CN100374547C

CN100374547C - 复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法

Info

Publication number: CN100374547C
Application number: CNB2005101360039A
Authority: CN
Inventors: 张克强; 李野
Original assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Current assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: CN1807588A

Abstract

复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法。利用枯草芽孢杆菌好气性微生物为主导菌，与乳酸菌嫌气性微生物采用科学的适当比例混合接种并在微好氧条件下的发酵工艺，培养出多种多样的微生物群落，各种微生物在其生长过程中产生的有用物质及其分泌物，成为各自或相互生长的基质和原料，通过这种共生增殖关系，形成一个复杂而相对稳定的微生物生态系统。选择农副产品和工业下脚料为主要成分，该培养基含有适合微生物生长的各种必须因子，能促进混合菌生长、芽孢的形成和胞外蛋白酶的分泌，且发酵时间短，基料含活菌数特别高。此微生物制剂用于渔业生产，降解、转化养殖水体中的有害物质，减少药物使用，营造良好的养殖生态环境，实现健康养殖。

Description

复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法

【技术领域】：

本发明涉及养殖水体的生态修复技术领域，特别是采用生物修复法改善和治理受污染环境的一种复合微生物制剂的制备。

【背景技术】：

自20世纪80年代开始，我国水产养殖生产规模逐渐扩大，水产养殖面积和产量继续增长，使我国已成为世界养殖大国。据对全国二十个省(市、区)的不完全统计，2004年1-11月份海水养殖产量达到1050.6万吨，淡水产品产量达到1699.6万吨，分别比去年同期增长4.2％和5.9％。各地积极开发荒滩、荒水、低洼地、大湖、大水库及稻田养鱼，养殖面积也有所增长。预计，2005年年海水养殖和内陆养殖面积分别比去年增加12.2％和1.6％。养殖领域也进一步拓宽，深水抗风浪网箱养殖发展迅速。2004年全国深水抗风浪网箱发展到2736个，比上年增加770个，增长39％。但近年来，水产养殖业的迅速发展却带来了沉重的污染，养殖水体污染和富营养化问题已成为亟待解决的问题，也是养殖水产品疾病爆发的主要诱因。如2004年上半年广东省对虾发病率高达60％以上，绝产面积扩大，全省达19.4万亩，仅湛江市绝产面积就达11.47万亩，占全部放养面积的38％以上；江苏省南通市今年文蛤、紫菜由于陆源污染及病害问题几乎全军覆没；宁波鲈鱼、南美白对虾病害也比较严重，养殖户出现亏损现象。随着生产的发展，养殖总量超过了水域容量，养殖环境与周围生态环境之间的矛盾越来越突出，一方面水产养殖的生产过程和发展需要清洁的、未污染的水体，另一方面水产养殖自身又是一个会对水体产生影响的污染源。

我国水产养殖环境面临的主要问题有：

1.外源污染对养殖环境的影响日益严重。城市和农村的地表径流是两类严重的污染养殖环境的面源污染源，农田受雨水侵蚀导致大量的高氮水体进入养殖环境中，引起水体的富营养化。2000年的农田面源污染负荷量分别为总氮6.8万吨，2004年广东沿海工业废水排放总量为12.17亿吨，COD、氨氮和石油类排放负荷分别为12.64万吨、6361吨和357吨。

2.养殖过程对环境污染负荷日益加重。养殖过程中由于投饵量的难以确定，投料后饵料不能被充分利用，形成残饵，堆积在底部。资料显示，即使是管理最好的养虾场也仍会有多达30％的饵料未被摄食。李纯厚等评估了对虾池塘养殖主要污染物的环境负荷量和排放量，结果显示对虾池塘养殖氮、磷环境负荷量分别达到45.8kg/t和10.1kg/t。

3.环境恶化导致病害发生频率日益频繁。沉积于底部的营养物在降解过程中需要消耗大量的氧，从而造成养殖区底部缺氧环境，营养物在厌氧环境下的降解，会产生硫化氢、氨等对生物体有毒害作用的气体，造成鱼虾病害的发生。

4.环境恶化引发养殖产品质量安全日益突出。环境的恶化引起水产养殖病害的发生，随之而来的问题就是鱼药的滥用引起的养殖产品的安全问题。2002年1月美国食品及药物管理局(FDA)对我国对虾类产品发出预警通报，并宣布在动物源食品中禁止使用氯霉素、磺胺等11类药物。因此，养殖水体污染问题的日益突出，不仅影响到养殖业的发展速度，而且涉及到产品的质量、安全问题。如何改善养殖环境以实现养殖业的健康持续发展，生产优质水产品等方面受到越来越多学者的关注。

按照生态修复的手段，养殖水体的生态修复技术主要包括物理修复、化学修复和生物修复。常用的物理方法有换水、曝气、筛网、泼洒沸石粉等，但这类方法常需要较高的投资和运转费用，并且效果也往往不彻底，持续时间短。化学修复是利用化学制剂与污染物发生氧化、还原、沉淀、聚合反应，使污染物以从养殖环境中分离或降解转化成无毒无害的化学形态，如过氧化氢、二氧化氯等，但化学修复剂容易产生有害的次生产物，使得水生生态系统健康状况更加恶化，也易引起水产品品质的退化。生物修复指利用各种生物的特性，吸收、降解、转化环境中的污染物，使受污染的环境得到改善的治理技术，它是目前最具发展前景的水体修复技术，是20世纪环境科技发展最快的高新技术领域之一。与传统的物理和化学修复相比它具有费用低、耗时短、净化彻底、不依产生二次污染、不危害养殖功能、不破坏生态平衡等诸多优点。而微生物修复是研究最早也是目前最主要的生物修复方法。其原理是在有氧或无氧的条件下，微生物将有机物或其它污染物进行分解并释放氮，磷等营养盐。由于微生物生命周期短，繁殖快，因此降解有机物的速度要比其它生物快上万倍。我国在这一领域主要开展了三方面的研究：(1)分离、筛选有修复活性的土著微生物；(2)复合微生物制剂的研究和应用；(3)修复作用菌固定化的研究。

复合微生物制剂由多种有益菌组成，利用各种微生物的协同作用，它可以更快速、全面的分解各种污染物，更有效的抑制养殖水体中有害藻类过量繁殖，对环境的适应性也更强。复合菌剂由两种至多种单一菌剂复合而成，它可以先将菌种混合再共同培养，也可先将单一菌种培养再共同混合，目前常用的复合微生物制剂主要是通过单一菌种发酵后混合而成。由于混合菌有益于微生物的功能互补，故混合菌制剂效果优于单菌制剂，同时菌种配伍时混合菌种种类宜少而精，并要求在同一保存体系中能有协同作用，可形成共同的生长优势，以保证制剂的功能作用，充分发挥出多种功能作用，为人类所利用。

【发明内容】：

本发明目的是降解、转化养殖水体中的有害物质，减少药物使用，营造良好的养殖生态环境，提供一种复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法。

本发明利用枯草芽孢杆菌好气性微生物为主导菌，与乳酸菌嫌气性微生物采用科学的适当比例混合接种并在微好氧条件下的发酵工艺，培养出多种多样的微生物群落，各种微生物在其生长过程中产生的有用物质及其分泌物，成为各自或相互生长的基质和原料，通过这种共生增殖关系，形成一个复杂而相对稳定的微生物生态系统。

本发明提供的复合微生物制剂的制备方法如下：

(a)培养液制备：培养液由下列成分按重量百分比组成：玉米粉2.5～4％，黄豆饼粉4.5～5.5％，酵母膏1.0～2.0％，K₂HPO₄ 0.1～0.4％，CaCl₂ 0.01～0.03％，MgSO₄ 0.15～0.30％，MnSO₄ 0.005～0.01％，蒸馏水88.725～90.42％，pH为7.2～7.5，120℃下灭菌；

(b)深层液体发酵：使用(a)步骤制备的培养液，接入枯草芽孢杆菌与乳酸菌，总接种量按液体发酵液的体积百分比的4～6％接入，其中枯草菌与乳酸菌的体积比为4∶0.5～1，培养温度35～40℃，摇瓶转速220～250r/min，培养时间18～22h；

(c)以麸皮作载体，将(b)步的发酵液按麸皮重量百分比的10～15％的比例加入；

(d)采用红外线烘干，得到复合微生物制剂；

(e)产品密闭后常温保存。

上述(c)步麸皮载体中可添加麸皮重量1～2％的壳聚糖。

上述(d)步中烘干温度为60～70℃。

本发明的优点和积极效果：本发明通过混合接种一定量的乳酸菌与枯草芽孢杆菌混合发酵，使其在发酵过程中自身调节pH值，维持中性状态，有利于菌体的增殖和代谢产物的形成。本发明主要以廉价易得农副产品和工业生产的下脚料作为原料，优化混合菌的液体培养基，提供适合枯草芽孢杆菌和乳酸菌快速生长培养基及其发酵方法，以得到活性较高，产蛋白酶较多的芽孢杆菌菌体，使之用于渔业生产，降解、转化养殖水体中的有害物质，减少药物使用，营造良好的养殖生态环境，实现健康养殖。本方法生产工艺简便，实际操作性强，发酵时间短，节约成本，对污染养殖水体有显著降低有机污染物和削减水体富营养化程度的效果，COD的去除率达70％以上，氨氮去除率达90％以上，试验池养殖鱼类无死鱼和浮头现象。本发明独特的混合发酵方式使得发酵过程实现自身调节维持在中性环境中，更有利于菌体的生长和繁殖，两种微生物在其生长过程中产生的有用物质及其分泌物，成为各自或相互生长的基质和原料，通过这种共生增殖关系，形成一个复杂而相对稳定的微生物生态系统。所选用的混合芽孢杆菌生长培养基的原料为农副产品和工业生产下脚料，既解决了废弃物的有效利用，又节约了成本，本生物修复技术可与养殖生产同时进行或在养殖前后进行，成本低廉、可操作性强，效果显著，无二次污染。

【具体实施方式】：

实施例1、复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备：

(a)通气发酵法生产菌液：培养基成分(按重量百分比)组成：玉米粉2.50％，黄豆饼粉5.50％，酵母膏1.30％，K₂HPO₄ 0.11％，CaCl₂ 0.01％，MgSO₄ 0.15％，MnSO₄ 0.01％，蒸馏水90.42％.初始pH调至7.2～7.5，120℃蒸汽灭菌30min，接种量6％(枯草菌与乳酸菌的体积比为4∶1)，培养温度37℃，摇瓶转速250r/min，培养时间22h；(b)以麸皮作载体：将发酵液按10％的比例以麸皮作载体，其中添加1％的壳聚糖。(c)采用红外线烘干，烘干温度为60℃。(d)产品保藏：采用密闭常温保藏。

实施例2、复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备：

(a)通气发酵法生产菌液：培养基成分(按重量百分比)组成：玉米粉4.00％，黄豆饼粉5.00％，酵母膏1.80％，K₂HPO₄ 0.20％，CaCl₂ 0.02％，MgSO₄0.25％，MnSO₄ 0.005％，蒸馏水88.725％，初始pH调至7.2～7.5，120℃蒸汽灭菌30min，接种量4％(枯草菌与乳酸菌的体积比为4∶0.5)，培养温度35℃，摇瓶转速220r/min，培养时间18h；(b)以麸皮作载体：将发酵液按15％的比例以麸皮作载体，其中添加2％的壳聚糖。(c)采用红外线烘干，烘干温度为70℃。(d)产品保藏：采用密闭常温保藏。

实施例3、复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的应用：

产品施用于养殖水体：使用时每500g菌剂兑塘水10公斤，搅拌均匀，放置2h待菌剂活化后，全塘泼洒，每15天投加菌剂一次。采用芽孢杆菌复合微生物制剂能显著改善养殖水体水质，提高养殖水体溶氧，显著降低COD、NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N含量，达到养殖水体良好水质标准，试验池养殖鱼类无死鱼和浮头现象。

Claims

1.一种复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法，其特征是该方法包括：

(a)培养液制备：培养液由下列成分按重量百分比组成：玉米粉2.5～4％，黄豆饼粉4.5～5.5％，酵母膏1.0～2.0％，K₂HPO₄0.1～0.4％，CaCl₂0.01～0.03％，MgSO₄0.15～0.30％，MnSO₄0.005～0.01％，蒸馏水88.725～90.42％，pH为7.2～7.5，120℃下灭菌；

(d)采用红外线烘干，得到复合微生物制剂；

(e)产品密闭后常温保存。

2.根据权利要求1所述的复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法，其特征是，于上述(c)步麸皮载体中添加麸皮重量1～2％的壳聚糖。

3.根据权利要求1或2所述的复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微生物制剂的制备方法，其特征是，上述(d)步中烘干温度为60～70℃。