。

图8是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻活性物质对温度的稳定性图。

图9是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻活性物质对pH的稳定性图。

图10是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻活性物质分子量大小图。

图11是扫描电镜观察假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的菌液及其无菌滤液对铜绿微囊藻细胞的抑藻效果图，其中A1-A3为正常状态下的铜绿微囊藻细胞，B1-B3为加入10％菌液后的藻细胞，C1-C3为加入10％无菌滤液后的藻细胞。

图12是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的菌液对大型溞的急性活动抑制和对铜绿微囊藻的抑制图。

图13是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的无菌滤液对大型溞的急性活动抑制和对铜绿微囊藻的抑制图。

图14是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的无菌滤液对明亮发光杆菌的急性毒性和对铜绿微囊藻的抑制效果图。

图15是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的无菌滤液和R2A培养基对稀有鮈鲫的急性毒性图。

图16是假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4菌液及其无菌滤液对不同藻华水样的抑藻效果图。

具体实施方式

以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。

实施例1假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的分离和鉴定

本发明的假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4是从广东省广州市天河区华南农业大学洪泽湖中分离和纯化得到的，具体包括以下步骤：

(1)分离：采集华南农业大学校内人工湖(洪泽湖，HZ湖)水样，将其稀释至10⁵、10⁶、10⁷后涂布于藻粉无机盐培养基(1g/L K₂HPO₄，0.5g/L MgSO₄，0.5g/L NH₄Cl，0.5g/L KNO₃，0.1％微量元素，0.1％维生素，1％高纯螺旋藻粉(购自河南的万邦实业有限公司)，其中微量元素的配方为10mL/L HCl，1.5g/L FeCl₂·4H₂O，190mg/L CoCl₂·6H₂O，100mg/L MnCl₂·4H₂O，mg/L，70mg/L ZnCl₂，62mg/L H₂BO₄，36mg/L Na₂MoO₄·2H₂O，24mg/L NiCl₂·6H₂O，17mg/L CuCl₂·2H₂O，维生素的配方为2mg/L叶酸，10mg/L维生素B6，5mg/L维生素B2，2mg/L维生素H，5mg/L维生素B1，5mg/L维生素B5，0.1mg/L维生素B12，5mg/L烟酸，5mg/L对氨基苯甲酸，5mg/L硫辛酸，溶剂为水，将各成分加入到水中，混合均匀灭菌制得)，分离获得待试菌株2-4。

(2)鉴定：

分子学鉴定：使用细菌通用引物1492R和27F对单菌的16S rRNA基因片段进行扩增，并进行测序(生物工程上海股份有限公司)。所得两条正反序列用Contig Express软件进行拼接，然后在GenBank数据库中比对分析，并上传序列申请GenBank登录号。在MEGA7软件上构建进化树图(邻接法)。假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的分子分类地位：菌株2-4的16S rRNA基因序列(如SEQ ID NO.1所示)与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosaNBRC12689)相似度达99.6％(图4)，因此初步鉴定菌株2-4属于假单胞菌，将其命名为Pseudomonas sp.2-4。

形态特征：用R2A固体培养基培养菌株2-4，如图1，菌落乳白色，中心凸起，不规则片状，表面粗糙不光滑无光泽，菌落直径为(1.80±0.62)mm，有类似生姜气味，1d后菌落周围有荧光绿色色素，7d后荧光绿色褪去。如图2，在扫描电子显微镜下观察2-4菌体为杆状，菌体长为(1.53±0.21)μm，宽为(0.52±0.06)μm。

生理生化特征：根据《现代微生物学实验技术》分析菌株的生理生化特性(革兰氏染色、苋菜红还原、氨氧化、硝酸盐还原、产气实验，总氮脱氮率)，结果如表1所示。

表1菌株2-4的形态及生理生化特征

菌株2-4是革兰氏阴性菌，不能氧化氨和还原苋菜红，能够还原硝酸盐和产气，4d后总氮脱氮率为73.49％。结合生理生化特征分析(表1)，进一步鉴定菌株2-4为假单胞菌。

(3)培养：菌株用R2A培养基(0.25g/L胰蛋白胨，0.5g/L酵母浸粉，0.5g/L酸水解酪蛋白，0.25g/L蛋白胨，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L丙酮酸钠，0.1g/L硫酸镁，0.3g/L磷酸氢二钾，pH为7.2)扩大培养，将100μL的菌液转接到装有5mL R2A液体培养基的试管中，在转速为180r/min的摇床中30℃培养，每小时测定在600nm波长处的吸光值(OD₆₀₀)，设3个平行。以OD₆₀₀为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。用R2A液体培养基培养，菌株2-4的生长曲线如图3，第0–3h细菌处于迟缓期，第3–8h细菌处于对数期，第9h细菌开始达到稳定期。

经过形态学、生理生化和分子分类学的鉴定结果，本发明认为菌株2-4属于Pseudomonas属的一个新种，命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4，该菌于2022年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，保藏编号为：GDMCC No：62329。

实施例2假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻广谱性

将铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、斜生四链藻(Tetradesmus obliquus)和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、近头状尖胞藻(Raphidocelis subcapitata)和丝藻(Ulothrix sp.)分别转接到BG11培养基培养10d后，将待试菌株假单胞菌2-4(参照实施例1的(3)培养方法，使用稳定期的假单胞菌2-4菌液)接种于含铜绿微囊藻、斜生四链藻、蛋白核小球藻、近头状尖胞藻和丝藻的BG11培养基(菌液与藻液的体积比为1：9)，在25℃、12h昼/12h夜、2500lx的条件下培养4d，每组设置3个平行。根据《水质叶绿素的测定分光光度法》中的丙酮提取法测定藻培养液的Chl-a浓度(公式1)，再根据公式2计算抑藻率R(Chl-a去除率)。

其中，Chl-a为样品的叶绿素a浓度(mg/L)；OD为不同波长下的吸光度；L为比色皿光程(cm)；V₁为丙酮提取液体积(mL)；V₂为样品体积(L)。

R(％)＝(Chl-a_对照组-Chl-a_实验组)/Chl-a_对照组×100公式(2)

其中，R为叶绿素a去除率(％)；Chl-a_对照组为藻液与无菌R2A培养基共培养后的叶绿素a浓度(mg/L)；Chl-a_实验组为藻液与菌液共培养后的叶绿素a浓度(mg/L)。

假单胞菌(Pseudomonassp.)2-4同样显示出来了抑藻多样性，如图5所示，菌株2-4对蓝藻纲的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、绿藻纲多细胞斜生四链藻(Tetradesmus obliquus)、单细胞丝藻(Ulothrixsp.)和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)都有显著的抑藻效果，4d内其Chl-a去除率均值分别为93.32％、72.25％、22.69％和40.95％，但对近头状尖胞藻(Raphidocelissubcapitata)没有抑藻效果。其中对斜生四链藻、蛋白核小球藻和丝藻的抑制效果此前未被报道，说明假单胞菌的抑藻谱可能更为丰富，也说明假单胞菌作为控制藻华的生物菌剂具有很强的应用潜力。

实施例3假单胞菌(Pseudomonassp.)2-4的正交试验

以铜绿微囊藻为作用对象，采用L₉(3³)正交试验，设置3个变量和3个水平，即藻细胞数目(4.5×10⁶、6.75×10⁶和13.5×10⁶个/mL)，菌接种量(体积比5％、10％和15％)和pH(8、9和10)。每个处理设置3个平行，4d后测量对照组(将菌液替换成无菌R2A)和实验组的Chl-a浓度，再计算其抑藻效果(Chl-a去除率)。利用有效性统计来测量各变量水平对抑藻效果的影响：

其中：E_i表示i水平所对应抑藻效果(Chl-a去除率)的平均值，q_ij表示第j列i水平条件所对应抑藻效果。在i水平上，E_i值越高表示抑藻效果越高。采用极差统计方法比较各变量对抑藻效果的影响。计算各变量的极差统计值R_i＝max(E_i)－min(E_i)，极差统计值越高，说明该变量对抑藻效果的影响越大。

为研究菌株2-4抑藻的影响因素和优化抑藻反应条件，本实施例设计了3变量×3水平的正交试验L₉(3³)(表2)。参照实施例2的方法进行抑藻效果测试。

表2L₉(3³)正交试验设计

表3L₉(3³)正交试验结果

正交试验结果(表3)显示菌液接种量对抑藻效果的影响最大，随着细菌浓度的增加，抑藻效果增强；相反，随着藻细胞数量的增加，抑藻效果降低。pH的影响仅次于菌液接种量，其中pH最优值为9，pH增加或降低均影响抑藻效率。然而，考虑到藻华发生时，水环境的pH一般达到10以上，为接近实际应用条件，后续研究优选条件设为试验编号3(藻细胞数目4.50×10⁶个/mL，菌液接种量15％，pH10)，此时，菌株2-4对Chl-a的去除率(抑藻率)均值为92.81％

实施例4假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻动力学反应

根据正交试验优化的条件(藻细胞数目4.50×10⁶个/mL，菌液接种量15％，pH10)进行菌藻共培养实验，设置3个平行，从0h开始每隔12h取样测定对照组(将菌液替换成无菌R2A培养基)和实验组的Chl-a含量，并计算不同时间的Chl-a去除率，持续120h。使用一级和二级反应动力学方程(郭惠娟等,2019)模拟Chl-a随时间的变化规律，计算Chl-a半衰期(t_1/2)。一级(公式4)和二级(公式5)反应动力学方程如下：

[Chl-a]_t＝1/(t·k₂+1/[Chl-a]₀) 公式(5)

其中，[Chl-a]_t表示时间为t时的Chl-a浓度，[Chl-a]₀表示时间为0时预测的初始浓度，t表示时间，k₁和k₂为一级和二级动力学参数。

基于正交试验的优化条件，研究了菌株2-4的抑藻反应动力学过程。由图6可见，空白对照中表征藻细胞丰度的Chl-a浓度随时间增长，而藻菌共培养体系中Chl-a浓度随时间降低，抑藻效率逐渐升高。应用一级和二级反应动力学方程模拟Chl-a随时间的衰减过程。结果显示，Chl-a的衰减过程更符合一级反应动力学(r_1st ²＝0.668vs r_2nd ²＝0.583)，说明菌株2-4对铜绿微囊藻的抑制作用更大可能是直接杀抑作用。根据菌株2-4的一级动力学方程模拟结果，Chl-a的半衰期为126h(t_1/2＝126h)，相应的Chl-a去除率为87.71％。

实施例5假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻作用方式

将培养到稳定期(培养基是R2A培养基)的菌液于冷冻离心机中8000r/min离心15min，用针式滤头(0.22μm)过滤，得无菌滤液，离心管底部的菌细胞用无菌水冲洗3次(洗去菌分泌物)，再用无菌水重悬菌细胞，得到清洗后的菌细胞。按10％体积比分别将菌液、无菌滤液(分泌物)和清洗后的菌细胞与铜绿微囊藻在相同条件下进行共培养，设置3个平行，4d后测定Chl-a含量并计算去除率。铜绿微囊藻的藻液制备方法参照实施例2。

结果如图7所示，4d后Chl-a去除率均值分别为93.10％、60.34％和10.62％，说明菌株2-4可分泌抑藻物质，进而抑制藻细胞的活性或破坏藻细胞。

实施例6假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻物质特性

菌株2-4的无菌滤液经不同温度(将无菌滤液分别置于-80、-28、4、30、60、80和98℃处理3h，待解冻或冷却)和pH(用1mol/L HCL和1mol/L NaOH将无菌滤液的pH分别调为3、5、7、9和11，处理3h后再调回初始pH)处理后，按10％体积比与铜绿微囊藻共培养，将10％无菌滤液替换成10％无菌R2A培养基作为对照组CK，每种处理设3个平行，4d后测定Chl-a含量并计算去除率。铜绿微囊藻的藻液制备方法参照实施例2。本研究通过温度和pH条件检验了菌株2-4无菌滤液(分泌物)的抑藻功能稳定性。发现高温(60、80和98℃)处理后的无菌滤液失去抑藻活性，而低温(-80、-28和4℃)和30℃常温处理的无菌滤液仍具有较强抑藻活性，4d后Chl-a去除率均值分别为63.87％、70.35％、64.75％和60.34％(图8)。此外，滤液在强酸(pH＝3)和强碱(pH＝9和11)处理后对铜绿微囊藻的抑制效果显著下降(图9)。以上结果说明无菌滤液中的抑藻活性成分可被高温和强酸强碱破坏而失活。

实施例7假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻物质分子量大小

分别取5mL无菌滤液于不同分子量大小的透析袋中(0.5、3.5、7、15、25和45kDa)，用100倍体积(500mL)去离子水透析24h，期间换水3次，透析后的滤液以10％体积分数接种到铜绿微囊藻培养液中进行抑藻实验，设置空白组(加10％无菌R2A培养基)和对照组(加10％未处理的滤液)，设置3个平行，比较不同大小截留物质的抑藻效率(共培养4d后Chl-a去除率)。铜绿微囊藻的藻液制备方法参照实施例2。如图10，菌株2-4的无菌滤液经不同分子量大小(0.5、3.5、7、15、25和45kDa)透析袋透析后的Chl-a去除率明显降低，与未透析的无菌滤液抑藻效果存在显著差异，由此推测，无菌滤液经24h透析后有效抑藻活性成分流失，说明菌株2-4分泌的主要抑藻活性物质分子量小于500Da。

实施例8假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的抑藻动力学反应

参照实施例2制备铜绿微囊藻的藻液。将培养了10d的铜绿微囊藻分为3组：分别加入终浓度为10％无菌R2A培养基(A组)，10％菌液(B组)，10％无菌滤液(C组)。共培养4d后取样，使用扫描电子显微镜观察藻细胞数量及形态变化并拍照。本研究通过扫描电镜进一步观察了菌株2-4及其无菌滤液对铜绿微囊藻的抑藻效果。接入无菌R2A培养基(A)、菌液(B)及其无菌滤液(C)，4d后铜绿微囊藻细胞形态和数目的变化如图3所示。对比图11中的A、B、C三个组别中的藻细胞数量可知，加入菌株2-4菌液及其无菌滤液后铜绿微囊藻数量较对照组的明显减少，进一步验证了菌株2-4及其分泌物的抑藻效果，且菌液的抑藻效果相比无菌滤液更强。正常状态下的铜绿微囊藻呈规则圆球形、表面平滑(图11A3)；加入无菌滤液后，部分藻细胞表面皱缩(图11C3)，而加入菌株2-4菌液后的藻细胞表面皱缩粗糙，部分藻细胞变形，甚至被破坏(图11B3)。由此推测，菌株2-4及其分泌物可通过破坏铜绿微囊藻细胞结构从而产生直接的杀抑效果，印证了其一级抑藻动力学结果(图6)。

实施例9假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的急性毒性

铜绿假单胞菌是一种水源性和食源性的条件致病菌。菌株2-4与铜绿假单胞菌相似度较高，存在潜在的应用风险。因此，本研究设置了明亮发光杆菌、大型溞和稀有鮈鲫三个营养级的生物，检测菌株2-4及其无菌滤液(分泌物)的生态风险，客观评价其应用价值。

1、大型溞测试

根据《化学品溞类急性活动抑制试验》国家标准(GB/T 21830-2008)，将不同体积比的菌液(终浓度为0.5％、1.5％、3％和5％)或无菌滤液(终浓度为2％、5％、10％和15％)分别加入到装有大型溞和50mL M4培养基的烧杯(100mL)中，每个烧杯装5头溞，每组设置4个平行，分别在试验开始后24h和48h观察并记录溞受抑制的情况。计算48h的半数效应体积比(％),将对应体积的菌液或无菌滤液烘干后称重，换算成半数效应浓度(Medianeffective concentration,EC₅₀,mg/L)。根据《化学品分类和标签规范第28部分：对水生环境的危害》国家标准，急性水生危害甲壳纲毒性分为类别1(48h EC₅₀≤1mg/L)、类别2(1mg/L<48h EC₅₀≤10mg/L)和类别3(10mg/L<48h EC₅₀≤100mg/L)，当48h EC₅₀>100mg/L时，对大型溞低毒或无毒。同时，分别测定不同体积比的菌液(0.5％、1.5％、3％和5％)和无菌滤液(2％、5％、10％和15％)对铜绿微囊藻的Chl-a去除率(4d)。

从菌株2-4菌液、无菌滤液与大型溞的剂量效应曲线可见，菌株2-4菌液对大型溞48h的半数效应体积比为2.78％(图12)，换算成半数效应浓度(EC₅₀)为52.00mg/L，而无菌滤液对大型溞48h的半数效应体积比为10.92％(图13)，换算成半数效应浓度(EC₅₀)为31.33mg/L，都低于国家标准规定的急性水生危害甲壳纲阀值(100mg/L)，说明菌株2-4菌液及其分泌物对大型溞都有毒性效应，毒性级别为类别3。

2、明亮发光杆菌测试

根据《水质急性毒性的测定发光细菌法》国家标准(GB/T 15441-1995)，以氯化汞标准溶液(0.02–0.10mg/L)为参比，以氯化钠溶液(30g/L)为对照。将10μL发光细菌，分别加入到2mL不同浓度(2％、5％、10％、15％、20％和30％)的无菌滤液、参比溶液和对照溶液中，设置3个平行，15min后用生物发光光度计测定发光量(mV)，根据公式(6)和(7)分别计算相对发光度L和抑制发光率IL。当样品的抑制发光率低于最低检出限(0.02mg/L氯化汞标准溶液浓度对应的抑制发光率)，则判定该浓度的样品无毒。当样品的抑制发光率高于检出限，通过标准曲线计算出对应的氯化汞标准溶液浓度，相当于该浓度氯化汞标准溶液的毒性。同时，分别测定不同体积比的(2％、5％、10％、15％、20％和30％)无菌滤液对铜绿微囊藻Chl-a去除率(4d)。

L(％)＝mV_{标线组或样品组}/mV_对照组×100 公式(6)

IL(％)＝100-L 公式(7)

菌株2-4的无菌滤液对明亮发光杆菌的急性毒性试验显示(图14)，无菌滤液体积比为2％、5％、10％和15％时，其抑制发光率均显著低于最低检出限，而无菌滤液体积比为20％和30％时，其抑制发光率与最低检出限处于同一水平，说明菌株2-4的无菌滤液体积比低于15％时对明亮发光杆菌无毒性效应，而20％和30％的无菌滤液对明亮发光杆菌微毒，相当于0.02mg/L氯化汞标准溶液的毒性。其中15％体积比的无菌滤液在对明亮发光杆菌无毒性效应的前提下有较高的Chl-a去除率(均值85.71％)。

3、稀有鮈鲫测试

根据《化学品鱼类急性毒性试验》国家标准(GB/T 27861-2011)，将无菌滤液按0％、2％、5％和10％体积比分别加入到装有稀有鮈鲫和3L水的广口瓶中，每瓶5尾鱼，3个平行，对照组加入10％R2A培养基，分别在试验开始后3、6、18、24、48、72和96h观察并记录各试验组幼鱼状态，计算96h的半数致死体积比(％)，对应体积的滤液烘干后称重(mg)，换算成半数致死浓度(Median lethal concentration,LC₅₀,mg/L)。根据《化学品分类和标签规范第28部分：对水生环境的危害》国家标准(GB 30000.28-2013)，急性水生危害鱼类毒性分为类别1(96h LC₅₀≤1mg/L)、类别2(1mg/L<96h LC₅₀≤10mg/L)和类别3(10mg/L<96h LC₅₀≤100mg/L)，当96h LC₅₀>100mg/L时，对稀有鮈鲫低毒或无毒。

图15展示了稀有鮈鲫暴露于各体积比的菌株2-4无菌滤液的累计死亡率。经计算稀有鮈鲫96h半数致死体积比为6％，换算成半数致死浓度(LC₅₀)为74.22mg/L，低于国家标准规定的急性水生危害鱼纲阀值(100mg/L)，说明菌株2-4分泌物对稀有鮈鲫有毒，毒性为类别3。需要说明的是，较高体积比的无菌滤液(5％和10％)会导致稀有鮈鲫死亡，其原因除了菌株2-4分泌物的潜在毒性(如10％无菌滤液)，还因为过滤液中残留的培养基毒害稀有鮈鲫。以细菌培养基(10％R2A培养基)为投加物时，同样导致了稀有鮈鲫的死亡，且死亡率大于5％无菌滤液处理组。R2A培养基对稀有鮈鲫的毒性可能是由培养基大量和复杂的有机物及其滋生的有害微生物引起的。

综合明亮发光杆菌、大型溞和稀有鮈鲫三种受试生物的毒性效应结果，1.5％的菌株2-4菌液和10％的无菌滤液显示出较低的水生生物毒性。此时，1.5％的菌株2-4菌液和10％的无菌滤液的抑藻率均值为90.60％和82.98％。

实施例10假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4的应用

采集广东省广州市华南农业大学洪泽湖(HZ湖)、鄱阳湖(PY湖)和昭阳湖(ZY湖)的水样，测定Chl-a含量，光学显微镜观察并识别3个湖泊的优势藻种。分别按体积比10％和1.5％将无菌滤液和的菌液加入到3个水样中，对照组分别将无菌滤液和菌液替换成体积分数10％和1.5％无菌R2A培养基，每种处理设置3个平行，4d后测定Chl-a含量并计算去除率。HZ湖、PY湖和ZY湖原始水样的Chl-a浓度分别为54.65、84.34和115.26μg/L。初步镜检发现三个湖泊的藻类群落组成存在差异，其中HZ湖以栅藻和盘星藻为主，PY湖以纤维藻为主，ZY湖以微囊藻和色球藻为主。如图16所示，接种1.5％菌株2-4菌液对ZY湖和PY湖的Chl-a去除率为42.94％和28.04％，但对HZ湖水样的抑藻效果较低(4.83％)。藻类组成和水质差异可能是导致菌株2-4菌液对三个湖泊水样抑藻效率不同的原因。此结果，说明了纯培养菌液在实际应用中容易受目标环境的影响，抑藻效果具有较高的不确定性。与菌液相比，10％无菌滤液的抑藻效果更佳，对PY湖和HZ湖水样的Chl-a去除率显著高于1.5％的菌液，达68.69％和54.15％，且对不同湖泊水样的抑藻效果较为接近，受目标环境的影响程度较低，表现出更高的稳定性。

以上实施实例对本发明不同的实施过程进行了详细的阐述，但是本发明的实施方式并不仅限于此。所述技术领域的普通技术人员依据本发明中公开的内容，均可实现本发明的目的。

对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)

<120> 一株假单胞菌和其发酵产物及其在控制藻类生长中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1248

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.2-4)

<400> 1

gccggtgggg gcaggcctaa acatgcaagt cgagcggatg agggagcttg ctcctggatt 60

cagcggcgga cgggtgagta atgcctagga atctgcctgg tagtggggga taacgtccgg 120

aaacgggcgc taataccgca tacgtcctga gggagaaagt gggggatctt cggacctcac 180

gctatcagat gagcctaggt cggattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga 240

cgatccgtaa ctggtctgag aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg 360

ccgcgtgtgt gaagaaggtc ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggcagt 420

aagttaatac cttgctgttt tgacgttacc aacagaataa gcaccggcta acttcgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgaa gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg 540

cgtaggtggt tcagcaagtt ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatcca 600

aaactactga gctagagtac ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc 660

gtagatatag gaaggaacac cagtggcgaa ggcgaccacc tggactgata ctgacactga 720

ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 780

tgtcgactag ccgttgggat ccttgagatc ttagtggcgc agctaacgcg ataagtcgac 840

cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttacctggg ccttgacatg 960

ctgagaactt tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact cagacacagg tgctgcatgg 1020

ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacgagcg caacccttgt 1080

ccttagttac cagcacctcg ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtgctaca 1200

atggtcggta caaagggttg ccaagccgcg aggtggagct aatcccat 1248

Claims (10)

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)2-4，其保藏编号为：GDMCC No：62329。

2.一种制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的假单胞菌2-4或其发酵培养物。

3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述的发酵培养物是将由假单胞菌2-4经培养制得的发酵液或去除菌体的发酵液。

4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述的培养，包括以下步骤：菌株假单胞菌2-4用R2A培养基扩大培养，然后将菌液转接至R2A液体培养基中，在转速为180r/min的摇床中30℃培养；

所述R2A培养基的成分如下：0.25g/L胰蛋白胨，0.5g/L酵母浸粉，0.5g/L酸水解酪蛋白，0.25g/L蛋白胨，0.5g/L葡萄糖，0.5g/L可溶性淀粉，0.3g/L丙酮酸钠，0.1g/L硫酸镁，0.3g/L磷酸氢二钾，pH为7.2。

5.一种权利要求1所述假单胞菌2-4分泌的抑藻物质，其特征在于，其分子量小于500Da。

6.权利要求1所述的假单胞菌2-4、权利要求2-4任一项所述的制剂或权利要求5所述的抑藻物质在抑制藻类生长中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的藻类为铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、斜生四链藻(Tetradesmus obliquus)、蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)或丝藻(Ulothrix sp.)。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂是假单胞菌2-4的发酵液，其以体积浓度≤1.5％的比例加入到藻类培养体系中。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂是将假单胞菌2-4的发酵液离心、过滤，得到无菌滤液，无菌滤液以体积浓度≤10％的比例加入到藻类培养体系中。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的假单胞菌2-4抑制铜绿微囊藻的条件为藻细胞数目4.50×10⁶个-6.75×10⁶个/mL，菌液接种量10％-15％，pH9-10。

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