CN110144298A - 一种新型米根霉菌株g1及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型米根霉菌株G1及其培养方法和应用，分类号命名为Rhizopus oryzae，保藏编号为CCTCC M 2019425；培养时，将米根霉菌株G1接种到培养基中培养获得一级种培养物；再将上述一级种培养物接种到固体培养基中发酵培养获得二级种培养物，即培养完成；本发明的米根霉菌株G1的培养基配方简单、培养条件温和，易于控制，有利于工业大规模生产成本的节约；得到的米根霉菌株G1糖化性能显著提升，使菌株的糖化力从原有培养基的25.94g/100g提高到31.22g/100g，提高了20%，将其配制于酒曲中有利于酒率的提升，有利于规模化生产，对提升该菌株的工业应用潜力具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种新型米根霉菌株G1及其培养方法和应用。
背景技术
米根霉在分类学上属于真核生物界的毛霉目、毛霉科中的根霉属，是自然界中广泛存在的一类真菌，是经过美国食品药品监督管理局认证的安全菌株。米根霉能够利用不同的化合物和多糖作为能源和碳源，所需营养简单，因此能够产生许多代谢产物，主要有酶类、脂类、有机酸、风味物质、聚合物和生物乙醇等。米根霉的代谢产物如乳酸、富马酸、L-苹果酸及消化酶等有重要的经济价值，广泛用于食品、医药及饲料等行业。米根霉可产生淀粉酶、糖化酶，其淀粉液化力强，能作用原料产生酒精和芳香脂类物质，是酿酒工业的重要菌种。
但是米根霉比较娇嫩，生长速度较慢。由于含有丰富的糖化型淀粉酶，因此对碳源的利用较广。但是米根霉缺乏酸性蛋白酶，对氮源要求比较严格，喜欢有机氮源。一旦缺乏有机氮，则会影响菌丝的生长和产酶酶活或导致菌种退化。实际生产中，随着米根霉传代次数的增加以及培养条件不合适，导致米根霉退化现象较频繁。为降低生产成本及提高生产效率，米根霉的培养基的营养成分、生长温度等因素对其是否能发挥最大的产酶生理活性、生产出优质高产的酒曲起着至关重要的作用。因此，对米根霉的生长及糖化性能进行系统研究是非常有必要的。微生物菌株的高产特性除其遗传特性决定外，其所处环境条件对其生长以及代谢途径也有很大的影响。在生产上，为了最大限度地发挥菌种的生产能力，必须提供较好的发酵培养基和培养条件。否则，即使有了优良菌株，菌种的生产能力也不能充分体现。因此，探索菌株高产特性充分表达的最佳培养条件是发酵生产的基础与关键。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新型米根霉菌株G1及其培养方法和应用，本发明的培养方法生长速度快、菌体生长营养要求简单，可以获得高产糖化力性能，为大规模推广应用奠定了基础。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的一种新型米根霉菌株G1，其分类号命名为Rhizopus oryzae，保藏编号为CCTCC M 2019425。
本发明还提供了一种新型米根霉菌株G1的培养方法，包括以下步骤：
（1）将米根霉菌株G1接种到培养基中进行培养获得一级种培养物；
（2）将上述一级种培养物接种到固体培养基中进行发酵培养获得二级种培养物，即培养完成。
优选地，本发明中所述步骤（1）中培养基培养的条件为25-33℃，静置培养，培养时间为48-72h。
优选地，本发明中所述步骤（1）中培养基的组成为：向麸皮汁培养基中添加葡萄糖、酵母粉和琼脂，所述麸皮汁培养基中葡萄糖、酵母粉和琼脂的质量分数分别为2%、0.3%和2%，调整麸皮汁培养基的pH值为6.5。
进一步地，本发明中所述麸皮汁培养基的制备过程为：按照质量比称取麸皮1份和水4份，将二者搅拌混匀后于100℃蒸煮10min，冷却后，向混合物中加入质量分数均为1%的酸性蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，于60℃水浴保持3-4h，过滤取上清液，并用水将上清液的糖度调节至5 oBx即可。
优选地，本发明中所述步骤（2）中发酵培养的条件为：温度25-33℃，静置培养，时间为72h。
优选地，本发明中所述步骤（2）中固体发酵培养基中包括麸皮、硫酸铵和葡萄糖，所述麸皮、硫酸铵和葡萄糖的质量比为1000：5：40，培养基的含水量为60%，pH自然。
本发明还提供了一种新型米根霉菌株G1的应用。
本发明的米根霉菌株G1是从清香型小曲中筛选得到，经实验验证该菌株具有高产糖化力的特点，具有糖化力高、培养基易于配制、节约生产成本等优点。本发明摸索到的发酵培养条件，使糖化力从原有培养基的25.94g/100g提高到31.22g/100g，提高了20%，具有高产糖化力的优点，有利于规模化生产，对提升该菌株的工业应用潜力有重大的意义。
附图说明
图1是不同的培养基培养米根霉菌株G1宏观形态图；
图2是不同的培养基对米根霉菌株G1产糖化力的影响；
图3是不同碳源对米根霉菌株G1生长情况的影响；
图4是不同碳源对米根霉菌株G1产糖化力的影响；
图5是不同氮源对米根霉菌株G1生长情况的影响；
图6是不同氮源对米根霉菌株G1产糖化力的影响；
图7是正交试验对米根霉菌株G1生长情况的影响；
图8是正交试验对米根霉菌株G1产糖化力的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例的一种新型米根霉菌株G1，其分类号命名为Rhizopus oryzae，保藏编号为CCTCC M 2019425。
本实施例一种新型米根霉菌株G1的培养方法，包括以下步骤：
1. 一级种培养物的培养
1.1一级种培养基的配制
按照质量比称取麸皮1份、水4份，将二者搅拌混匀后于100℃蒸煮10min，冷却后，向混合物中加入质量分数均为1%的酸性蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，于60℃水浴保持3-4h，过滤即得麸皮汁培养基，用水将培养基的糖度调节至5 oBx。再向麸皮汁培养基中添加葡萄糖、酵母粉和琼脂，所述麸皮汁培养基中葡萄糖、酵母粉和琼脂的质量分数分别为2%、0.3%和2%，调整麸皮汁培养基的pH值6.5，即得一级种培养基。
1.2 一级种培养物的培养
将上述配置好的一级种培养基在121℃灭菌20min，冷却后，在无菌超净台中将培养基倒入无菌平皿中，待冷却凝固后，每个平皿中接入米根霉菌株G1菌丝，置于恒温培养箱中进行培养，培养条件为：温度30℃，静置培养，培养2-3天即可得到一级种培养物。
2. 二级种培养物的培养
2.1 固体培养基的配制
按照质量比为1000:5:40称取麸皮、硫酸铵和葡萄糖，制成含水量为60%的培养基，pH自然。取培养基15g加至150mL的三角瓶中，在121℃灭菌30min，冷却至常温，即可得到固体培养基。
将一级种培养物接种至固体培养基中进行发酵培养，发酵温度为30℃，静置培养，培养3天后获得米根霉菌株二级种。
实施例2
本实施例的糖化力的测定采用化饭法，糖化力表示每克小曲糖化100g大米饭24h所生成的葡萄糖的克数，单位为g/100g。
裴林试剂甲溶液：称取34.8g硫酸铜（CuSO4.5H2O）及0.05g次甲基兰，溶于水中并稀释至1000mL备用。
裴林试剂乙溶液：称取116.0g酒石酸钾钠及126.4g氢氧化钠，溶于水中，再加入9.2g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃瓶内备用。
0.1%标准葡萄糖溶液：精密称取1.000g经过98-100℃干燥至恒重的纯葡萄糖，加水溶解后加入5mL盐酸，再用水稀释至1000mL备用。
称取100g早籼米于不锈钢饭碗中，用水清洗3次，沥干后加水100mL，盖上碗盖，置于高压蒸汽灭菌锅中，在121℃下蒸10min，放汽后取出，趁热用干净筷子将饭团打散，再搅拌使饭冷却至30℃。称取实施例1中制备的1.0g固态米根霉菌株二级种迅速接种冷却至30℃的米饭中拌匀，盖上碗盖，置于30℃培养箱中培养24h，即可得到糖化醪。与此同时，进行一个不接种的空白样。
采用星点取样法，称取10.0g糖化醪于250mL烧杯中，加水100mL，搅匀后置于30℃的摇床中，150rpm摇30min，即可得到待测样，空白样的制备方法与此相同。
吸取裴林试剂甲、裴林试剂乙溶液各5.0mL置于150mL锥形瓶中，加入上述待测样上层液1.0mL，再加入7-8mL 0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，在电炉上加热，使其在2min内沸腾，沸腾10s后，以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色消失即为终点。此滴定应在1min内完成，记录沸腾前后共耗用的标准葡萄糖溶液毫升数V，做两次平行测定，两次结果相差不得超过0.5mL，得出平均耗用标准葡萄糖溶液毫升数V，空白样耗用的标准葡萄糖溶液毫升数为V0。
糖化力按下列公式进行计算：
糖化率=( V0-V)×C×100/1×200/10
式中：
V0——空白样滴定耗用的0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）；
V——待测样滴定耗用的0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL）；
C——0.1%葡萄糖标准液含葡萄浓度(0.001g/mL)；
100/1——1mL稀释样换算成100mL稀释样；
200/10——10g糖化米饭换算成200g糖化米饭；计算结果表示到小数后一位。
为考察不同的培养基对米根霉菌株G1产糖化力的影响，还通过改变一级种培养基的种类及其组成进行了一系列的对比实施例，将米根霉菌株G1接种至以下不同的一级种培养基中。以下是7种一级种培养基：
（1）﹟1：米曲汁琼脂培养基，取800g种曲，加入50g糖化酶，在55℃糖化24h，待糖度降至5oBx，向其中加入琼脂至其质量分数为2%，将pH调到6.0即可；
（2）﹟2：高粱汁琼脂培养基，将高粱粉碎后，加入高粱重量4倍的水，混匀后在100℃下蒸煮30min，冷却后加入高粱重量的1%糖化酶和1%淀粉酶，60℃糖化过夜，过滤，滤液稀释到10oBx，向其中加入琼脂至其质量分数为2%即可；
（3）﹟3：麦芽汁琼脂培养基，取10g麦芽浸粉加水100mL溶解后，使糖度达10 oBx，向其中加入琼脂至其质量分数为2%即可；
（4）﹟4：YPD琼脂培养基，向培养基中加入葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和琼脂，使培养基中葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和琼脂的质量分数分别为2%、1%、2%和2%；
（5）﹟5：葡萄糖甘油琼脂培养基，所述培养基中包括葡萄糖4g、乳糖6g、甘油10g、硫酸铵1g、酵母粉3g、KH2PO4 0.4g、MgSO4·7H2O 0.3 g、ZnSO4 0.1g、FeSO4·7H2O 0.25g、NaCl 30g和琼脂20g，混匀后即可；
（6）﹟6：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，所述培养基中包括马铃薯（去皮）200g、琼脂20.0g和葡萄糖20.0g；
（7）﹟7：孟加拉红琼脂培养基，购于上海国药集团。
将上述7种培养基，在121℃灭菌20min，将米根霉菌株G1菌丝分别接种至培养基中，每天观察菌种的生长情况，培养1天后各培养基菌丝生长情况如表1所示：
表1 不同培养基培养米根霉菌株G1培养1天的生长情况
由表1可知，本发明实施例1的培养基（﹟8）、米曲汁琼脂培养基（﹟1）和YPD琼脂培养基（﹟4）米根霉菌株G1培养基背面有褶皱，其余无；米根霉菌株G1在实施例1培养基（﹟8）、米曲汁琼脂培养基（﹟1）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（﹟6）和YPD琼脂培养基（﹟4）中气生菌丝生长茂密且生长较快，其余培养基培养米根霉菌株G1气生菌丝稀疏，而在孟加拉红琼脂培养基（﹟7）和葡萄糖甘油琼脂培养基（﹟5）中生长缓慢。培养3天后米根霉菌株G1生长情况见附图1，气生菌丝茂密程度顺序为：米曲汁琼脂培养基（﹟1）≥实施例1培养基（﹟8）＞YPD琼脂培养基（﹟4）＞马铃薯葡萄糖琼脂培养基（﹟6）＞孟加拉红琼脂培养基（﹟7）＞麦芽汁琼脂培养基（﹟3）＞高粱汁琼脂培养基（﹟2）＞葡萄糖甘油琼脂培养基（﹟5）。
将上述一级种培养基培养3天后菌丝接种至固体培养基中，培养3天后烘干获得固态纯种米根霉菌株二级种，测定糖化力，试验结果如图2所示。米根霉菌株G1在实施例1培养基（麸皮汁培养基）中糖化力最高，其次是在米曲汁琼脂培养基（﹟1）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（﹟6）中糖化力相当，再是麦芽汁琼脂培养基（﹟3）、葡萄糖甘油琼脂培养基（﹟5）、YPD琼脂培养基（﹟4）和高粱汁琼脂培养基（﹟2），而孟加拉红培养基（﹟7）培养的米根霉菌株G1糖化力最低。
实施例3
本实施还选择了几种不同的碳源培养基作为对比，米根霉菌株G1完全合成培养基：蔗糖100g、MgSO4·7H2O 0.5 g、硫酸铵3g、FeSO4 0.1g、KH2PO4 2g、蒸馏水1000mL。以霉菌完全合成培养基为基础，将培养基组成中的碳源（即蔗糖）分别用淀粉（﹟1）、低聚果糖（﹟2）、蔗糖（﹟3）、海藻糖（﹟4）、葡萄糖（﹟5）、乳糖（﹟6）、和甘油（﹟7）代替，考察不同的碳源对米根霉菌株G1产糖化力的影响。培养3天后米根霉菌株的生长情况如图3所示，以淀粉（﹟1）为碳源的培养基，米根霉菌株生长最旺盛，其次是以低聚果糖（﹟2）为碳源，而以乳糖（﹟6）和甘油（﹟7）为碳源时米根霉菌株菌丝稀疏生长较差。由此可见，气生菌丝茂密程度顺序为：淀粉（﹟1）＞低聚果糖（﹟2）＞蔗糖（﹟3）＞海藻糖（﹟4）≥葡萄糖（﹟5）＞乳糖（﹟6）＞甘油（﹟7）。
将上述不同碳源一级种培养基培养米根霉菌株G1，3天后将得到的一级种培养物接种至麸皮发酵培养基中，培养3天后烘干获得固态纯种米根霉菌株二级种，测定糖化力。结果如图4所示，以淀粉、低聚果糖和葡萄糖为碳源培养的米根霉菌株的糖化力最高，以乳糖为碳源的糖化力最低，相差3个点。
实施例4
本实施还选择了不同的氮源培养基作为对比，米根霉菌株G1完全合成培养基：蔗糖100g、MgSO4·7H2O 0.5 g、硫酸铵 3g、FeSO4 0.1g、KH2PO4 2g、蒸馏水1000mL。以霉菌完全合成培养基为基础，将培养基组成中的氮源（即硫酸铵）分别用酵母浸粉（﹟1）、蛋白胨（﹟2）、牛肉膏（﹟3）、硫酸铵（﹟4）、柠檬酸铵（﹟5）、磷酸氢二铵（﹟6）和硝酸钠（﹟7）代替，考察不同的氮源对米根霉菌株G1产糖化力的影响。培养3天后米根霉生长情况如图5所示，以硝酸钠（﹟7）为氮源培养米根霉菌株G1无生长，而用有机氮源培养菌丝生长茂密程度高于无机氮源。且文献报道相比于无机氮源，米根霉菌株更喜欢利用有机氮源。气生菌丝茂密程度顺序为：酵母粉（﹟1）≥蛋白胨（﹟2）＞牛肉膏（﹟3）＞硫酸铵（﹟4）＞柠檬酸铵（﹟5）＞磷酸氢二铵（﹟6）＞硝酸钠（﹟7）。
将以上不同氮源一级种培养基培养米根霉菌株G1，3天后将得到的一级种培养物接种至麸皮发酵培养基中，培养3天后烘干获得固态纯种根霉二级种，测定糖化力。结果如图6所示，以蛋白胨和牛肉膏为氮源培养的米根霉菌株G1的糖化力最高，其次是以酵母粉为氮源，糖化力最低的是以硫酸铵为氮源培养的，糖化力最高和最低相差4个点。且以有机氮源培养的根霉1号糖化力明显高于无机氮源培养。
实施例5
本实施还通过正交试验确定米根霉菌株G1最佳产糖化力培养基的组成，根据上述实施例3-4单因素试验，从氮源、碳源、培养基、pH值设计4因素3水平正交试验，并以原有生产使用的米曲汁琼脂培养基为对照，以糖化力为指标，确定米根霉菌株G1生长及产糖化力最佳培养基组成，具体的正交试验方案如下表2所示。
表2 米根霉菌株G1培养基组成正交试验
将米根霉菌株G1菌丝分别接种至以上正交试验方案所配置的培养基中，培养3天后，各条件下米根霉菌株G1生长情况如图7所示，气生菌丝茂密程度顺序为：麸皮汁+酵母粉+葡萄糖，pH值6.5（实验组﹟7）＞米曲汁+蛋白胨+葡萄糖，pH值5.5（实验组﹟1）≥米曲汁（对照组）＞米曲汁+牛肉膏+果糖，pH值5.5（实验组﹟6）＞土豆+蛋白胨+淀粉，pH值6.0（实验组﹟2）＞麸皮汁+牛肉膏+淀粉，pH值6.5（实验组﹟5）＞土豆+牛肉膏+葡萄糖，pH值6.0（实验组﹟4）＞米曲汁+酵母粉+淀粉，pH值5.5（实验组﹟8）＞麸皮汁+蛋白胨+果糖，pH值6.5（实验组﹟3）＞土豆+酵母粉+果糖，pH值6.0（实验组﹟9）。
将以上正交试验培养基中培养3天后的米根霉菌株G1菌丝接种至麸皮发酵培养基中，培养3天后烘干获得固态纯种根霉二级种，测定糖化力。结果如图8所示，麸皮汁+酵母粉+葡萄糖，pH值6.5（实验组7）糖化力最高，其次是米曲汁+蛋白胨+葡萄糖，pH值5.5（实验组1），糖化力最低的为米曲汁+牛肉膏+果糖，pH值5.5（实验组6），其余实验组糖化力相当且均比对照高。确定米根霉1号最佳培养组合为麸皮汁+酵母粉+葡萄糖，pH值6.5。
利用spss19软件对正交试验结果进行方差分析，对糖化力影响程度从大到小依次为：碳源＞氮源＞培养基种类=pH值。根据均值的大小，得出的最佳组合为蛋白胨+葡萄糖+麸皮汁，pH值为6.5。此组合不在表2的正交试验方案中，将米根霉菌株G1分别接种至正交试验与方差分析确定的组合，并以米曲汁琼脂培养基为对照，培养出的菌丝制备成二级种，测定糖化力，以确定米根霉菌株G1一级种最佳的培养基组成。结果见表3。
表3 米根霉菌株G1一级种最佳培养基组成确定
由表3可知，培养基组成为酵母粉+葡萄糖+麸皮汁，pH值 6.5培养出的米根霉均株糖化力最高，比其他两种糖化力高5-6个点，而其他两种糖化力无差异。因此，确定米根霉菌株G1高产糖化力的最佳的培养基组成为：2%的葡萄糖，0.3%的酵母粉，2%琼脂添加至麸皮汁中，调整pH值6.5。
实施例6
本实施例还对不同来源霉菌的糖化力进行了比较，将实验室分离获得不同来源霉菌菌株，接种至麸皮培养基中培养，待菌丝长满整个麸皮表面时，取出烘干。采用化饭法进行糖化力的检测，结果如下表4，不同来源的米根霉糖化力有所差异，具体表现为米根霉G1菌株糖化力最高，其次是YF1菌株。而文献报道的有一定糖化能力的棒曲霉和红曲霉糖化力较低，因此确定本发明的米根霉G1菌株为产糖化力性能优良的菌株。
表4 不同的菌株产糖化力的结果
Claims (8)
1.一种新型米根霉菌株G1，其特征在于：其分类号命名为Rhizopus oryzae，保藏编号为CCTCC M 2019425。
2.如权利要求1所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将米根霉菌株G1接种到培养基中进行培养获得一级种培养物；
（2）将上述一级种培养物接种到固体培养基中进行发酵培养获得二级种培养物，即培养完成。
3.根据权利要求2所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中培养基培养的条件为25-33℃，静置培养，培养时间为48-72h。
4.根据权利要求2所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于：所述步骤（1）中培养基的组成为：向麸皮汁培养基中添加葡萄糖、酵母粉和琼脂，所述麸皮汁培养基中葡萄糖、酵母粉和琼脂的质量分数分别为2%、0.3%和2%，调整麸皮汁培养基的pH值为6.5。
5. 根据权利要求4所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于：所述麸皮汁培养基的制备过程为：按照质量比称取麸皮1份和水4份，将二者搅拌混匀后于100℃蒸煮10min，冷却后，向混合物中加入质量分数均为1%的酸性蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，于60℃水浴保持3-4h，过滤取上清液，并用水将上清液的糖度调节至5 oBx即可。
6.根据权利要求2所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中发酵培养的条件为：温度25-33℃，静置培养，时间为72h。
7.根据权利要求2所述的一种新型米根霉菌株G1的培养方法，其特征在于：所述步骤（2）中固体发酵培养基中包括麸皮、硫酸铵和葡萄糖，所述麸皮、硫酸铵和葡萄糖的质量比为1000：5：40，培养基的含水量为60%，pH自然。
8.如权利要求1所述的一种新型米根霉菌株G1的应用。
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