CN110305749A - 一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用 - Google Patents

一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于白酒技术领域，公开了一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，所述麸曲的制备步骤包括酵母种子液的制备和将酵母种子液接种到酵母固态培养基中，发酵过程中所用的产酯酵母是从大曲中分离所得，编号为Njsys‑YT1。本发明还公开了一种利用产酯酵母制作麸曲的方法的应用，将糯高粱经浸泡、蒸煮、糖化后，以2％酵母麸曲量添加到糖化24h后的高粱甜糟中，发酵6天。本发明以产酯酵母为出发菌株，配制纯种酵母麸曲，并优化了酵母麸曲培养条件工艺。本发明将脚酵母麸曲应用于清香型小曲白酒中，白酒中乙酸乙酯和总酯的含量明显提高，对清香型小曲白酒的品质提高发挥了重要作用。

Description

一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用
技术领域
本发明属于白酒技术领域，具体涉及一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用。
背景技术
产酯酵母也叫生香酵母，是指对醇、酸有酯化能力的酵母菌，是发酵行业里的一大重要资源。产酯酵母具有很强的氧化性和酯化性，它能利用还原糖，产生酯类物质，能丰富产品中的风味成分而提高产品质量，甚至形成独特的香味风格。因此，产酯酵母被广泛的应用于发酵食品中，如酒类、食醋、酱油等。
麸曲制作属熟料制曲范畴。麸曲作为白酒生产中的糖化发酵剂，其质量直接关系到今后白酒的生产和酒质的好坏。酵母麸曲是以麸皮为主要原料，蒸熟后接入纯种酵母，人工控制培养条件的散曲，其在白酒的生产中主要起发酵产酒产香的作用。现阶段，多数采用将霉菌、酵母应用到麸曲中，用小曲与麸曲混合的方法来提高小曲白酒的品质。专利号CN103320270A中公开了一种利用根霉菌株、酵母菌株制作麸曲配合大曲生产基酒的方法及药酒，专利号 CN106479832A中公开了一种大麸曲清香型白酒的生产方法。专利号CN105132298A公开了一株促进固态发酵糟醅产乙酸乙酯的酵母及其应用。
清香型小曲白酒是我国的主要酒种之一，乙酸乙酯、乳酸乙酯、高级醇是构成清香型小曲酒的主体香成分。添加酵母麸曲可显著提高酒中乙酸乙酯的含量，增加酯香，改善小曲酒的品质。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用。
本发明所采用的技术方案为：
一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，包括步骤：将产酯酵母种子液接种到酵母固态培养基中发酵培养，所述产酯酵母种子液中的产酯酵母是从大曲中分离所得，编号为Njsys-YT1。
更进一步的，所述产酯酵母为异常汉逊酵母，所述异常汉逊酵母的菌种保藏号为CGMCC No.8743，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2014年1月17日。本发明以产酯酵母(异常汉逊酵母Hansenula anomala) 为出发菌株，配制纯种酵母麸曲，优化其培养条件工艺，研究该酵母麸曲在清香型小曲白酒发酵中的产香促进作用。本发明的异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的形态学特征：单菌落呈圆形状，其表面光滑，湿润，黏稠，边缘整齐无缺裂，菌落颜色呈乳白色，用针容易挑起，菌落质地均匀，正、反面及中央与边缘的颜色一致，有很浓厚的水果芳香和酒香味。用100倍物镜观察：细胞呈椭圆形或球形，以芽殖(两端出芽)方式生长。本发明筛选到一株产酯酵母，该菌株具有良好的产乙酸乙酯和乙醇的能力，可广泛应用于白酒、果酒等酿造行业。
所述产酯酵母的筛选方式为：将大曲、糟醅或酿酒原料用研钵研磨得到粉末，然后称取25g粉末放入盛有225mL无菌生理盐水的试剂瓶中，利用漩涡混匀器震荡得到溶液，再将溶液涂布于初筛培养基，挑选透明圈直径和菌落直径比较大菌落即产酯显著菌株，再将菌株转接，进行摇瓶发酵复筛，测定发酵液中总酯含量，筛选获得产酯能力强的菌株。
初筛培养基：蛋白胨2％(m/v)、葡萄糖2％(m/v)、酵母膏1％(m/v)，琼脂2％(m/v)、三丁酸甘油酯0.4％(m/v)，用去离子水配制1000mL，自然 pH，28～30℃培养1～3天，根据透明圈直径和菌落直径之比判断产酯性能。
摇瓶发酵培养条件为：将高粱糖化液调节pH至5.0，在25-35℃、150rpm 条件下摇瓶培养24-120h。
高粱糖化液的制备为：50g高粱经粉碎后，加2-6倍体积的水，蒸煮0.5-2h，呈糊状，冷却后加入α-淀粉酶(6-8U/g原料)，于60℃水浴0.5-2h液化，液化完成后用1mol/L的盐酸调节pH至4.0，然后加入糖化酶60℃(60-100U/g原料)， 60℃水浴，糖化完全，过滤、离心，收集上层清液，该清液即为高粱糖化液。
更进一步的，所述产酯酵母的液态发酵代谢产物主要为乙酸乙酯和乙醇，所述乙酸乙酯和乙醇的相对百分含量分别为49.008％、32.893％。
更进一步的，所述酵母固态培养基原料包括以重量百分比计算的麸皮50％、鲜酒糟29％、生粉21％。
更进一步的，所述麸曲的制备包括以下步骤：
S1.酵母种子液的制备：从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接入50mL 种子培养基中，置于摇床上在28℃、120r/min的条件下，振荡培养18h，得到酵母种子液；
S2.酵母麸曲制备：将麸皮、鲜酒糟、生粉加入到三角瓶中作为固态培养基，然后将准备好的酵母种子液接种到三角瓶中，搅拌均匀后，用纱布封盖瓶口，培养20-48h，得到酵母麸曲。
更进一步的，上述步骤S2中，酵母接种量为12％，水分添加量40％，培菌时间20-30h，培菌温度30℃。
更进一步的，所述种子培养基为种子YPD培养基，每100ml所述种子YPD 培养基中含葡萄糖2g、酵母膏1g、蛋白胨2g。
上述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法的应用，将糯高粱经浸泡、蒸煮、糖化后，以2％酵母麸曲量添加到糖化24h后的高粱甜糟中，发酵6天。
将上述酵母麸曲应用于清香型小曲白酒中，白酒中乙酸乙酯和总酯的含量明显提高，对清香型小曲白酒的品质提高发挥了重要作用。将本发明的酵母麸曲按清香型小曲白酒常规工艺，在高粱原料经糖化工序24小时后加入，可使酒中的乙酸乙酯的含量提高4倍，总酯的含量提高3倍。
本发明的有益效果为：
本发明以产酯酵母为出发菌株，配制纯种酵母麸曲，并优化了酵母麸曲培养条件工艺。本发明将脚酵母麸曲应用于清香型小曲白酒中，白酒中乙酸乙酯和总酯的含量明显提高，对清香型小曲白酒的品质提高发挥了重要作用。
附图说明
图1本发明的产酯酵母的菌落形态。
图2本发明的产酯酵母的细胞形态。
图3本发明的产酯酵母的液体代谢产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。
实施例1：
本实施例提供一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，包括步骤：将产酯酵母种子液接种到酵母固态培养基中发酵培养，所述产酯酵母种子液中的产酯酵母是从大曲中分离所得，编号为Njsys-YT1。
所述产酯酵母为异常汉逊酵母，所述异常汉逊酵母的菌种保藏号为CGMCCNo.8743。所述产酯酵母的液态发酵代谢产物主要为乙酸乙酯和乙醇，所述乙酸乙酯和乙醇的相对百分含量分别为49.008％、32.893％。
所述酵母固态培养基原料包括以重量百分比计算的麸皮50％、鲜酒糟29％、生粉21％。
所述麸曲的制备包括以下步骤：
S1.酵母种子液的制备：从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接入50mL 种子培养基中，置于摇床上在28℃、120r/min的条件下，振荡培养18h，得到酵母种子液；
S2.酵母麸曲制备：将麸皮、鲜酒糟、生粉加入到三角瓶中作为固态培养基，然后将准备好的酵母种子液接种到三角瓶中，搅拌均匀后，用纱布封盖瓶口，培养20-48h，得到酵母麸曲。
上述步骤S2中，酵母接种量为12％，水分添加量40％，培菌时间20-30h，培菌温度30℃。
所述种子培养基为种子YPD培养基，每100ml所述种子YPD培养基中含葡萄糖2g、酵母膏1g、蛋白胨2g。
上述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法的应用，将糯高粱经浸泡、蒸煮、糖化后，以2％酵母麸曲量添加到糖化24h后的高粱甜糟中，发酵6天。
一、酵母麸曲的麸皮用量确定试验
通过产酯酵母Njsys-YT1在酵母麸曲制作中不同原料配比下的生长情况，从而确定产酯酵母的最佳原料配比。具体方法为：
(1)配制6个麸皮含量梯度的酵母固态培养基：称取麸皮4g、6g、8g、 10g、12g和14g分别加入到250ml的三角瓶中，再向每个三角瓶中加入生粉2g 和鲜酒糟4g，每个三角瓶中水分含量均为20％。将每个三角瓶分别在121℃条件下蒸煮30min。蒸煮之后再将10％的酵母种子液接种到带有不同麸皮量的三角瓶中，搅拌均匀，然后用4层纱布封盖，在温度为24℃条件下静置培养36h，得到酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g酵母麸曲加入装有90mL无菌生理盐水的250mL 三角瓶中，在28℃、120r/min的恒温摇床上震荡20min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取7个样品浓度为10-6的菌悬液100μL于孟加拉红平板计数培养基中，轻涂慢匀，让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃的温度下恒温培养36h，用菌落计数仪计数，结果如表1所示。
表1
从表1中的数据可以看出，麸皮添加量的变化对酵母的影响较小。明显地，当麸皮添加量为6g时，酵母活菌数显著高于其他麸皮添加量。
二、酵母麸曲的鲜酒糟用量确定试验
(1)配制6个鲜酒糟含量梯度的酵母固态培养基：称取鲜酒糟1g、2g、 3g、4g、5g、6g、7g和8g分别加入到250mL三角瓶中，然后向每个装有鲜酒糟的三角瓶中加入麸皮10g、生粉2g，每个三角瓶中水分含量为20％。将所有三角瓶在121℃条件下蒸煮30min。按10％接种量，将酵母种子液接种到含有不同鲜酒糟量的三角瓶中，充分搅拌，用4层纱布封盖。在温度为24℃的恒温培养箱中静置培养36h，得到酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称取10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取8个样品的10-6菌悬液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃的温度下恒温培养36h，用菌落计数仪计数，结果如表2所示。
表2
从表2的数据可以看出，一定量的鲜酒糟有利于酵母麸曲中产酯酵母的生长。当鲜酒糟含量为5g时，酵母活菌数最多，最有利于产酯酵母Njsys-YT1的生长。
三、酵母麸曲的生粉用量确定试验
(1)配制8个生粉梯度的酵母麸曲：称取生粉0g、1g、2g、3g、4g、5g、 6g和7g分别加入到250ml三角瓶中，然后再向每个三角瓶中加入麸皮10g、鲜酒糟4g，每个三角瓶中水分含量为20％。然后将所有三角瓶在121℃条件下蒸煮30min。按10％的接种量，将酵母种子液接种到不同生粉量的三角瓶中，充分混匀，用4层纱布封盖。放置在25℃恒温培养箱中培养36h后得到酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取8个样品浓度为的10-6菌液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃恒温培养箱中培养36h，培养后用菌落计数仪计数，结果如表3所示。
表3
从表3的数据可以看出，少量的生粉有利于酵母麸曲中发酵的酵母生长，当生粉的添加量达到4g时，酵母活菌数最多。
四、不同水分含量对酵母生长量的影响
(1)在8个含水量梯度的三角瓶中制备酵母麸曲：准备水分含量分别为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％的三角瓶，三角瓶的容量为250ml，然后向每个三角瓶中加入麸皮10g、鲜酒糟4g和生粉2g，再按10％的接种量，将酵母种子液接种到不同生粉量的三角瓶中，充分混匀，用4层纱布封盖。放置在25℃恒温培养箱中培养36h后得到酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取8个样品浓度为的10-6菌液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃恒温培养箱中培养36h，培养后用菌落计数仪计数，结果如表4所示。
表4
从表4的数据可以看出，水分含量对酵母麸曲中酵母的生长有一定影响，水分含量升高，酵母麸曲中酵母活菌数的数量呈现上升趋势，当水分含量达到 35％时，酵母活菌数达到峰值。可知，酵母麸曲中单因数水分含量控制在35％左右，更利于酵母的生长。
五、酵母麸曲培菌时间试验
(1)制备6个培养时间梯度的酵母麸曲：准备6个编号为1-6、水分含量为20％的三角瓶，三角瓶的容量为250ml，然后向每个三角瓶中加入麸皮10g、鲜酒糟4g和生粉2g，再按10％的接种量，将酵母种子液接种到不同生粉量的三角瓶中，充分混匀，用4层纱布封盖。放置在25℃恒温培养箱中分别培养12h、 24h、36h、48h、60h和72h后得到不同培养时间梯度下的酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取6个样品浓度为的10-6菌液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃恒温培养箱中培养36h，培养后用菌落计数仪计数，结果如表5所示。
表5
从表5中的数据可以看出，培养时间在24h时培养时间继续增加，麸曲中酵母数量下降并能维持在一定数量值上，此时酵母生长稳定。以酵母活菌数为指标，酵母麸曲的最佳培养时间为24h左右。
六、酵母麸曲培菌温度试验
(1)制备7个培养温度梯度的酵母麸曲：准备6个编号为1-6、水分含量为20％的三角瓶，三角瓶的容量为250ml，然后向每个三角瓶中加入麸皮10g、鲜酒糟5.8g和生粉4.2g，再按10％的接种量，将酵母种子液接种到不同生粉量的三角瓶中，充分混匀，用4层纱布封盖。分别放置在温度为12℃、16℃、20℃、 24℃、28℃、32℃和36℃恒温培养箱中分别培养36h后得到不同培养温度梯度下的酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取7个样品浓度为的10-6菌液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃恒温培养箱中培养36h，培养后用菌落计数仪计数，结果如表6所示。
表6
微生物曲最讲究控温工艺，温度为曲药培菌的一大重要指标。从表6中的数据可以看出，随着温度上升，麸曲中酵母的活菌数逐渐上升，当温度达到28℃时，其活菌数最多可达到1.69×108cfu/g；随着温度的继续上升，酵母菌数量逐渐下降。因此酵母麸曲的最佳培养温度为28℃左右。
七、酵母接种量确定试验
(1)制备6个酵母接种量梯度的酵母麸曲：准备6个编号为1-6、水分含量为20％的三角瓶，三角瓶的容量为250ml，然后向每个三角瓶中加入麸皮10g、鲜酒糟5.8g和生粉4.2g，再分别按6％、8％、10％、12％、14％、16％的接种量，将酵母种子液接种到不同生粉量的三角瓶中，充分混匀，用4层纱布封盖。放置在温度为25℃恒温培养箱中分别培养36h后得到不同酵母接种量梯度下的酵母麸曲。
(2)菌悬液制备：称量10g准备好的酵母麸曲加入装有90mL无菌9％生理盐水的250mL三角瓶中，于28℃、100r/min恒温摇床震荡30min。然后再分梯度稀释，得到浓度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
分别移取8个样品浓度为的10-6菌液100μL于孟加拉红平板培养基中，慢涂轻匀让菌体充分涂匀在培养基上。涂布后放置在28℃恒温培养箱中培养36h，培养后用菌落计数仪计数，结果如表7所示。
表7
从表7中的数据可以看出，随着酵母接种量逐渐增加，酵母活菌数缓慢上升，但基本持平稳状态。
八、酵母麸曲培养条件优化试验
为了进一步验证水分含量、时间、温度对酵母麸曲的影响，对酵母麸曲培养条件进行正交优化实验，实验结果如表8所示。
表8
由表8可知，水分含量、时间、温度对酵母麸曲均有不同程度的影响。R 值越大，代表了该因素的水平变化对酵母活菌数的影响较大，由极差分析得 RA>RB>RC，说明对酵母麸曲中活菌数变化影响因数的主次顺序是：水分>时间> 温度。最佳培养方案为A3B3C3，即水分含量40％，培养时间30h，培养温度30℃。
九、酵母麸曲验证试验
酵母麸曲优化配方：麸皮10g(50％)，生粉4.2g(21％)，鲜酒糟5.8g(29％)，水8mL(40％)。优化条件：接种量12％，时间30h，温度30℃。
酵母Njsys-YT1应用于优化麸曲配方，其酵母活菌数可达到436.7×106cfu/g。
十、酵母麸曲在清香型小曲酒中的应用
糯高梁经浸泡、蒸煮、糖化后，以2％酵母麸曲量添加到糖化24h后的高粱甜糟中，发酵6天。
为了验证酵母麸曲在清香型小曲白酒发酵中的产香促进作用，实验组将本发明的酵母麸曲按清香型小曲白酒常规工艺进行白酒酿制，对照组不添加酵母麸曲，检测成品酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯和总酯含量，结果如表9所示。
表9
从表9中的数据可以看出，糖化24小时后添加酵母麸曲可使酒中的乙酸乙酯的含量提高4倍，总酯的含量提高3倍。说明酵母麸曲在清香型小曲白酒发酵中的产香促进作用。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。
序列表
<110> 四川省古川酒业有限公司
<120> 一种利用产酯酵母制作麸曲的方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 异常汉逊酵母(Hansenula anomala)
<400> 1
ttttcttccg gcttttgata tgcttaagtt cagcgggtag tcctacctga tttaggtcaa 60
cttttagttt attgttgtta agccgagcct aaaatacttc taaacctgcc tagctgatat 120
aacgagttgg aagaacctaa tacattattt cagaaagact gcttattagt acactcttgc 180
taagtcaata tttcaagtta acccttgaca gagtatcact caataccaaa cccgaaggtt 240
tgagagagaa atgacgctca aacaggcata cccttggaat accagagggt gcaatgtgcg 300
ttcaaagatt cgatgattca cgaaaattgc aattcacaat acgtatcgca tttcgctgcg 360
ttttcatcgt tgcgagaacc aagagatccg ttgttgaaag ttttgaagat tttaattttt 420
gttaaaaatt ttcatgacta ttggttaaag gttttaacat taaaaaaaat gtgtttagac 480
ctttgggcag taagccaggc tcaccaccca aagcaaagtt caaaaaaact agacaatgtg 540
tgtaaggttt atcgccgcgc aattaagcgc tggcaataga atactataat gatccttccg 600
caggta 606

Claims (8)

1.一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，包括步骤：将产酯酵母种子液接种到酵母固态培养基中发酵培养，其特征在于：所述产酯酵母种子液中的产酯酵母是从大曲中分离所得，编号为Njsys-YT1。
2.根据权利要求1所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：所述产酯酵母为异常汉逊酵母，所述异常汉逊酵母的菌种保藏号为CGMCC No.8743。
3.根据权利要求2所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：所述产酯酵母的液态发酵代谢产物主要为乙酸乙酯和乙醇，所述乙酸乙酯和乙醇的相对百分含量分别为49.008％、32.893％。
4.根据权利要求3所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：所述酵母固态培养基原料包括以重量百分比计算的麸皮50％、鲜酒糟29％、生粉21％。
5.根据权利要求3或4所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：所述麸曲的制备包括以下步骤：
S1.酵母种子液的制备：从刚转接好的新鲜斜面上挑取一环菌种，接入50mL种子培养基中，置于摇床上在28℃、120r/min的条件下，振荡培养18h，得到酵母种子液；
S2.酵母麸曲制备：将麸皮、鲜酒糟、生粉加入到三角瓶中作为固态培养基，然后将准备好的酵母种子液接种到三角瓶中，搅拌均匀后，用纱布封盖瓶口，培养20-48h，得到酵母麸曲。
6.根据权利要求5所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：上述步骤S2中，酵母接种量为12％，水分添加量40％，培菌时间20-30h，培菌温度30℃。
7.根据权利要求6所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法，其特征在于：所述种子培养基为种子YPD培养基，每100ml所述种子YPD培养基中含葡萄糖2g、酵母膏1g、蛋白胨2g。
8.一种权利要求1-7任一项所述的一种利用产酯酵母制作麸曲的方法的应用，其特征在于：将糯高粱经浸泡、蒸煮、糖化后，以2％酵母麸曲量添加到糖化24h后的高粱甜糟中，发酵6天。
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