CN103352010B

CN103352010B - 一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株czbc1及其应用

Info

Publication number: CN103352010B
Application number: CN201310203745.3A
Authority: CN
Inventors: 曹煜成; 王丽花; 文国樑; 李卓佳; 胡晓娟
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: CN103352010A

Abstract

本发明公开了一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏名称为蜡样芽孢杆菌CZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013130。本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1对养殖水体中多种优势颤藻均具有明显的溶解和消除作用；还公开了上述溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在溶解池塘颤藻中的应用。

Description

一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1及其应用

技术领域

本发明属于采用微生物控制微藻技术领域，具体涉及一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1及其应用。

背景技术

微藻对水环境中的物质循环和能量流动具有举足轻重的作用，它对于维持水体生态系统的正常功能，促进环境氮、磷营养的吸收与转化，稳定水环境是不可或缺的(李卓佳,2005;王朝晖,1999)，况琪军等(2001)利用藻类净化水质取得了良好的效果。在对虾养殖池中一般有2～3个微藻的优势种，优势种越少其优势度也越高，有研究显示，养殖初期一般以绿藻、硅藻为主，随养殖时间增加微藻的种类和生物量也随之增多，但到后期水体富营养化严重，优势种即变为蓝藻等少数几个种类，其优势度远高于其它种类的微藻(刘孝竹,2009;彭聪聪,2010)。就生产性能而言，以绿藻为优势的池塘最好，水质稳定，病害较少，对虾生长良好，水体生态系统相对稳定(黄翔鹄,2002;查广才,2004;申玉春,2004)；以硅藻为优势的池塘，对虾生长速度快，虾病少，但藻相难以长时间维持，容易因气候变化而变动，诱发对虾产生应激发应；以蓝藻为优势的水体，水质恶化，对虾生长缓慢且容易引发病害(彭聪聪,2010;刘孝竹,2011)。因此，在生产中应抑制蓝藻形成优势，构建和维护以绿藻或硅藻为优势的微藻藻相。

在华南对虾主产区的三种典型养殖池塘中，颤藻和蛋白核小球藻优势度较高。其中，在高位池养殖中后期微藻平均数量为4.01×10⁹cells/L，生物量779.28mg/L，蛋白核小球藻优势度平均近70%，为主要强优势种；在滩涂土池养殖中后期微藻平均数量为3.16×10⁸cells/L，生物量12.81mg/L，蛋白核小球藻的数量优势度23.12%，生物量优势度34.65%，颤藻数量优势度50.4%；在河口区淡化养殖池塘的养殖中后期微藻平均数量2.1×10⁹cells/L，生物量502.9mg/L，在方面第14天颤藻的数量优势度即可达到41.6%。可见，如何有效地针对优势微藻进行控制，是调控养殖水体微藻藻相的重点，对颤藻等优势蓝藻进行控制，则是其中的关键环节。通常以蓝藻为优势的池塘环境中硅藻、绿藻、隐藻不易形成优势种，因为蓝藻在富营养化的水环境中更具竞争优势，对其它藻类产生抑制(刘孝竹,2011)。有学者对养殖池塘微藻藻相调控技术进行过探索(Corre,2005;Cremen,2007;Yusoff,2002)，并就相关的微藻生理特性及藻类间的竞争特点进行了分析(Kuwata,2000；Klausmeier,2004;Smith,1983;Piazzi,2002;Litchman,2003)，但往往忽略了“环境营养—微生物—微藻”三者间的相互联系，这是与池塘环境实际存在较大差别的，因此，在产业技术应用发展方面受到了一定的限制。虽然有学者对溶藻菌进行了一些研究，主要集中在针对湖泊的蓝藻水华(李先宁,2007)、海湾赤潮(Mayali,2004;Mayali,2007;Rooney,2005)及相关有害藻特性与治理等方面(曹宾霞,2008;谢志浩,2008)。近年来，报道的溶藻细菌主要有：黄杆菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、噬胞菌属、交替假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、腐生螺旋体属、屈挠细菌属、纤维弧菌属及蛭弧菌属等。Geitler报道了一粘细菌可寄生在刚毛藻上使之死亡。Shilo等从河水中分离的粘细菌能溶解8种供试蓝藻。Daft从废水中分离出9种黏细菌，可溶解束丝藻（Aphanizomenon）、微囊藻、鱼腥藻以及多种颤藻。Dakhama报道铜绿假单胞菌产生一种低分子质量的抗生素类物质，可以强烈溶解某些蓝藻和绿藻。

溶藻细菌抑制微藻的生长主要通过以下方式：直接接触溶藻、分泌溶藻物质、与微藻竞争营养物质、形成菌胶膜、进入藻细胞杀藻。直接接触溶藻是指溶藻细菌主动攻击接触微藻(藻细胞)后，侵入并破坏其细胞结构从而杀灭微藻。粘细菌与CFB菌群的细菌大多通过直接方式溶藻，如Imai报道噬胞菌(J18／M01)的培养物对硅藻有强烈的溶解作用，而无菌滤液则不起任何作用。KANG等发现一株恶臭假单胞菌通过直接溶藻方式杀死冠盘藻。其二，是通过释放特异性或非特异性的胞外活性物质溶藻。这类细菌有芽孢杆菌、假单胞菌、黄杆菌、交替单胞菌、假交替单胞菌等，目前已分离和鉴定的活性物质主要有蛋白质、多肽、氨基酸、抗生素、含氮化合物、生物碱、色素。Lee等报道海洋细菌假交替单胞菌A28分泌丝氨酸蛋白酶其上清液能杀灭骨条藻。Jeong等从一株可强烈杀灭多环旋沟藻的芽孢杆菌SY-1中分离得到一种溶藻物质Bacillamide，可抑制多环旋沟藻水华。Yoshikawa等报道溶藻细菌C-979(Vibrio sp.)可产生β-氰基-L-丙氨酸(L-CNAla)，它对一些蓝藻有明显抑制作用。Kawamo从菌株PK654分离出抗生素Thiotropicin，可抑制中肋骨条藻及赤潮异弯藻。Volk等从Nodularia harveyana和Nostoc insulare分离出吲哚类生物碱，可溶解螺旋藻。Jeong等发现Hahellachejuensis细菌可合成一种具有由3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的灵菌红素，它具有强烈的细胞溶解酶活性，能杀死引起赤潮的微藻。Nokuyubi等发现芽孢杆菌N-14可分泌一种非蛋白类物质对微囊藻具有溶藻效应。此外，细菌还可通过与微藻竞争营养、形成菌胶膜等方式抑制微藻生长。

本发明养殖池塘环境与上述水体环境存在巨大差异，需控制的目标微藻种类、水体营养、人工技术措施等均不具可比性。目前尚未对蜡样芽孢杆菌菌株是否能溶解池塘颤藻进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1，该菌株具有较高的溶解池塘颤藻的能力，且专一性好。

本发明的目的还在于提供上述一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在溶解池塘颤藻中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一株溶解池塘颤藻的芽孢杆菌菌株CZBC1，该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏名称为蜡样芽孢杆菌CZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013130。

本发明中的芽孢杆菌菌株CZBC1的筛选分离鉴定过程为：选择池塘绿色颤藻进行纯培养，分析其藻际微生物群落，分离纯化获得生长性能好的菌株；菌株纯培养后放入3种池塘优势颤藻的培养体系中，评价该溶藻细菌对不同颤藻的溶藻效果；同时分析其对其他优良微藻——蛋白核小球藻、新月菱形藻的影响，获得仅对颤藻有溶藻效果的菌株，并确定该菌株溶解颤藻的最佳用量和应用条件。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在溶解池塘颤藻中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1溶菌效果明显，本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1可对养殖水体中优势的有害颤藻具有明显的溶解和消除作用；

（2）本发明中的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1专一性好，仅对优势颤藻有较好的溶解效果，但对绿藻和硅藻——蛋白核小球藻、新月菱形藻没有不良影响；

（3）本发明中蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1应用于池塘溶藻可取得较好的生态效益，用以防控蓝藻优势可取得良好的效果，避免使用硫酸铜、有机磷等化学物质杀灭蓝藻，防止了因过量使用化学杀藻剂，令有害物质残留水体环境中，对养殖生物产品质量安全和水域生态造成不良影响。

（4）本发明中的虾池溶解颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1，利用其溶解抑制池塘中的有害颤藻，以达到调控水体浮游微藻藻相结构，抑制颤藻形成优势的目的，这有利于对浮游微藻藻相稳定调控与菌藻平衡净化生态环境提供优化技术储备。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1的筛选方法

一、材料准备

1、菌源

取自汕尾红海湾某对虾养殖场；

2、培养基

（1）微藻BG11液体培养基；

（2）灭菌池塘水添加NH₄Cl1.0～1.5g/L和Na₂HPO₄30～40mg/L；

（3）微生物营养肉汤培养基

二、菌株的分离与筛选

在茂名电白某养殖场，分离获得池塘水体中的优势颤藻——绿色颤藻，纯化培养，培养液可为两种，一种为BG11液体培养基，另一种为池塘水灭菌后添加NaNO₃1.0～1.5g/L和K₂HPO₄30～40mg/L而成；同时把以颤藻为优势(颤藻数量占微藻总量的95%以上)的池塘水进行培养，在培养过程中不添加任何营养物质。保证筛选菌株的多种来源。三种培养系统的基本条件相同，温度25～28℃、光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h，培养5～7天。将藻液（原始密度为10¹⁰cell/ml）梯度稀释，平板涂布，30℃培养48小时，挑取具有不同颜色、形态的菌落。把单菌落分别接种于100毫升营养肉汤细菌培养液，于30℃200r/min摇床培养16小时。然后将不同的菌液分别添加到处于对数生长期的绿色颤藻、小颤藻、浮游颤藻藻液中培养10天，各种颤藻的初始藻细胞密度为5.0×10⁶cell/ml，菌浓度10⁷cfu/ml。显微镜检测颤藻细胞生长情况，筛出可抑制颤藻生长，使藻细胞破碎的高效菌株CZBC1，它在第2天时完全溶解小颤藻，第5天时可完全溶解绿色颤藻。经分子生物学方法和生化方法鉴定菌株CZBC1为蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1。

实施例2溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1的鉴定

本发明对具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZBC1进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

细菌基因组DNA的提取：

1.用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜。

2.取细菌培养液1.5mL，10000rpm(11,500×g)离心1分钟，尽量吸净上清。

3.向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入180μL终浓度为20mg/mL的溶菌酶，37℃处理30分钟以上。

4.向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

5.加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

7.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9.向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

10.向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

11.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

12.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

13.DNA浓度及纯度检测

回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

16S rDNA基因的PCR扩增

16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由上海生工生物工程有限公司合成，正向引物（8f）为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物（1492r）为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μL PCR反应体系包括：灭菌双蒸水37μL，引物各1μL，dNTPs(2.5mmol/L)，Tap酶1μL，10×PCR buffer5uL，DNA模板1μL。PCR反应条件：95℃3min，95℃1min，48℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。

2、16S rDNA序列测定

扩增结束，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，送上海美吉生物医药科技有限公司测序。测得其序列：

TGAGTAACAC GTGGGTAACC TGCCCATAAG ACTGGGATAA CTCCGGGAAA50

CCGGGGCTAA TACCGGATAA CATTTTGAAC CGCATGGTTC GAAATTGAAA50

GGCGGCTTCG GCTGTCACTT ATGGATGGAC CCGCGTCGCA TTAGCTAGTT50

GGTGAGGTAA CGGCTCACCA AGGCAACGAT GCGTAGCCGA CCTGAGAGGG50

TGATCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA50

GCAGTAGGGA ATCTTCCGCA ATGGACGAAA GTCTGACGGA GCAACGCCGC50

GTGAGTGATG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAA CTCTGTTGTT AGGGAAGAAC50

AAGTGCTAGT TGAATAAGCT GGCACCTTGA CGGTACCTAA CCAGAAAGCC50

ACGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGT GGCAAGCGTT50

ATCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGCGCGCGC AGGTGGTTTC TTAAGTCTGA50

TGTGAAAGCC CACGGCTCAA CCGTGGAGGG TCATTGGAAA CTGGGAGACT50

TGAGTGCAGA AGAGGAAAGT GGAATTCCAT GTGTAGCGGT GAAATGCGTA50

GAGATATGGA GGAACACCAG TGGCGAAGGC GACTTTCTGG TCTGTAACTG50

ACACTGAGGC GCGAAAGCGT GGGGAGCAAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA50

GTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAAGTG TTAGAGGGTT TCCGCCCTTT50

AGTGCTGAAG TTAACGCATT AAGCACTCGG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA50

3、具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZBC1菌落形态、生理特征

藻际溶藻菌株CZBC1菌落形态、生理特征见下表1。

表1藻际溶藻菌株CZBC1菌落形态、生理特征

4、具有溶解颤藻作用的藻际溶藻菌株CZBC1的鉴定

将溶藻菌株CZBC1长度为800bp的16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析，溶藻菌株CZBC1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。查阅有关资料，尚无蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）对虾池颤藻具有溶藻作用的研究报道。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）CZBC1为新的菌株，已于2013年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏号：CCTCCM2013130，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心。

本发明分离、筛选的藻际溶藻菌株CZBC1，对绿色颤藻、小颤藻、浮游颤藻具有较好的溶藻效果。拓宽了人们对芽孢杆菌属（Bacillus sp.）在其功能方面的应用研究思路，为应用溶藻细菌于养殖池塘提供了理论依据。

实施例3溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1的实验室小规模应用

将蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在30℃，200r/min培养16小时，将之加入到绿色颤藻、蛋白核小球藻、新月菱形藻的纯培养藻液中，三种微藻的初始密度分别为5.0×10⁶cell/mL、1.6×10⁶cell/mL、5.3×10⁵cell/mL，加菌数量为10⁷cfu/mL。菌藻混养体系在温度25～28℃、光照强度2500～4000lx、光暗周期为12h：12h条件下培养8天。结果显示绿色颤藻在第5天时全部死亡，藻细胞被溶解破碎；蛋白核小球藻和新月菱形藻略有增长，藻细胞密度分别为1.7×10⁷cell/mL和2.0×10⁶cell/mL。这表明CZBC1对颤藻有良好的溶解效果，对优良绿藻和硅藻——蛋白核小球藻、新月菱形藻没有不良影响，具有较好的专一性。

将绿色颤藻、小颤藻、浮游颤藻藻液的藻密度分别设置为10³cell/mL、10⁴cell/mL、10⁵cell/mL、10⁶cell/mL，分别加入10³cfu/mL、10⁴cfu/mL、10⁵cfu/mL、10⁶cfu/mL的CZBC1，混合培养7天。结果表明CZBC1溶解绿色颤藻和小颤藻的有效菌浓度相同，当藻密度为10³cell/mL时，CZBC1的溶藻有效菌浓度为10⁵cfu/mL；当藻密度为10⁴cell/mL和10⁵cell/mL时，有效菌浓度为10⁶cfu/mL。CZBC1溶解浮游颤藻（藻细胞数10³cell/mL～10⁶cell/mL）的有效菌浓度为10⁶cfu/mL。

蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在温度15～35℃、盐度0～40、pH6.5～9.5均可正常生长繁殖，其最佳生长条件为温度20～30℃，盐度20～40，pH7.0～9.0，适宜在绝大部分池塘应用。该菌在池塘水中生长24～32小时可达到峰值，44小时后开始衰减。一般情况下可按菌浓度10⁴cfu/mL使用CZBC1，在使用后10天内不使用消毒剂，根据池塘颤藻数量情况和溶藻效果，适当增大菌的用量，也可连续多次使用。

实施例4溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1的大规模应用

将蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在汕尾红海湾鸿泰养殖场进行了应用。选择养殖了55～80天的对虾集约化养殖水体进行处理，蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1菌剂使用浓度为10³CFU/mL。

其中养殖水体的主要理化指标为：水温25.5～32℃、盐度28.5～32、pH7.7～8.4、DO4.90～8.01mg/L、氨氮0.011～0.064mg/L、亚硝酸氮0.005～0.054mg/L、活性磷酸盐0.015～0.122mg/L、COD6.77～9.06mg/L。

结果如表2所示，在使用了CZBC1的水体中的绿色颤藻数量明显减少，其中颤藻占藻类总量的百分比从90～99%降至了9～15%，而对照组的颤藻数量始终维持在95%以上。可见，蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1对去除养殖池塘中的绿色颤藻具有良好的效果。

表2不同池塘中绿色颤藻的细胞数量

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

Claims

1.一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1，其特征是：该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏名称为蜡样芽孢杆菌CZBC1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，保藏日期：2013年4月9日，保藏号：CCTCC NO：M2013130。

2.权利要求1所述的一株溶解池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌菌株CZBC1在溶解池塘颤藻中的应用。