CN103937726A - 一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途，菌株的保藏号为CGMCC No9070，为一株新的具有溶藻活性铜绿假单胞菌，本发明发酵液以1:20的比例接入到初始OD₆₈₀为0.3的铜绿微囊藻培养液中在25℃、2000lux和光暗比为14:10的条件下培养3天后叶绿素a的浓度下降了85%以上。该菌的无菌发酵液经热处理和光处理后，溶藻效果无明显变化，表明具有较强的光和热稳定性。以上表明，本发明发酵液在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻方面具有重要的应用价值。

Description

一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途

技术领域

本发明提供一种溶藻铜绿假单胞菌及其用途，为一株新的具有溶藻活性铜绿假单胞菌，同时还公开了及其培养条件和其在水华藻控制中的用途，属于应用环境微生物技术领域。 

背景技术

近年来，随着工农业生产的发展和人们消费水平的提高，含有大量植物营养元素，如氮、磷和钾等的生活污水、工业废水和种养殖排水的产生量逐渐增加。在未经处理或处理不当的情况下，植物营养元素随着污水进入封闭和半封闭水体后，在光照和温度等条件适宜的情况下，会激发水体中的某些藻类，使其迅速增殖。这些藻类的过量生长，不仅会直接改变水生生态系统的组成和结构，而且细菌对其死亡残体进行分解时还会消耗水体中的溶解氧，从而间接改变水体的物理、化学和生物组成，甚至在某些情况下一些藻类还会分泌藻毒素，如铜铝微囊藻等，这些毒素进入水体后会对水体中的其它生物产生影响，甚至会通过食物链的放大作用对其它生物，甚至是人类产生影响。因此科学有效地控制水体中水华藻的生长，维持水生生态系统的平衡具有重要的现实意义。 

目前，治理水华的方法主要有传统的物理方法、发展迅速的化学方法和绿色环保的生物方法。生物抑藻方法主要有水生植物抑藻，水生动物抑藻，其它藻类抑藻和微生物抑藻四个方面。其中，利用高等水生植物通过竞争生存空间和营养元素来抑制水华藻的生长在水华控制中使用的比较普遍，但死亡的植物残体如果不能及时从水体中去除，释放出的营养元素会增加水相中营养元素的含量。在我国北方，尤其是东北地区，由于气温低，适宜植物生长的时间短，因此在一些水体中大量栽植水生植物的现象不如南方普遍，导致利用水生植物控制水华的办法在应用上受到一定程度的限制。 

溶藻微生物是一类可通过直接接触和间接分泌化感物质来影响藻类的生长，控制水体中各种微藻的平衡关系的一类生物，包括细菌，真菌，放线菌和病毒等。研究发现刚毛藻上几声一种粘细菌，在一定条件下粘细菌可使刚毛藻细胞裂解死亡，而具有溶藻效果的细菌、真菌放线菌等则主要是通过产生具有溶藻活性的物质来抑制藻类的生长繁殖。目前已知的微生物胞外溶藻活性物质主要有蛋白质、多肽类物质、含氮化合物、氨基酸、抗生素、生物碱及色素。这些溶藻活性物质能破碎微藻的细胞膜并使其无法复原，导致藻细胞内物质流出，引发藻细胞死亡。能够分泌蛋白质、多肽类物质、含氮化合物的微生物主要有的有弧菌、假交替单胞菌、黄杆菌等。真菌和放线菌是典型的释放抗生素的微生物，如真菌中的青霉菌能释放青霉素；支顶孢真菌能产生头孢菌素。假单胞菌能够分泌生物碱抑制多种蓝藻的生长。这些微生物往往是从富营养化水体中直接分离的土著生物，环境适应性强，且分泌产生的代谢产物在水体环境中可自然降解的次生代谢产物，因此在水华藻控制中具有重要的应用价值。目前在利用溶藻微生物的特殊作用来控制水华藻方面主要还存在一下问题：第一，往往使用价格高昂的原材料来获取具有溶藻效果的发酵液，例如牛肉膏和蛋白胨等；第二，为了让微生物更好地生长，在发酵体系中往往增加了大量的营养盐，如氮磷等，这些营养物质往往会剩余在发酵液中，因此向水体中施用发酵液时会增加水体中营养盐的水平；第三，往往专注于单一溶藻物质的产生，缺乏能使一种微生物产生多种可协同溶藻物质的微生物或发酵条件的研究。因此努力挖掘具有不同地域特征的可产生多种且毒性低的次生代谢产物的溶藻微生物，以及研制可降低溶藻产品中氮磷含量的培养基，具有重要的现实意义。 

发明内容

本发明提供一种溶藻铜绿假单胞菌，为一种新的菌株，具有较强环境适应性和生态安全性。 

本发明还公开了一种溶藻铜绿假单胞菌的制备方法，适用于工业化生产。 

本发明进一步提供了一种溶藻铜绿假单胞菌的用途，用于富营养化水体的水华控制和水体应急除藻。 

本发明公开了一种适用于溶藻铜绿假单胞菌的培养基，专用于溶藻铜绿假单胞菌的培养。 

本发明提供的一种溶藻铜绿假单胞菌，命名为：铜绿假单胞菌JM1（Pseudomonas aeruginosa），该菌株已于2014年4月17日保藏于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCC No 9070。 

本发明提供的一种溶藻铜绿假单胞菌的制备方法，包括以下步骤：

（1）分别采集吉林省和内蒙古共9处水华爆水体的水样各500mL，然后各取100mL制备成混合水样；取100mL混合水样加入等量的稀释50倍后的BG11培养基，在温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养20日；

（2）取黄化现象最明显的培养液1mL，梯度稀释后加入到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在25℃下培养36小时，将菌落特征明显不同且具有数量优势的细菌分别进行3次划线分离纯化；

（3）在100mL NB液体培养基中接种上述步骤2所述的单一菌落，生长至对数期后，8000rpm离心5min，收集菌体，再悬于生理盐水中，最终制备成OD₆₀₀为0.3的菌悬液；将获得的菌悬液按5%的比例接种于100mL  NB培养基中培养24h得培养液；取50mL培养液在8000rpm下离心5min，过0.22μm滤膜，取上清液作为无菌发酵液；剩余的50mL培养液作为含菌发酵液；分别取含菌发酵液和无菌发酵液4mL，加入到16mL处于对数生长期、OD680为0.3的铜绿微囊藻FACHB-928藻液（中国科学院淡水藻种库）中培养，温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养7日，叶绿素a含量最低的培养体系对应的菌株即为铜绿假单胞菌。

本发明所述菌株生产具有溶藻活性物质的方法，其特征在于：

1）黄豆粉浸汁和无机营养盐培养基的制备

在500mL蒸馏水中加入15g黄豆粉，沸水中煮30min，冷却至45℃后，无菌过滤得黄豆粉浸汁；

在1L水中加入0.4g七水硫酸镁、3.2g硫酸钾、0.04g六水氯化铁、硝酸铵1g搅拌均匀，高压蒸汽灭菌得无机盐培养基；

2）将黄豆粉浸汁和无机盐培养基等比例混合，按照5%的比例接种上述铜绿假单胞菌的菌悬液，30℃培养48h，然后8000rpm离心5min，取上清液，即得溶藻活性物质。

经试验证明本发明发酵液中含有脓青素和鼠李糖脂，该发酵液以1:20的比例接入到初始OD₆₈₀为0.3的铜绿微囊藻培养液中在25℃、2000lux和光暗比为14:10的条件下培养3天后叶绿素a的浓度下降了85%以上。该菌的无菌发酵液经热处理和光处理后，溶藻效果无明显变化，表明具有较强的光和热稳定性。以上表明，该菌的发酵液在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻方面具有重要的应用价值。 

本发明的积极效果在于：提供一株新的铜绿假单胞菌，其发酵液中含有脓青素和鼠李糖脂两种主要物质，通过它们的协同作用来增强溶藻效果，用于富营养化水体的水华控制和水体应急除藻治理。 

附图说明

图1. 6株细菌的含菌发酵液的溶藻效果； 

图2. 6株细菌的无菌发酵液的溶藻效果；

图3. 铜绿假单胞菌JM1的菌落特征；

图4. 铜绿假单胞菌JM1的细胞特征；

图5. 铜绿假单胞菌JM1的系统发育分析；

图6. 铜绿假单胞菌JM1无菌发酵液的溶藻特征；

图7. 铜绿假单胞菌JM1无菌发酵液的光热稳定性。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。 

实施例1

1．溶藻菌的筛选和溶藻方式分析

2013年8月份，分别在吉林省的新立城水库、南湖、北湖、净月潭、石头口门水库、聚龙潭、杨木水库、南河和内蒙古的特默河水华爆发段采集水体呈现明显的蓝绿色的水样500mL，实验室分析表明其叶绿素含量在20-80 10μg/mL。将上述水样各取100mL混在一起制备成混合水样；取100mL混合水样加入到等量的稀释50倍后的BG11培养基，在温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养20日；取黄化现象最明显的培养液1mL，梯度稀释后加入到牛肉膏蛋白胨固体培养基中在25℃下培养24小时，将6种菌落特征明显不同且具有数量优势的细菌分别进行3次划线分离纯化，分别命名为JM1、JM2、JM3、JM4、JM5和JM6。

分别在100mL NB液体培养基中接种上述6株细菌，生长至对数期后，8000rpm离心5min，收集菌体，再悬于无菌水中，最终制备成OD₆₀₀为0.3的菌悬液；将获得的菌悬液按5%的比例重新接种于100mL  NB培养基中培养24h得培养液；取50mL培养液在8000rpm下离心5min，过0.22μm滤膜，取上清液作为无菌发酵液；剩余的50mL培养液作为含菌发酵液；分别取含菌发酵液和无菌发酵液4mL，加入到16mL处于对数生长期、OD₆₈₀为0.3的铜绿微囊藻FACHB-928藻液（中国科学院淡水藻种库）中培养，温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养7日后，测定叶绿素a的含量。叶绿素a的测定方法：将20mL藻液在8000rpm下离心10min，倒去上清液，用5mL90%丙酮将底部沉淀溶出至50mL锥形瓶中，用透气封口膜加盖两层报纸封口，置于4℃冰箱中保存，24h后取出离心获得上清液，以丙酮为参比溶液，用分光光度计测定上清液在630nm、645nm、665nm波长处的吸光度(A)，根据公式C=11.6×A₆₆₅－1.31×A₆₄₅－0.14×A₆₃₀计算藻液中叶绿素a(Chla)含量，单位:μg/mL。每种处理重复三次，结果取平均值。图1表明其中菌株JM1的含菌发酵液的溶藻效果最好，溶藻效果最好；图2表明菌株JM1的无菌发酵液也具有较强的溶藻效果，并且在有菌存在的条件下，菌株JM1的溶藻效果最好。因此菌株JM1可产生活性溶藻物质，且可通过直接和间接两种方式溶藻。 

2.菌株JM的鉴定和保藏 

从菌落特征、细胞形态、革兰氏染色征和16S rRNA基因序列分析等多个角度对菌株JM1进行了鉴定。图3表明在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长24小时后，可见扁平、湿润的菌落，菌落随着培养时间的增长，颜色逐渐变化为深青色，并能分泌一种特殊气味。图4表明菌体细胞呈短杆状，不产芽孢，革兰氏阴性。图5表明，菌株JM1的16S rRNA基因序列分析与铜绿假单胞菌有99%的同源性，故该菌被鉴定为铜绿假单胞菌，命名为铜绿假单胞菌JM1。

铜绿假单胞菌JM1于2014年4月 17日保藏于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No 9070。 

3. 铜绿假单胞菌JM1培养基的配制和发酵产物的获得 

在500mL蒸馏水中加入15g黄豆粉，沸水中煮30min，冷却至45℃后，无菌过滤得黄豆粉浸汁；

在1L蒸馏水中加入0.4g七水硫酸镁、3.2g硫酸钾、0.04g六水氯化铁、硝酸铵1g搅拌均匀，高压蒸汽灭菌得无机盐培养基；

将黄豆粉浸汁和无机盐培养基等比例混合，按照5%的比例接种铜绿假单胞菌JM1的菌悬液，30℃培养48h，然后8000rpm离心5min，取上清液，即得溶藻活性物质。

4.菌株溶藻效果分析 

取具体步骤3获得的无菌发酵液1mL，加入到盛有19mL处于对数生长期，OD₆₈₀为0.3的铜绿微囊藻928培养液的50mL三角瓶中，利用无菌滤膜封口后，在25±0.5℃，光暗比=14:10，光照强度2000lux下培养3天，按照具体步骤1中的方法测定叶绿素a的含量，通过和培养基对照比较，分析溶藻效果。每种处理重复三次，结果表示为平均值，如图6所示。结果表明，菌株JM1的无菌发酵液能够明显抑制铜绿微囊藻928的生长，培养至第三天时叶绿素a的含量下降了85%，而培养基对照中的微藻则一直在生长，因此表明铜绿假单胞菌JM1的无菌发酵液在控制水华藻爆发方面具有重要的应用价值。

5. 菌株JM1产脓青素和鼠李糖脂含量的分析 

将具体步骤3获得的10mL无菌发酵液加入到带有刻度的试管中，利用1N盐酸将pH值调节为2，然后在8000rpm下离心5min，去掉上清液，将沉淀再溶于10mL蒸馏水中，稀释60倍后采用蒽酮-浓硫酸法测定鼠李糖脂的含量。取5mL无菌发酵液加入到比色管中，然后加入3mL氯仿，充分震荡后静置5min；将比色管中液体在8000rpm下离10min，用移液枪吸去上层液体，在下层氯仿中加入3mL 0.2N的HCl，充分震荡，混合均匀后静置5min；将混合液体在8000rpm下离心5min，用移液枪吸取上层无机相，并测定该无机相的在520nm处的吸光度值，用该值乘以17.072即为脓青素的含量。结果表明，发酵液中的鼠李糖脂含量为68.45mg/L，脓青素的含量为4.32 mg/mL，而黄豆粉无机盐培养基对照组中鼠李糖脂含量为10.45mg/L，脓青素的含量为0.32 mg/mL，结果表明利用黄豆粉无机盐培养基培养铜绿假单胞菌JM1后可获得两种含量较高的次级代谢产物。

6.菌株JM1发酵液的光热稳定性分析 

具体步骤3获得的无菌发酵液240mL，平均加入到12个50mL的三角瓶中，加入无菌滤膜封口后，其中3个瓶用黑色塑料袋盖住后放置 15天，3个瓶在121℃下热处理20min，3个于2000lux光照条件下放置15天，剩下的3个瓶子不做任何处理。各处理完成后，分别按照具体步骤4的方法做溶藻实验，同时做无菌水的对照实验，结果如图7所示。表明，经过高温高压和光照处理后，发酵液的溶藻能力没有受到明显的影响，说明溶藻物质的热和光稳定性强，在溶藻产品的制备和使用过程中不易受到影响。

Claims (4)

1.一株溶藻铜绿假单胞菌，命名为铜绿假单胞菌JM1（Pseudomonas aeruginosa），该菌株已于2014年4月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No 9070。

2. 获得权利要求1所述溶藻铜绿假单胞菌的方法，包括以下步骤完成：

（1）分别采集吉林省和内蒙古共9处水华爆水体的水样各500mL，然后各取100mL制备成混合水样；取100mL混合水样加入等量的稀释50倍后的BG11培养基，在温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养20日；

（2）取黄化现象最明显的培养液1mL，梯度稀释后加入到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在25℃下培养24小时，将菌落特征明显不同且具有数量优势的细菌分别进行3次划线分离纯化；

（3）在100mL NB液体培养基中接种步骤2获得的单一菌落，生长至对数期后，8000rpm离心5min，收集菌体，再悬于无菌水中，最终制备成OD₆₀₀为0.3的菌悬液；将获得的菌悬液按5%的比例接种于100mL  NB培养基中培养24h得培养液；取50mL培养液在8000rpm下离心5min，过0.22μm滤膜，取上清液作为无菌发酵液；剩余的50mL培养液作为含菌发酵液；分别取含菌发酵液和无菌发酵液4mL，加入到16mL处于对数生长期、OD₆₈₀为0.3的铜绿微囊藻FACHB-928藻液（中国科学院淡水藻种库）中培养，温度25±0.5℃，光暗比为14:10，光照强度2000lux，每日震荡3-5次的条件下培养7日，叶绿素a含量最低的培养体系对应的菌株为权利要求1所述的铜绿假单胞菌。

3. 利用权利要求1所述菌株生产具有溶藻活性物质的方法，其特征在于：

1）黄豆粉浸汁和无机营养盐培养基的制备

在500mL蒸馏水中加入15g黄豆粉，沸水中煮30min，冷却至45℃后，无菌过滤得黄豆粉浸汁；

在1L水中加入0.4g七水硫酸镁、3.2g硫酸钾、0.04g六水氯化铁、硝酸铵1g搅拌均匀，121℃高压蒸汽灭菌30min，得无机盐培养基；

2）将黄豆粉浸汁和无机盐培养基等比例混合，按照5%的比例接种权利要求1所述铜绿假单胞菌的菌悬液，30℃培养48h，然后8000rpm离心5min，取上清液，即得溶藻活性物质。

4. 权利要求1所述的溶藻铜绿假单胞菌在富营养化水体的水华控制和水体应急除藻中的用途。