CN109355198B - 一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用，属于工业发酵微生物固态培养发酵领域。本发明用于微生物固态通量发酵的培养基为片状；所述培养基由固体组分和水组成，所述培养基的固体组分包括下述重量百分比的组分：麸皮70％‑90％，豆粕5％‑20％，米糠5％‑15％；所述培养基的润水量为20％‑30％。本发明的培养基应用于工业发酵微生物的孔板固态通量培养不仅节省培养基的准备及接种时间，进一步提高固态孔板培养的高通量筛选效率。同时采用统一压片制作的方式，减少培养基称量过程中人为导致的分装操作误差，以及减少蒸煮后培养基分装过程中染菌的风险，提高孔板固态高通量发酵培养的稳定性和平行性。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基及其制备方法与应用，具体涉及一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用。
背景技术
固态发酵是工业发酵微生物进行酶制剂、次级代谢产物工业化生产的常用方式。目前对于工业发酵微生物的固态发酵研究，主要集中在底物优化和菌种选育。底物优化是对固态发酵的工艺进行优化改造，以获得产品质量的提升；菌种选育是通过对生产菌株进行自然、化学、物理等方式进行诱变，以获得能够在固态发酵中提升产品质量的优良性状的目标菌株。但由于菌株突变的随机性以及后续筛选过程繁琐，往往导致菌种选育研究难度要远超过底物优化。传统的丝状真菌菌株选育过程，往往要经历多个步骤完成，在前期的筛选阶段主要借助固体琼脂平板以及结合显色底物和透明圈的方式，进行菌株的初步筛选。在后期的复筛过程，基本都是模拟正常工业生产培养基进行发酵应用和验证，在这个过程中通常采用三角瓶固态曲料进行发酵分析，同时在固态培养过程中为了保证曲料充分混匀发酵，还要定时的进行多次三角瓶摇曲操作；在后期进行固态发酵产物分析时，需要将曲料进行称重取出，浸提，并单独进行产物分析，整个过程工作量大、操作繁琐，不能实现工业发酵微生物的培养和筛选通量化。而且三角瓶的固态发酵过程中还不能实现通气和湿度的可控，往往会造成三角瓶的发酵结果与实际固体发酵结果存在较大的偏差，不能有效的指导实际生产应用。
为了解决这一问题，发明人开发了一种固态通量培养装置及其应用(CN107446804A)，该装置能够实现工业发酵微生物丝状真菌的通量筛选。但在后续长期的应用中，发明人发现，在丝状真菌固态培养过程中进行多孔板培养基的无菌分装严重影响固态培养装置的应用效率。由于多孔板每个孔是连在一起的整体，每个孔都需要单独称料，同时孔的装载量也较小，因此在培养基分装过程中需要十分谨慎小心才能保证每孔分装培养基的一致性以及防止污染杂菌，该方面的操作极大影响固态通量培养装置使用效率。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于微生物固态通量发酵的培养基及其制备方法与应用，采用该培养基进行固态通量发酵可以提高固态通量培养装置的使用效率，且发酵结果更为稳定。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于微生物固态通量发酵的培养基，所述培养基为片状；所述培养基由固体组分和水组成，所述培养基的固体组分包括下述重量百分比的组分：麸皮70％-90％，豆粕5％-20％，米糠5％-15％；所述培养基的润水量为20％-30％。其中，润水量即表示在一定重量培养基加入对应含量水的体积(润水量为20％～30％即表示：1g培养基加入0.2～0.3ml水)。
本发明将培养基制成片状，这样当培养基用于固态通量培养时，可将这些培养基直接放入孔板不同的孔中进行后续处理，既能保证不同孔之间培养基的分装速度，也能保证培养基及重量一致性，还能从源头杜绝培养基分装过程中杂菌污染，从而实现固态通量培养装置的更高效应用。
本发明的培养基含有特定的固体组分以及水分。研究表明，培养基中固体组分的组成以及水分含量影响培养基是否压片成型、是否容易破碎、同批次压制成片之间的质量相对标准偏差(RSD)、115-121℃高压高温灭菌是否松散，以及加入无菌水后能否快速松散。若是培养基中含水量较低，虽然在115-121℃高压高温灭菌以及加入无菌水后能松散，但培养基易破碎且同批次压制成片之间的质量相对标准偏差较大；若是培养基中含水量较高，虽然培养基不易破碎且同批次压制成片之间的质量相对标准偏差较小，但在115-121℃高压高温灭菌以及加入无菌水后易出现结块现象。当培养基选用本发明特定的固体组分以及水分时，它具有压片易成型、不容易破碎、同批次不同压制成片之间的质量相对标准偏差(RSD)小于5％、115-121℃高压高温灭菌不能凝结成难以分散块或团状形态、以及灭菌后加入20％-40％无菌水能快速松散的性能。
作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述麸皮、豆粕和米糠的细度均为40目以上。培养基中组分细度影响培养基压片的质量，各组分只有在所述细度范围内才能进行有效的压片操作。
作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，每片所述培养基的质量为0.9-1.5g。当每片培养基的质量为0.9-1.5g时，培养基在孔板进行微生物发酵培养的过程中才能够保证有效和稳定通气、散热和保湿。
作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述培养基为圆片状。
作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的优选实施方式，所述培养基的直径为10-15mm，厚度为5-10mm。
另外，本发明还提供了上述用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法，其包括以下步骤：按比例称取培养基中的各固体组分，混合后加入水，再混合均匀，进行压片处理，得到所述培养基。
上述制备方法中，加入一定量的水以保证所得培养基润水量为20％-30％。压片过程中，最好保证同批次不同压片培养基的重量RSD偏差不超过5％，以保证培养基在用于孔板微生物培养的过程中孔间差异的稳定性，以及微生物发酵数据的稳定性和可靠性。
作为本发明所述用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法的优选实施方式，所述压片处理时，压片机的压力为5-10kn。压片机的压力是需要随着压片培养基成分的改变而进行，这样才能达到培养基压片的最适条件，保证得到压片的稳定性(RSD<5％)；因为不同原料的密度不同，在配比过程中需要根据培养基的重量需求进行直径以及填充深度的调整，达到最适的重量要求。
最后，本发明还提供了上述培养基在用于微生物固态通量发酵中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：
(a)将培养基置于固态通量培养装置中，灭菌处理后冷却；
(b)向经步骤(a)处理的培养基中加入无菌水，并将微生物接入培养基中，将微生物与培养基混合均匀，进行发酵培养。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：
(a)将培养基置于固态通量培养装置中，于115-121℃灭菌30-60min后冷却；
(b)向经步骤(a)处理的培养基中加入无菌水，并将微生物接入培养基中，将微生物与培养基混合均匀，于28-37℃进行发酵培养24-96小时；其中，所述无菌水与培养基的重量比为0.2-0.4：1。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述固态通量培养装置为公开号为CN107446804A专利所述的固态通量培养装置。具体地，所述固态通量培养装置包括培养板和设于所述培养板上的板盖；所述培养板包括培养板本体，所述培养板本体上设有多个培养孔，各个所述培养孔的内底部均设有与培养孔尺寸相匹配的多层纱布；各个所述培养孔的底部中间还开设有第一通孔，所述第一通孔内穿插有与第一通孔相匹配的鲁尔接头，所述鲁尔接头的接口位于所述培养板本体的外部；所述板盖上设有多个第二通孔，所述第二通孔的分布位置与所述培养孔相一致。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述微生物为米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的培养基为片状，应用于工业发酵微生物的孔板固态通量培养不仅节省培养基的孔板分装及接种时间，进一步提高固态孔板培养的高通量筛选效率，同时采用统一压片制作的方式，减少培养基称量过程中人为导致的分装操作误差，以及减少蒸煮后培养基分装过程中染菌的风险，提高孔板固态高通量发酵培养的稳定性和平行性。
(2)本发明的培养基含有特定的固体组分以及水分，它具有压片易成型、不容易破碎、同批次不同压制成片之间的质量相对标准偏差(RSD)小于5％、115-121℃高压高温灭菌不能凝结成难以分散的块或团状形态、以及灭菌后加入20％-40％无菌水能快速松散的性能。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机，能够满足压片压力在5-10kn之间(包含5kn，10kn)，压片直径在10-15mm之间(包括10mm，15mm)，培养基厚度在5-10mm之间(包括5mm，10mm)，压片形状为圆片状，压片后培养基的重量在0.9-1.5g之间(包括0.9g，1.5g)。
压片质量是根据培养基需要满足的条件进行设置，从能否压片成型、稳定性，同批次压制成片之间的质量相对标准偏差(RSD)、115-121℃高压高温灭菌是否松散，以及加入无菌水后能否快速松散是作为评价标准。
实施例1～4
实施例1～4用于微生物固态通量发酵的培养基均为圆片状，培养基由固体组分和水组成，培养基的固体组分由麸皮、豆粕和米糠组成，麸皮、豆粕和米糠在固体组分中的重量百分比以及培养基的润水量如表1所示。其中，麸皮、豆粕和米糠的细度均为40目，每片培养基的质量为0.9-1.5g；培养基的直径为10-15mm，培养基厚度为5-10mm。
实施例1～4用于微生物固态通量发酵的培养基的制备方法为：
(1)将麸皮、豆粕、小麦粉碎至40目的细度；
(2)按比例称取经步骤(1)处理的培养基中的各固体组分，混合后加入水，再混合均匀，进行压片处理，得到所述培养基；压片处理时，压片机的压力为5-10kn。
表1
表1中，麸皮、豆粕和米糠的重量百分比是指它们在固体组分中的重量百分比，即各组分的重量占麸皮、豆粕和米糠重量之和的百分比。
实施例5不同的原料配比及润水量对培养基成片的影响
本实施例按照实施例1～4培养基的制备方法，采用不同配比的原料制备了培养基(培养基由固体组分和水组成)，并比较了原料配比及润水量对培养基成片的影响，其结果如表2所示。
从表2可以看出通过多次复合配比试验，培养基中的固体组分由70％-90％麸皮、5％-20％豆粕和5％-15％米糠组成，各原料的质量百分比之和为100％，同时润水量达到20％-30％条件下所获得培养基配方以及压片工艺的应用效果最好。
表2原料配比及润水量对培养基成片的影响
实施例6本发明培养基在米曲霉中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
本实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成：麸皮：豆粕：米糠＝80％：10％：10％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝7:3)，混匀后使培养基的润水量保持在30％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为10kn，压片直径在10mm，培养基厚度为6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为1g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成1g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入40％(1g加入0.4ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为100％(按质量比，例如0.7g固态培养基需拌水0.7ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌30min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.7g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：将在豆汁培养基上培养3天的沪酿3.042菌种(海天保藏)使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基并拌匀，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间48小时。本次试验的通气流量控制为：在13小时之前通气量为0.3m3/h，在13小时到20小时之间通气量为0.8m3/h，在20小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。在酶活测定时需要对获得发酵浸提酶液进行30倍稀释。
2.3、实验结果分析
2种培养基小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到曲料的形态、曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表3所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为4638.31U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为4640.18U/g，与培养基1的中性蛋白酶活几乎相同，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.99％，而培养基2的RSD值为3.18％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表3米曲霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
实施例7本发明培养基在黑曲霉中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成：麸皮：豆粕：米糠＝70％：15％：15％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝8:2)，混匀后使培养基的润水量保持在20％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为10kn，压片直径在10mm，培养基厚度为6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为1.2g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成1.2g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入40％(1.2g加入0.48ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为75％(按质量比，例如0.96g固态培养基需拌水0.72ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌30min，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.96g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：将在PDA培养基上培养3天的黑曲霉AS3.350菌种(海天保藏)使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间44小时。本次试验的通气流量控制为：在12小时之前通气量为0.3m3/h，在12小时到18小时之间通气量为0.8m3/h，在18小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。
2.3、实验结果分析
小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料形态、曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表4所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为1825.36U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为1826.52U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.67％，而培养基2的RSD值为2.75％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表4黑曲霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
实施例8本发明培养基在毛霉中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
本实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成：麸皮：豆粕：米糠＝75％：15％：10％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝0.75:0.25)，混匀后使培养基的润水量保持在25％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为10kn，压片直径在10mm，培养基厚度为6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为1g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成1g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入35％(1g加入0.35ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为80％(按质量比，例如0.75g固态培养基需拌水0.6ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌30min后，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.75g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：将在PDA培养基上培养5天的毛霉ZG701(GDMCC NO：60183)菌种使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间60小时。本次试验的通气流量控制为：在14小时之前通气量为0.3m3/h，在14小时到24小时之间通气量为0.8m3/h，在24小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板的进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。
2.3、实验结果分析
小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态及曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表5所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为1688.51U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为1688.89U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.27％，而培养基2的RSD值为2.16％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表5毛霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
实施例9本发明培养基在根霉中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
本实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成：麸皮：豆粕：米糠＝70％：20％：10％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝8:2)，混匀后使培养基的润水量保持在20％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为5kn，压片直径在10mm，培养基厚度为6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为0.9g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成0.9g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入40％(0.9g加入0.36ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为75％(按质量比，例如0.72g固态培养基需拌水0.54ml)，拌料混匀后静止放置2小时后，121℃高压灭菌30min后，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.7g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：将在PDA培养基上培养4天的根霉ZH805(GDMCC NO：60200，海天保藏)菌种使用无菌生理盐水洗脱孢子后，接种到固态曲料培养基，接种量控制在107个孢子/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间48小时。本次试验的通气流量控制为：在16小时之前通气量为0.3m3/h，在16小时到24小时之间通气量为0.8m3/h，在24小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板的进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提2小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。
2.3、实验结果分析
小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到曲料的形态及曲香味正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，如实验结果表6所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为2018.99U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为2017.56U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.97％，而培养基2的RSD值为3.79％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表6根霉不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
实施例10本发明培养基在芽孢杆菌固态发酵中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
本实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成：麸皮：豆粕：米糠＝90％：5％：5％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝7:3)，混匀后使培养基的润水量保持在30％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为10kn，压片直径在10mm，充填深度在6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为1.5g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成1.5g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入35％(1.5g加入0.525ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为93％(按质量比，例如1.05g固态培养基需拌水0.975ml)，拌料混匀后静止放置3小时后，121℃高压灭菌30min后，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照1.05g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：使用LB液态培养基培养枯草芽孢杆菌AS1398，30℃条件下200rpm培养24小时后，离心收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤菌体后并重悬，接种到固态曲料培养基，接种量控制在108个细胞/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间36小时。本次试验的通气流量控制为：在8小时之前通气量为0.3m3/h，在8小时到16小时之间通气量为0.8m3/h，在16小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提1小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。
2.3、实验结果分析
小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到的曲料的形态正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表7所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为4956.77U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为4957.12U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.65％，而培养基2的RSD值为2.42％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表7枯草芽孢杆菌不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
实施例11本发明培养基在酵母菌菌固态发酵中的应用
1、多孔发酵装置
参考专利CN 107446804A专利所述的固态通量培养装置。
2、实验材料与方法
2.1、培养基成分与制作方法
本实例所使用的培养基原材料包括麸皮、豆粕、米糠均来源于佛山市海天调味食品有限公司的原料仓库；麸皮、豆粕、小麦需要通过机械破碎并且达到40目的细度。
培养基1组成是由以下原料按质量百分比组成，麸皮：豆粕：米糠＝80％：15％：5％。
培养基2的制作方法：培养基1加入一定量自来水(培养基1固料与自来水的质量比＝7:3)，混匀后使培养基的润水量保持在30％，使用的压片机为国产常用小型台式电动连续冲压机进行压片，压片压力为10kn，压片直径在10mm，充培养基厚度为6mm，压片为圆片状，压片后培养基的重量为1.2g，每批次压片培养基的片状培养基重量RSD偏差不超过5％。
2.2培养基在多孔发酵装置中的应用方式
压片培养基2的应用方式：将压片成1.2g圆片质量的培养基分装到CN107446804A专利所述的固态通量培养装置中，121℃高压灭菌30min处理冷却后，在无菌条件下按照压片培养基的起始重量每孔用排枪加入35％(1.2g加入0.42ml)的无菌水后，即可接种。
非压片培养基1：将固态培养基按原料配比混匀后，拌水为93％(按质量比，例如0.84g固态培养基需拌水0.78ml)，拌料混匀后静止放置3小时后，121℃高压灭菌30min后，冷却分装到小型固态通量培养24孔板中，按照0.84g干料/孔在无菌条件下进行称重分装。
培养条件：使用麦芽汁液态培养基培养鲁氏酵母HT.Y309，30℃条件下200rpm培养24小时后，离心收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤菌体后并重悬，接种到固态曲料培养基，接种量控制在108个细胞/克干曲料，丝状真菌小型固态通量的培养装置整体放置在30℃恒温环境中进行培养，培养时间48小时。本次试验的通气流量控制为：在14小时之前通气量为0.3m3/h，在14小时到26小时之间通气量为0.8m3/h，在26小时到发酵结束通气量控制在1m3/h。
小型固态通量发酵酶液的获得：固态发酵结束后，拔下24孔板的进气口的通气管路，并将24孔的每个进气口使用鲁尔堵头进行封闭，并将固态培养孔板放入自制固态孔板适配器中并加入5ml的0.85％的生理盐水，在40℃条件下，700rpm振荡抽提1小时，4000rpm离心20min，收集上清。
中性蛋白酶活力检测方法：固态通量发酵中性蛋白酶测定是参照中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法(SB/T 10317-1999)进行，只是按照比例缩小后，可适用于96孔酶标板(美国Corning公司)的微量反应体系，结合8孔多通道排枪(德国eppendrof公司)和酶标仪(德国Berthold TriStar LB941)进行通量化检测。
2.3、实验结果分析
小型固态发酵结束后，进行曲料培养状态观察和中性蛋白酶测定，固态培养得到曲料的形态正常，同时对小型固态发酵进行酶活测定，实验结果如表8所示，培养基1的平均中性蛋白酶酶活为450.69U/g，培养基2的平均中性蛋白酶酶活为451.31U/g，同时培养基1的中性蛋白酶活力的RSD值为4.81％，而培养基2的RSD值为2.40％，低于培养基1，这说明通过压片方法获得培养基更能稳定的获得发酵结果。
表8酵母菌在不同培养基条件下中性蛋白酶活力比较
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种培养基在用于微生物固态通量发酵中的应用，其特征在于，所述培养基为片状；所述培养基由固体组分和水组成，所述培养基的固体组分由下述重量百分比的组分组成：麸皮70％-90％，豆粕5％-20％，米糠5％-15％；所述培养基的润水量为20％-30％；所述应用包括以下步骤：
(a)将培养基置于固态通量培养装置中，灭菌处理后冷却；
(b)向经步骤(a)处理的培养基中加入无菌水，并将微生物接入培养基中，将微生物与培养基混合均匀，进行发酵培养。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述麸皮、豆粕和米糠的细度均为40目以上。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，每片所述培养基的质量为0.9-1.5g。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基为圆片状。
5.如权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述培养基的直径为10-15mm，厚度为5-10mm。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述培养基的制备方法包括以下步骤：按比例称取培养基中的各固体组分，混合后加入水，再混合均匀，进行压片处理，得到所述培养基。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述压片处理时，压片机的压力为5-10kn。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉、枯草芽孢杆菌或酵母菌。
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