CN101333499B - 复合型活菌生物净水剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合型活菌生物净水剂及其制备方法，该生物净水剂包含枯草芽孢杆菌KX-1CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2CCTCCNo.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4CCTCC No.M 208060，且总菌数大于1×10⁸CFU/g。该生物净水剂能有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，改善水体污染；降解有机大分子，减轻水中富营养程度；并且上述的三株菌能将水体内的有机大分子物质分解成动植物能吸收的糖类、氨基酸、维生素、生物活性物质(激素)等，实现营养互补、协调共生，在水中增殖形成一个复杂而稳定的微生物系统。

Description

复合型活菌生物净水剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物菌剂技术领域，应用于水污染环境治理以及水产养殖业和其他养殖场液体排放物的净化处理，具体涉及含有益活菌的微生物净水菌剂及其制备方法。

背景技术

水体污染是一个世界性的水环境问题。我国的水资源环境保护虽然取得积极进展，但形势依然严峻。一方面，城市污染物排放量远远超过环境容量。另一方面，在水产养殖中，随着动物的排泄物增加，腐败菌的作用下，产生大量的有毒害的物质，同样的，其他养殖场的液体排放物也有这样的问题。

作为高新技术之一的生物技术应用于水体污染治理已有悠久的历史。目前，水体污染的治理方法以微生物修复法的应用和研究最为广泛，这类方法有如下几个优点：1)微生物具有很强的降解能力，处理效率高；2)微生物既具有很强的吸附力，又具有良好的沉降性，处理效果非常好；3)可处理的水量大；4)成本低且无二次污染。

现有技术中常采用含有益活菌微生物净水菌剂。这类微生物净水菌剂一般含有丰富的芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、硝化类菌、放线菌等有益菌，能够一定程度地去除水中氨氮和亚硝酸盐，减轻水中的富营养程度，改善水体污染，并且它们的代谢产物含有氨基酸、多种生化酶、辅酶Q、类抗生素物质和抗病毒物质等，对人畜和其他生物无任何负作用。但这类复合型菌剂都存在不同程度的局限性，例如适用性差，只能针对一些特定的有毒废水或成分较为单一的高浓度废水；其中的一些菌的生产成本太高，例如硝化类菌；特别是降解能力有限，持续性较差，经常要求追加，这样一来也增大了成本。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点提供一种降解能力更强、持续性更好的复合型活菌生物净水剂。

一种复合型活菌生物净水剂，其中，该生物净水剂包含以下微生物净水菌：枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060，该生物净水剂的总菌数大于1×10⁸CFU/g。

所述的复合型活菌生物净水剂还可以包含枯草芽孢杆菌KX-3 CCTCCNo.M 208059或枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061中一种或两种。

上述的五株微生物菌是从福建省龙海市角美镇国家水产养殖示范园的淤泥中分离而得。

菌种的筛选：取淤泥进行振荡培养后，稀释10^-7倍数后涂琼脂平板培养，挑出同一菌落在3个以上的单菌落(等同于每克淤泥中的活菌含量不少于3.0×10⁷CFU/g)作为初筛菌；对初筛菌进行氨氮降解、脂类降解、蛋白质降解及碳水化合物降解的定向筛选实验，最终筛选得到上述五株降解能力强的枯草芽孢杆菌。

上述五株菌于2008年4月21日在中国典型培养物保藏中心保藏，且于2008年4月26日检测完毕，检测结果为存活，保藏编号依次为：枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060、KX-3 CCTCC No.M 208059、枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061。

上述五株的枯草芽孢杆菌具有如下特征：

(1)个体形态特征

在LB琼脂平板上培养的枯草芽孢杆菌(KX 1～5)的个体特征如下：

	KX-1	KX-2	KX-3	KX-4	KX-5
						大小	0.8～1.0μm×1.5～3.0μm	0.5～0.9μm×0.9～1.8μm	0.8～1.0μm×1.5～3.0μm	0.7～1.0μm×1.8～3.5μm	0.7～1.0μm×1.6～3.6μm
菌体形状	杆状	杆状	杆状	杆状	杆状
						形成芽孢的时间	16小时	14小时	16小时	16小时	16小时
芽孢大小	中等	偏小	中等	中等	中等
						孢子囊	不膨大	不膨大	不膨大	不膨大	不膨大
革兰氏染色	阳性	阳性	阳性	阳性	阳性

(2)群落基本特征

枯草芽孢杆菌(KX 1～5)在LB琼脂平板上37℃培养1～2天，群落基本特征如下：

	群落基本特征
		KX-1	亮白色；有光泽；圆或不规则，形似水滴；边缘光滑；稍透明；分泌物较多，分泌物呈抽丝状。
KX-2	乳白色；无光泽；圆形；边缘光滑；不透明；分泌物较多，分泌物呈抽丝状。
		KX-3	白色；无光泽；不规则，中心有小突起；边缘不光滑，有褶皱；不透明；无分泌物，不抽丝，透气性好。

	群落基本特征
		KX-4	乳白色；无光泽；圆形，表面有突起；边缘不光滑，有褶皱；不透明；分泌物较多，分泌物呈抽丝状。
KX-5	白色；无光泽；圆形或不规则；边缘不光滑，有锯齿；不透明；无分泌物，不抽丝，透气性好。

(3)生理生化特性

	KX-1	KX-2	KX-3	KX-4	KX-5
						需氧性试验	+	+	+	+	+
V-P试验	+	+	+	+	+
						生长温度	5℃～45℃	5℃～45℃	5℃～45℃	5℃～45℃	5℃～45℃
卵磷脂酶中生长情况	-	-	-	-	-
						溶菌酶(0.001％)中生长情况	d	d	d	d	d
抗叠氮化钠(0.02％)	+	+	+	+	+
						NaCl溶液(7.0％)中生长情况	+	+	+	+	+
分解木糖产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
						分解葡萄糖产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
分解麦芽糖产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
						分解甘露醇产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
分解蔗糖产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-
						分解乳糖产酸/产气	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-
分解D-半乳糖产酸/产气	+/-	+/-	+/-	+/-	+/-

	KX-1	KX-2	KX-3	KX-4	KX-5
						分解阿拉伯糖产酸/产气	-/-	+/-	+/-	-/-	-
水解淀粉	+	+	+	+	+
						利用柠檬酸盐	+	+	+	+	+
还原NO<sub>3</sub><sup>-</sup>至NO<sub>2</sub><sup>-</sup>	+	+	+	+	+
						水解酪素	+	+	+	+	+
水解苯丙氨酸	-	-	-	-	-
						水解马尿酸盐	-	-	-	-	-
形成吲哚	-	-	-	-	-

注：+：阳性(90～100％菌株呈阳性)；-：阴性(90～100％菌株呈阴性)

d：反应不同，11～89％的菌株呈阳性；

V-P试验：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P阳性，也称V-P(+)反应。

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版(Holt J.G.，Krieg N.R.，SheathP.H.A.，et al.Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology(NinthEdition)1994.Williams & Wilkins.Baltimoce.Maryland.USA.)和《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物研究所细菌分类组编著，北京-科学出版社1978.11)中提供的鉴定依据以及上述试验结果表明KX-1、KX-2、KX-3、KX-4、KX-5属于原核生物界，与光无关的原核生物(门II)，细菌(纲I)，芽孢杆菌科(科I)，芽孢杆菌属(属I)，枯草芽孢杆菌(群I)，但这五种菌株与原始菌种、现有的一些微生物净水菌相比净水能力更强，具体如下：

(1)枯草芽孢杆菌KX-1、KX-2、KX-4具有更强的同化降解基质碳源与无机氮源的能力；

(2)KX-1、KX-4还能产生脂肪酶、酯酶，能分解挥发性脂肪酸分子，如部分的油脂和脂肪降解的产物-长链的和支链的挥发性脂肪酸(C4～C9)；

(3)KX-2、KX-4具有较强的去除氨氮的能力，能在有NH₄ ⁺、NO₂ ^-的条件下大量繁殖，去除有毒物质NH₄ ⁺、NO₂ ^-(将NH₄ ⁺、NO₂ ^-转化生成硝酸盐NO₃ ^-)，同时还生成了大量抗生素，在2～3天内能杀死养殖池塘中的青苔，净化水质；

(4)KX-1能产生高活性的纤维素酶、淀粉酶，能分解常温下不易被分解的纤维素和木质素，使未腐败的有机物发酵，进而转化为动植物能有效吸收的养分；

(5)KX-4还能生长在低溶氧水体环境中。

包含有枯草芽孢杆菌KX-1、KX-2、KX-4的复合型活菌生物净水剂能有效去除水中氨氮和亚硝酸盐，改善水体污染；降解有机大分子，减轻水中富营养程度；并且上述的三株菌能将水体内的有机大分子物质分解成动植物能吸收的糖类、氨基酸、维生素、生物活性物质(激素)等，实现营养互补、协调共生，在水中增殖形成一个复杂而稳定的微生物系统。

另外，枯草芽孢杆菌KX-3能产生脂肪酶、酯酶、淀粉酶，同时还能形成生物絮凝体，代谢水体中营养物质的同时形成可以利用的食物团。枯草芽孢杆菌KX-5能产生高活性蛋白酶，且含有枯草芽孢杆菌KX-5的复合型活菌生物净水剂还能生长在高盐度的水体环境中。

为达到最佳净水效果，枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057的菌数优选2.5×10⁸～4.0×10⁹CFU/g，枯草芽孢杆菌KX-2 No.M 208058的菌数优选1.5×10⁸～3.0×10⁹CFU/g，枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060的菌数优选2.0×10⁸～4.0×10⁹CFU/g。

为达到最佳净水效果，枯草芽孢杆菌KX-3 CCTCC No.M 208059的菌数优选1.5×10⁸～3.0×10⁹CFU/g。枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061的菌数优选3.0×10⁷～5.0×10⁸CFU/g。

本发明的另一目的是提供了上述的复合型活菌生物净水剂的制备方法：以枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060为菌种，将所述的这三种菌种分别进行单体克隆培养(试管原种划线培养、单菌落培养皿接种培养、斜面种子接种培养、摇瓶培养、一级种子罐培养)，将培养合格的三株菌分别接入固体培养基进行固体发酵培养，培养结束后再进行混合，总菌数达到1×10⁸CFU/g以上后，进行制剂得到复合型活菌生物净水剂。

固体培养基优选麸皮、豆粕、玉米粉、米糠的混合物。

附图说明

图1为试验例1中NO₃-N，NO₂-N的浓度随时间的变化，纵坐标代表浓度(mg/L)，横坐标代表时间(天)。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步阐述本发明的复合型活菌生物净水剂的制备和净水处理。

实施例1

复合型活菌生物净水剂的制备如下：

首先分别对枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060进行单体克隆培养，其包括5个依次进行的步骤，具体如下：

1)试管原种划线，于37℃恒温培养箱培养24小时；

2)挑取培养皿中的单菌落进行接种，于37℃恒温培养箱培养14小时；

3)斜面种子接种：在无菌操作条件下，挑起单菌落在已灭菌的空白斜面培养基上，用涂棒涂布均匀，置37℃恒温培养24h，合格斜面收起，放2～4℃冰箱保存；斜面培养基最好采用成份如下的培养基(单位：g/L)：酵母粉1～3、蛋白胨2～3、氯化钠1～2、琼脂2～3，自来水1000mL，pH 7.2～7.4；

4)摇瓶培养：取合格斜面一只，以无菌操作，用已灭菌的挖块针挖取适量大小的斜面菌膜于盛有灭菌发酵培养基的三角瓶中，将三角瓶置于210r/min摇床中，37℃摇床培养16小时后，做镜检和杂菌检验。摇瓶培养基的成分与斜面培养基相同；

5)一级种子罐培养：取合格摇瓶培养种子，按0.1～1％的接种量接入灭过菌的种子罐培养基中，37℃，200转/分钟，培养16h后，做镜检和杂菌检验。种子罐培养基最好采用成分如下的培养基(单位：g/L)：豆粕粉1～3，玉米粉2～4，麸皮1.5～3.5，磷酸氢二钠0.2～0.5，磷酸二氢钾0.01～0.04，自来水1000mL。

经上述步骤培养合格的三株菌分别接入固体培养基进行固体发酵培养，培养结束后按比例混合，具体如下：

固体培养基选用麸皮、豆粕、玉米粉、米糠的混合物(要求麸皮、豆粕、玉米粉、米糠无杂质、无霉变，且各组分的重量比如下，麸皮∶豆粕∶玉米粉＝6.5～8∶1～2.5∶1～1.5)，固体培养基中可添加少量微量元素，将配制好的固体培养基进行121℃，压力0.1MPa下灭菌30分钟后，冷却至30～40℃，再将上述培养合格的三株菌分别接入固体培养基进行固体发酵培养，接种量在1×10³～2×10³CUF/g，在密闭无菌容器中进行固体发酵培养，将接种好的料均匀摊铺在底部多孔的金属盘内，料厚1cm～5cm，再将料盘放到无菌培养室(P2级生化实验室标准)的培养架上，层层叠放。发酵时，培养最适温度为37℃(室温控制在35～40℃)，湿度保持45％～60％，pH值保持在6.8～7.5，定期翻动物料以降低温度，保持蓬松，发酵36～40h后，得到发酵产物的颜色为深黄褐色，带有浓浓的香味，活菌含量一般不小于150亿个/克。

采用沸腾干燥机对上述发酵产物进行沸腾干燥，干燥温度小于50℃，当水分小于10％时，即干燥完成。然后用25目左右的振荡筛对干燥好的料进行过筛，将小于25目的麸皮、豆粕、玉米粉、米糠培养基过筛掉，最后对所得的混合物进行压片制剂，压片前分别测试上述的三株菌的活菌含量，(枯草芽孢杆菌KX-1的菌数达2.5×10⁸CFU/g以上，KX-2的菌数达1.5×10⁸CFU/g以上，KX-4的菌数达2.0×10⁸CFU/g以上)，将菌混合物倒入压片机的料斗内进行压片。

复合型活菌生物净水剂中还可以包含枯草芽孢杆菌KX-3 CCTCC No.M208059或枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061中一种或两种。KX-3和KX-5的单克隆培养方法与KX-1、KX-2、KX-4相同，单克隆培养合格后的KX-3和KX-5中的一种或两种可以与KX-1、2、4一同接入固体培养基进行混合固体发酵培养，最后进行制剂。

试验1在河鲀鱼越冬池的应用

试验场所：江苏省现代渔业(禄口)科技示范园河鲀鱼越冬温室内，越冬池面积每只120平方米(试验池与对照池各一只)。

试验池与对照池试验前吸淤排水，加注新水，保证基础水指标一致。试验过程中，试验池不吸污，不排水，对照池按常规方法处理。

取试验池水20Kg置于水桶中，并将实施例1所得复合型活菌生物净水剂片剂(片剂17g，每克中大约有150亿活菌)直接投入水桶中，对水桶溶液用小型气泵增氧5小时，以激活微生物孢子，5小时后再将桶中溶液泼入试验池。

水化学指标测定：NO₃-N采用酚二磺酸比色法，测NO₂-N采用盐酸萘胺比色法，测PH值采用酸度计测定法，测溶氧(DO)采用碘量法。

结果如下：

1)复合型活菌生物净水剂对水体中水化学指标的影响

将复合型活菌生物净水剂应用于河鲀鱼越冬池，并每天定时对试验池和对照池的水化学指标进行测定，结果见表1、图1。试验池在1-7天中，水化学指标NO₃-N、NO₂-N逐渐减少，PH值趋向稳定(见图1)，而对照池虽在中途换水排污一次，NO₂-N自然降低外，NO₃-N始终含量较高，PH值呈下降趋势。

表1水化学指标入比较表

2)复合型活菌生物净水剂对越冬河鲀鱼的影响

经一周对试验池与对照池河鲀鱼的摄食、活动观察，虽然两池均用罗氏凤充气机增氧，溶解氧含量一直保持在7-8mg/L，但由于水中氨氮含量的差异，试验池河鲀鱼摄食速度明显较对照池快，无残留。相反，对照池河鲀鱼摄食速度明显较慢，并有残留，导致在试验过程中即使吸污换水，pH值仍有下降的趋势。

总的来说，在7天的试验过程中，试验池中NO₃-N从0.2mg/L降至0.13mg/L，共下降了0.07mg/L，下降率达35％；NO₂-N从0.18mg/L降至0.03mg/L，共下降了0.15mg/L，下降率达83.3％，PH值趋向稳定，同时越冬河鲀鱼的摄食、活动良好，达到了净化水质、控制水质、无需排污、减少换水量、节约能耗的目的。

试验2测定复合型活菌生物净水剂的微生物絮凝活性

分别将枯草芽孢杆菌KX-1、KX-2、KX-3、KX-4、KX-5五株菌在LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)中培养30小时，然后测定发酵液的絮凝活性。

在测定管中，加入4.65mL的5g/L的高岭土悬浮液，0.25mL 90mmol/L CaCl₂溶液，再0.1mL上述发酵液，调节PH，然后在旋涡混合器中充分混合均匀，在室温下静置5min，观察絮凝现象，取上清液约2mL于分光光度计在550nm测定其混浊度，絮凝活性计算方法如下：

絮凝活性＝1/A-1/B

A＝测试溶液之混浊度(OD550)；

B＝参考溶液之混浊度(OD550)；

参考溶液为无添加生物高分子絮凝剂

结果如下：

表2复合型活菌生物净水剂的微生物絮凝活性

菌株名	添加离子	絮凝活性
			KX-1	90mmol/L Ca<sup>2+</sup>	-0.2
KX-2	90mmol/L Ca<sup>2+</sup>	-0.4
			KX-3	90mmol/L Ca<sup>2+</sup>	5.7
KX-4	90mmol/L Ca<sup>2+</sup>	-0.2
			KX-5	90mmol/L Ca<sup>2+</sup>	0.02

从表2中可以看出，菌株KX-3分泌的物质能产生絮凝体，代谢水体中的营养物质的同时形成可以利用的食物团。KX-3分泌的物质是多糖、蛋白质或糖蛋白中的一种或几种。

试验3复合型活菌生物净水剂产生的各种酶的活性测定

分别将枯草芽孢杆菌KX-1、KX-2、KX-3、KX-4、KX-5五株菌在LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L)中培养30小时，发酵液10000r/min 5min离心，取上清液测定酶活力，结果见下表：

表3各菌株产生的酶活性

枯草芽孢杆菌KX-1、KX-3、KX-4能产生脂肪酶。(脂肪酶活力定义为：在37℃，pH7.5条件下，每分钟催化生成1μmol脂肪酸所需的酶量为一个活力单位。)

枯草芽孢杆菌KX-1能产生纤维素酶。(纤维素酶活力定义为：在常温下，以葡萄糖作标准溶液，以每分钟生成1μmol葡萄糖作为1个酶活单位。)

枯草芽孢杆菌KX-1、KX-3、KX-4能产生淀粉酶。(淀粉酶活力定义为：在30℃条件下，每一小时催化1ml 2％可溶性淀粉水解成糊精所需的酶量，定为一个酶活力单位。)

枯草芽孢杆菌KX-1、KX-3、KX-4能产生酯酶。(酯酶活力定义为：在30℃、pH6.0的条件下，每分钟催化得到1μmol α-萘酚所需的酶量定为一个酶活力单位。)

枯草芽孢杆菌KX-5能产生蛋白酶。(蛋白酶活力定义为：在30℃、pH7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1μg为一个酶活力单位。)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的是让熟悉此项技术的人士能够了解本发明并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种复合型活菌生物净水剂，其特征在于，该生物净水剂包含以下微生物净水菌：枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4CCTCC No.M 208060，该生物净水剂的总菌数大于1×10⁸CFU/g。

2.根据权利要求1所述的复合型活菌生物净水剂，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057的菌数为2.5×10⁸～4.0×10⁹CFU/g，所述的枯草芽孢杆菌KX-2 No.M 208058的菌数为1.5×10⁸～3.0×10⁹CFU/g，所述的枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060的菌数为2.0×10⁸～4.0×10⁹CFU/g。

3.根据权利要求1所述的复合型活菌生物净水剂，其特征在于：该生物净水剂还包含枯草芽孢杆菌KX-3 CCTCC No.M 208059。

4.根据权利要求3所述的复合型活菌生物净水剂，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌KX-3 CCTCC No.M 208059的菌数为1.5×10⁸～3.0×10⁹CFU/g。

5.根据权利要求1或3所述的复合型活菌生物净水剂，其特征在于：该生物净水剂还包含枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061。

6.根据权利要求5所述的复合型活菌生物净水剂，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌KX-5 CCTCC No.M 208061的菌数为3.0×10⁷～5.0×10⁸CFU/g。

7.权利要求1所述的复合型活菌生物净水剂的制备方法，其特征在于：以枯草芽孢杆菌KX-1 CCTCC No.M 208057、枯草芽孢杆菌KX-2 CCTCC No.M 208058、枯草芽孢杆菌KX-4 CCTCC No.M 208060为菌种，将所述的这三种菌种分别进行单体克隆培养，具体步骤为：试管原种划线培养、单菌落培养皿接种培养、斜面种子接种培养、摇瓶培养、一级种子罐培养，将培养合格的三株菌分别接入固体培养基进行固体发酵培养，培养结束后再进行混合，总菌数达到1×10⁸CFU/g以上后，进行制剂得到复合型活菌生物净水剂。

8.根据权利要求7所述的复合型活菌生物净水剂的制备方法，其特征在于：所述的固体培养基为麸皮、豆粕、玉米粉、米糠的混合物。

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