CN103352011B - 一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株czrst19及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株溶解池塘颤藻的单胞菌菌株CZRST19为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenortrophomonas maltophilia），保藏名称为嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013129。本发明中的嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19菌株对养殖水体中多种优势颤藻均具有明显的溶解和消除作用；还公开了上述溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19在溶解池塘颤藻中的应用。

Description

一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19及其应用

技术领域

本发明属于采用微生物控制微藻技术领域，具体涉及一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19及其应用。

背景技术

微藻对于维持水体生态系统的正常功能，促进环境氮、磷营养的吸收与转化，稳定水环境是不可或缺的(李卓佳,2005，王朝晖等，1999)。就生产性能而言，以蓝藻为优势的池塘，水质易恶化，对虾生长缓慢且容易引发病害(彭聪聪，2010，刘孝竹等，2011)；以绿藻为优势的池塘，水质稳定，虾病较少，对虾生长良好，水体生态系相对稳定(黄翔鹄等，2002，查广才等，2004，申玉春等，2004)；以硅藻为优势的池塘，对虾生长速度快，虾病少，但硅藻优势群落难长时间维持，容易因气候变化而变动，引起对虾产生应激发应。蓝藻在富营养的水环境中更具有竞争优势，对其它藻类产生抑制(刘孝竹等,2011)，故而在以蓝藻为优势的池塘中硅藻、绿藻、隐藻等不易形成优势。所以，在生产中抑制蓝藻优势，构建和维护以绿藻或硅藻为优势的微藻藻相，这对保证养殖效益，实现环境友好型的健康养殖具有重要意义。

在华南对虾主产区的三种典型养殖池塘中，颤藻和蛋白核小球藻优势度较高。在养殖中后期高位池的微藻平均数量为4.01×10⁹cells/L，生物量779.28mg/L，蛋白核小球藻优势度平均近70%，为强优势种。滩涂海水池塘的微藻平均数量为3.16×10⁸cells/L，生物量12.81mg/L，蛋白核小球藻占微藻总数量的23.12%，占总生物量的34.65%，颤藻优势明显，其数量可占总数量的50.4%。河口区淡化池塘的微藻平均数量2.1×10⁹cells/L，生物量502.9mg/L，其中绿色颤藻优势度大，养殖14天时绿色颤藻即可占微藻总数量的41.6%。可见，如何有效地针对优势微藻进行控制，是调控养殖水体微藻藻相的重点，压制颤藻等蓝藻的生态优势，是藻相优化的关键环节。

有学者对对虾养殖池塘微藻藻相调控技术进行探索(Corre,2005;Cremen,2007;Yusoff,2002)，并就相关的微藻生理特性及藻类间的竞争特点进行分析(Kuwata,2000；Klausmeier,2004;Smith,1983;Piazzi,2002;Litchman,2003)，但其中大多忽略了“环境营养—微生物—微藻”三者间的相互联系，这与池塘的实际环境存在较大差别，在产业应用层面也受到了一定的限制。有学者对溶藻菌也进行了相当的研究，主要集中于针对湖泊的蓝藻水华(李先宁等,2007)、海湾赤潮(Mayali,2004;Mayali,2007;Rooney,2005)及相关有害藻的特性与治理等(曹宾霞等，2008；谢志浩等，2008)。近年来，报道的溶藻细菌主要有：黄杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、噬胞菌属、交替假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、腐生螺旋体属、屈挠细菌属、纤维弧菌属及蛭弧菌属等。Geitler报道粘细菌可寄生在刚毛藻上使之死亡，Shilo等用几株从河水中分离的粘细菌可溶解8种蓝藻，Daft从废水中分离9种黏细菌，可溶解束丝藻（Aphanizomenon）、微囊藻、鱼腥藻、颤藻。假单胞菌属也是一种常见的溶藻细菌，Dakhama报道铜绿假单胞菌产生一种低分子质量的抗生素，可强烈溶解某些蓝藻和绿藻。溶藻细菌的控藻径主要包括：直接接触溶藻、分泌溶藻物质溶藻、细菌与微藻竞争营养物质、形成菌胶膜、进入藻细胞杀藻。直接接触溶藻是指溶藻细菌主动攻击接触微藻后，侵入并破坏其细胞结构从而杀灭微藻。粘细菌与CFB菌群的细菌大多通过直接方式溶藻。细菌还可通过释放特异性或非特异性的胞外物质溶藻。这类细菌有芽孢杆菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等。此外，细菌还可通过与竞争营养、菌胶膜等方式抑制微藻生长。

本发明中的池塘环境与上述水域环境间的差别巨大，需控制的目标微藻种类、水体营养、人工技术措施等均不具可比性。且目前尚未对嗜麦芽寡养单胞菌菌株是否能溶解池塘颤藻进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19，该菌株具有较高的溶解池塘颤藻的能力，且专一性好。

本发明的目的还在于提供上述一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19在溶解池塘颤藻中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一株溶解池塘颤藻的单胞菌菌株CZRST19为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenortrophomonas maltophilia），保藏名称为嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013129。

本发明中的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19的筛选分离鉴定过程为：对养殖池塘优势蓝藻进行富集培养，分析蓝藻藻际微生物群落，分离获得生长性能好的菌株；将纯化培养的菌株放入不同种类颤藻的培养系统中，确定该菌株对不同种类颤藻的溶藻效果，优选溶藻性能良好的菌株；明确其对池塘优良微藻——蛋白核小球藻、四尾栅藻、条斑小环藻、新月菱形藻的影响，获得仅对颤藻有溶藻效果的菌株。确定该菌株的生态特性，并提出以该菌防控池塘颤藻优势的应用方法。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19在溶解池塘颤藻中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明中的嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19菌株对养殖水体中多种优势颤藻均具有明显的溶解和消除作用；

（2）本发明在池塘优势蓝藻（水华微囊藻、铜绿微囊藻、浮游颤藻、小颤藻）的纯培养体系中筛选的藻际溶藻细菌CZRST19，溶藻专一性好，仅对优势颤藻有较好的溶解效果，对优良绿藻和硅藻——蛋白核小球藻、四尾栅藻、条斑小环藻、新月菱形藻没有溶解杀灭作用；

（3）本发明中的嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19菌株生态效益显著，使用微生物固定化方法可有效防控蓝藻优势，避免通过使用硫酸铜、有机磷等化学物质杀灭蓝藻，从而防止了因过量使用化学杀藻剂，令有害物质残留水体环境中，对养殖生物产品质量安全和水域生态造成不良影响；

（4）可利用本发明中的溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19，以其溶解抑制池塘中的有害颤藻，调控水体微藻藻相，这有利于为微藻藻相稳定调控与菌藻平衡净化生态环境提供优化技术储备；

（5）本发明利用菌—藻生态效应，进行池塘微藻藻相控制是科学的有效途径之一。可从池塘环境生态操纵角度，将控制池塘有害优势蓝藻作为核心目标，根据海水养殖池塘优势蓝藻的组成情况，从优势有害蓝藻体系中筛选出藻际溶藻菌，通过溶解抑制藻细胞，防控蓝藻优势。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19的筛选方法：

一、材料准备

1、菌源

取自茂名电白养殖场；

2、培养基

（1）微藻BG11液体培养基；

（2）灭菌池塘水添加NH₄Cl1.0～1.5g/L和Na₂HPO₄ 30～40mg/L。

二、菌株的分离与筛选

在茂名电白某养殖场，对池塘的优势蓝藻—水华微囊藻、铜绿微囊藻、浮游颤藻、小颤藻进行纯培养。分别以两种培养液培养，一为BG11液体培养基，另一种为灭菌池塘水添加NH₄Cl1.0～1.5g/L和Na₂HPO₄ 30～40mg/L而成。温度25～28℃、光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h，培养5～7天。将藻液梯度稀释，进行平板涂布，30℃培养24小时，挑取颜色、形态不同的菌落获得单个纯菌落。

菌株纯培养后按10⁶cfu/mL的浓度分别接种不同的颤藻藻液中(藻细胞密度为10⁶cell/mL)，培养10天，监测颤藻生长情况。把令藻液在第2～4天内变为黄色的认定为有强烈溶藻作用，5～10天内变为黄色的为溶藻效果，藻液始终呈绿色的为无溶藻作用。对可产生强烈溶藻作用和有溶藻效果的菌株进行鉴定，从小颤藻藻际环境中获得嗜麦芽寡养单胞菌(Stenortrophomonas maltophilia)CZRST19菌株。该菌株可在3天内使小颤藻完全死亡，6天内绿色颤藻完全死亡。

CZRST19菌株的指数增长期为4～20h，菌浓度可从2.67×10⁶cfu/mL生长达到1.16×10¹⁰cfu/mL，20～24小时进入稳定期并逐渐开始衰减，菌量保持在9×10⁹cfu/mL左右。确定该菌在盐度0～40、pH7.0～9.5、温度15～38℃均可生长，可适应大部分池塘的条件。

实施例2溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19的鉴定

本发明对具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZRST19进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

细菌基因组DNA的提取：

1.用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜；

2.取细菌培养液1.5mL，10000rpm(11,500×g)离心1分钟，尽量吸净上清；

3.向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入180μL终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理30分钟以上；

4.向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

5.加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

6.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

7.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

8.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

9.向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；

10.向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

11.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

12.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中；

13.DNA浓度及纯度检测回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

16S rDNA基因的PCR扩增

16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由上海生工生物工程有限公司合成，正向引物（8f）为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物（1492r）为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μL PCR反应体系包括：灭菌双蒸水37μL，引物各1μL，dNTPs(2.5mmol/L)，Tap酶1μL，10×PCR buffer5uL，DNA模板1μL。PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，48℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。

2、16S rDNA序列测定

扩增结束，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测得其序列：

TTTTTCGTGG GGGATAACGT AGGGAAACTT ACGCTAATAC CGCATACGAC 50

CTACGGGTGA AAGCAGGGGA TCTTCGGACC TTGCGCGATT GAATGAGCCG 50

ATGTCGGATT AGCTAGTTGG CGGGGTAAAG GCCCACCAAG GCGACGATCC 50

GTAGCTGGTC TGAGAGGATG ATCAGCCACA CTGGAACTGA GACACGGTCC 50

AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT ATTGGACAAT GGGCGCAAGC 50

CTGATCCAGC CATACCGCGT GGGTGAAGAA GGCCTTCGGG TTGTAAAGCC 50

CTTTTGTTGG GAAAGAAATC CAGCTGGCTA ATACCCGGTT GGGATGACGG 50

TACCCAAAGA ATAAGCACCG GCTAACTTCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA 50

CGAAGGGTGC AAGCGTTACT CGGAATTACT GGGCGTAAAG CGTGCGTAGG 50

TGGTCGTTTA AGTCCGTTGT GAAAGCCCTG GGCTCAACCT GGGAACTGCA 50

GTGGATACTG GGCGACTAGA ATGTGGTAGA GGGTAGCGGA ATTCCTGGTG 50

TAGCAGTGAA ATGCGTAGAG ATCAGGAGGA ACATCCATGG CGAAGGCAGC 50

TACCTGGACC AACATTGACA CTGAGGCACG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG 50

GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCCTA AACGATGCGA ACTGGATGTT 50

GGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCC 50

TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CTGAAACTCA AAGGAATTGA CGGGGGCCCG 50

CACAAGCGGT GGAGTATGTG GTTTAATTCG ATGCAACGCG AAGAACCTTA 50

CCTGGCCTTG ACATGTCGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG GTGCCTTCGG 50

GAACTCGAAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT 50

GTTGGGTTAA GTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTTA GTTGCCAGCA 50

CGTAATGGTG GGAACTCTAA GGAGACCGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG 50

TGGGGATGAC GTCAAGTCAT CATGGCCCTT ACGGCCAGGG CTACACACGT 50

ACTACAATGG TAGGGACAGA GGGCTGCAAG CCGGCGACGG TAAGCCAATC 50

CCAGAAACCC TATCTCAGTC CGGATTGGAG TCTGCAACTC GACTCCATGA 50

AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCAGATCAGC ATTGCTGCGG TGAATACGTT 50

3、具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZRST19菌落形态、生理和生化特征

藻际溶藻菌株CZRST19菌落形态、生理特征见下表1。

表1藻际溶藻菌株CZRST19菌落形态、生理特征

4、具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZRST19的鉴定

将溶藻菌株CZRST19长度为1250bp的16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，溶藻菌株CZRST19确定为嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。查阅有关资料，尚无嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）对虾池颤藻具有溶藻作用的研究报道。嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）CZRST19为新的菌株，已于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号：CCTCCM2013129,保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。

本发明分离、筛选的嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19，对绿色颤藻、小颤藻、浮游颤藻具有较好的溶藻效果，对小球藻或栅藻无溶解作用，拓宽了人们对单胞菌（Stenotrophomonas sp.）在其功能方面的应用研究思路，为应用溶藻细菌于养殖池塘提供了理论依据。

实施例3溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19的实验室小规模应用

将CZRST19菌株在30℃200r/min培养20小时，分别加入优良微藻——蛋白核小球藻、四尾栅藻、条斑小环藻、新月菱形藻的纯培养藻液中，其中菌浓度都为10⁷cfu/mL，各藻液的起细胞密度分别为1.6×10⁶cell/mL、6.0×10⁵cell/mL、2.3×10⁵cell/mL、5.3×10⁵cell/mL。菌藻混合液在28℃、2000lx、光暗周期12h：12h下培养8天。结果四种藻的细胞数分别为8.05×10⁶cell/mL、2.95×10⁶cell/mL、3.75×10⁶cell/mL、3.68×10⁶cell/mL。可见CZRST19仅对特定的颤藻产生溶解效应，对上述四种微藻没有溶解杀灭作用，但与未放菌的对照组相比，四种藻的生长则受到一定的抑制。因此CZRST19不仅可用以控制颤藻的生态优势，还可将用于防控因绿藻和硅藻的过量生长而形成的绿藻或硅藻水华。

将CZRST19（菌藻体系中菌浓度为10⁷cfu/mL）分别加入颤藻与蛋白核小球藻、四尾栅藻、条斑小环藻、新月菱形藻的混合藻液中，共培养10天，具体如表1所示。结果显示在不同的微藻组合中该菌株对颤藻的抑制作用明显，溶藻效果良好，只是在颤藻的溶解时间上存在一定的差异。CZRST19对蛋白核小球藻、四尾栅藻、条斑小环藻、新月菱形藻的生长有一定的抑制，但无溶藻和杀灭的作用。这表明CZRST19菌株可影响水体中的微藻群落结构，在不影响有益绿藻和硅藻生长的情况下压制颤藻形成优势。

表1CZRST19菌株对混合藻液中颤藻、绿藻和硅藻的影响

实施例4溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19的大规模应用

将CZRST19菌株在茂名电白养殖场进行应用。选择养殖了55～84天的对虾养殖池塘水体进行处理。将CZRST19菌株置于简易型的充气发酵桶中发酵20～48小时，菌液浓度达到10⁹～10¹⁰cfu/mL，发酵前把30平方米的消毒筛绢网布（孔径0.25毫米）一同放入发酵桶。选择池塘下风处蓝藻密集区，把网布固定平铺于距水面5～10厘米处，使用后10天内不使用消毒剂，第5天时按菌浓度10³cfu/mL在网布区域内泼洒CZRST19菌液。

在使用前蛋白核小球藻的数量为1.9×10⁵cell/L～9.3×10⁵cell/L，占微藻总量的百分比为1.34%～7.78%；颤藻数量为1.8×10⁶cell/L～5.9×10⁷cell/L，占微藻总量的百分比为74.8%～86.9%。8天后蛋白核小球藻数量为1.5×10⁶cell/L，百分比21.8%；颤藻数量为4.8×10⁶cell/L，百分比降为69.26%。15天时蛋白核小球藻数量为3.1×10⁶cell/L，百分比21.7%；颤藻数量为4.5×10⁶cell/L，百分比降为31.8%；而新月菱形藻的数量升高到3.7×10⁶cell/L，百分比26.2%。

可见，嗜麦芽寡养单胞菌CZRST19菌株可有效去除养殖水体中的优势颤藻，压制其生态优势，从而达到优化浮游微藻藻相的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19，其特征是：该菌株为嗜麦芽寡养单胞菌属（Stenortrophomonas maltophilia），保藏名称为嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013129，该菌株具有溶解池塘颤藻的能力。

2.权利要求1所述的一株溶解池塘颤藻的嗜麦芽寡养单胞菌菌株CZRST19在溶解池塘颤藻中的应用。