CN109355204A - 一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法 - Google Patents

一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法 Download PDF

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CN109355204A CN201811430783.1A CN201811430783A CN109355204A CN 109355204 A CN109355204 A CN 109355204A CN 201811430783 A CN201811430783 A CN 201811430783A CN 109355204 A CN109355204 A CN 109355204A
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明涉及生物发酵技术领域，公开了一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法，具体是通过斜面菌种培养，摇瓶种子培养，一级种子罐、二级种子罐培养，发酵罐培养，成熟发酵液按发酵体积的80‑90％v/v放罐，然后补入发酵培养基至原发酵体积继续培养，如此连续培养6‑8罐批。本发明克服了液体发酵生产冬虫夏草菌菌丝体粉周期长、收率低的不足，对冬虫夏草菌产业化具有实用性。

Description

一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法。
背景技术
冬虫夏草生活在青藏高原海拔3000-5200米高寒草甸，是一种名贵的中药材。冬虫夏草是鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫的幼虫被冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinesis)寄生后形成的一种虫菌复合体。冬虫夏草的虫菌关系在于，冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫以后，将幼虫躯体内的营养逐渐转化为菌丝体充满整个虫体组织，在冬季低温干燥土壤中保持虫形不变达数月之久(冬虫)。待夏季温湿适宜时在虫体头部长出棒状子实体(子座)并露出地面(夏草)。冬虫夏草菌过去也曾有用中国被毛孢(Hirsutella sinensis)、冬虫夏草头孢(Cephalosporium dongchongxiacaonia)、蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali)、中华束丝孢(Synnematium sinense)命名的，这些都是冬虫夏草菌的同种异名，现已统一修订为冬虫夏草菌。
冬虫夏草菌对温度要求极为严格，适宜生长温度为17-20℃，温度超过22℃就严重影响其生长，温度超过25℃甚至引起死亡；冬虫夏草菌生长缓慢，停滞期较长，在液体深层发酵生产过程中，首先，菌丝体收率较低；其次，制种时间较长。中国专利CN200710024324.9公开的一种用于生产冬虫夏草菌丝体的培养基，该专利公开了斜面培养基与发酵阶段两种不同的培养基，其中发酵培养基主要原料为葡萄糖、玉米浆、糖蜜、蚕蛹粉、黄豆饼粉、酵母膏、硫酸镁、磷酸二氢钾。在工业生产中，先将菌种接种于斜面培养基，在12-16℃培养25-35天，然后将菌种接种于发酵培养基于摇床上，温度12-16℃培养8-10天，然后接种于一级种子罐，温度12-16℃培养8-10天，然后以培养基量的8-10倍扩大，逐级发酵，直至达到所需的量。出罐后进行固液分离，将固体烘干粉碎。发酵周期8-10天，实施例中菌丝体收率最高为7.9g/L。
中国专利CN201210389147.5公开了一种中国被毛孢菌粉的生产方法，先将中国被毛孢菌种接种于斜面培养基，在13-17℃条件下培养20-30天。将菌种接种于三、四级发酵用培养基的摇床上，在13-17℃条件下发酵7-9天。然后接种于盛有培养基的一级种子罐，在13-17℃条件下发酵7-9天。再转至盛有培养基的二级发酵罐在13-17℃条件下发酵7-9天。再转至盛有培养基的三级发酵罐，在13-17℃条件下发酵3-5天。补充该培养基至罐体体积的2/3继续发酵3-5天。再转至盛有培养基的四级发酵罐，在13-17℃下发酵2-3天。补充该培养基至罐体体积的2/3后继续发酵，待罐内菌浓达到30-50％时出罐。进行固液分离，将固体烘干粉碎得中国被毛孢菌粉。该专利一级发酵和二级发酵培养基，包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾。摇床培养、三级发酵和四级发酵培养基包括蚕豆粉、玉米粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾，该专利最好的实施例菌丝体收率为8.85g/L。
在检索已报道的现有技术过程中发现，液体发酵冬虫夏草菌菌丝体收率较高的报道为20.8g/L，其发酵周期长达15-20天(王英燕等发酵科技通讯2014年7月第43期中国被毛孢研究现状及发展趋势)。因此，冬虫夏草菌产业化生产的瓶颈主要是较低的菌丝体收率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，从培养基和工艺两方面同时改进，提供一种半连续发酵生产冬虫夏草菌丝体的方法，大幅提高菌丝体收率，同时缩短从制种到发酵的生产周期。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法，具体是用冬虫夏草菌为菌种，通过斜面菌种培养，摇瓶种子培养，一级种子罐、二级种子罐培养，发酵罐培养，成熟发酵液按发酵体积的80-90％v/v放罐，然后补入发酵培养基至原发酵体积继续培养，如此连续培养6-8罐批；每次放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
具体步骤如下：
1.斜面种子的培养：
斜面培养基选择中国工业微生物菌种保藏管理中心DCH培养基，按重量体积比(％)计：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，无机离子溶液pH 5.6-6.0(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)。
培养基分装后121℃灭菌，倾制斜面，将经过活化的菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养30-35天。
2、摇瓶种子的培养：
摇瓶种子培养基：按重量体积比(％)计：碳源3.0-8.0％，氮源3.0-10.0％，无机盐0.02-0.15％，其余为水；其中所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜、玉米粉、土豆中的几种；氮源为蚕蛹粉、活蚕蛹、黄豆芽粉、酵母粉、蛋白胨、麸皮中的几种；无机盐为硫酸镁、磷酸二氢钾。
其中优选的摇瓶培养基为葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.0-2.5％，糖蜜0.5-1.5％，土豆2.0-6.0％，蚕蛹粉0-3.0％，活蚕蛹0-6.0％，黄豆芽粉0-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水。
培养基分装后，121℃灭菌，降温后将培养好的斜面种子接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，转速100-150rpm培养10-15天。
3、一级种子罐种子的培养：
一级种子罐培养基：按重量体积比(％)计：碳源3.0-7.0％，氮源3.0-10.0％，无机盐0.02-0.15％，其余为水；其中所述的碳源为葡萄糖、玉米粉、淀粉、糖蜜、土豆中的几种；氮源为蚕蛹粉、黄豆饼粉、黄豆芽粉、酵母粉、蛋白胨、麸皮中的几种；无机盐为硫酸镁、磷酸二氢钾。
其中优选的种子罐培养基为：葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.5-2.5％，糖蜜0.5-1.5％，土豆0-2.0％，淀粉0-2.0％；蚕蛹粉1.5-3.5％，黄豆饼粉0-1.5％，黄豆芽粉0-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％，蛋白胨0-1.0％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水。
一级种子罐培养基经消毒降温后，将摇瓶种子以5-10％接种量接种于一级种子罐，控制温度17-19℃,通气1：0.2-0.4vvm,培养8-10天。
4、二级种子罐种子的培养：
二级种子罐培养基：同一级种子罐，培养基经消毒降温后，将一级种子罐种子以10-20％接种量接种于二级种子罐，控制温度17-19℃,通气1：0.2-0.4vvm,培养6-8天。
5、发酵罐培养：
发酵罐培养基：按重量体积比(％)计：碳源3.0-7.0％，氮源3.0-10.0％，无机盐0.02-0.15％；其余为水；其中所述的碳源为葡萄糖、玉米粉、淀粉、糖蜜中的几种；氮源为蚕蛹粉、黄豆饼粉、黄豆芽粉、酵母粉、蛋白胨、麸皮中的几种；无机盐为硫酸镁、磷酸二氢钾。
其中优选的发酵罐培养基为：葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.5-2.5％，糖蜜0.5-1.5％，淀粉0-2.0％；蚕蛹粉1.5-3.5％，黄豆饼粉0-1.5％，黄豆粉0-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％，蛋白胨0-1.0％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水。
发酵罐培养基经过消毒、降温后，以10-20％接种量接入二级种子罐种子，控制温度17-19℃，通气1：0.2-0.4vvm,培养7-9天；
6、放罐及进料：按发酵液体积的80-90％v/v放出发酵液进入储罐，然后将消毒降温后的发酵培养基补入发酵罐至原发酵体积，控制温度17-19℃，通气1：0.2-0.4vvm,继续培养5-7天，放罐及进料，如此连续6-8罐批。
7、固液分离、干燥和粉碎
将每批放罐发酵液及时进行固液分离，固相为冬虫夏草菌丝体，将固体烘干，粉碎至粉末状，该冬虫夏草菌丝体粉呈灰黄色至黄褐色具有微腥味，无异味，取本品少量，加亚甲蓝染色后，置显微镜下油镜镜检可见有隔多核菌丝。
本发明菌丝体粉平均收率30-35千克/吨发酵液。
本发明具有以下积极效果：
1.本发明采用6-8批连续发酵工艺，减少了斜面制种、摇瓶制种、一级、二级种子罐制种过程，节约了人力物力及设备占用率，可以大幅降低生产成本。
2.本发明采用半连续发酵，克服了冬虫夏草菌培养停滞期长的不足，使发酵罐发酵周期由7-9天降低为5-7天，缩短了生产周期。
3.培养基中使用黄豆芽粉和活蚕蛹，具有促长作用，实现了冬虫夏草菌的高密度培养，取得30-35克/升的冬虫夏草菌丝体收率，解决了现有技术菌丝体收率低的缺陷。对冬虫夏草菌产业化具有实用性。
具体实施方式
实施例1
斜面种子的制备：DCH斜面培养基：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，用pH 5.6-6.0的无机离子溶液(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)配制。灭菌降温后，将经过活化的冬虫夏草菌菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养35天。该菌种选自工业微生物菌种保藏管理中心CICC，编号14088。
摇瓶种子的制备：摇瓶培养基：葡萄糖1.0％，玉米粉2.5％，糖蜜1.0％，土豆2.0％；活蚕蛹6.0％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉0.2％，麸皮1.0％；硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.1％，其余为水。首先将土豆切小块，蚕蛹剪碎、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，将斜面菌种接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，100-130rpm培养12天。
一级种子罐种子制备：培养基为：葡萄糖1.0％，玉米粉2.5％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉1.5％，黄豆芽粉1.5％，酵母粉0.5％，麸皮0.5％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.05％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，以5％的接种量接种摇瓶种子于一级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养10天。
二级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.0％，玉米粉2.5％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉1.5％，黄豆芽粉1.5％，酵母粉0.5％，麸皮0.5％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.05％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以10％的接种量接种一级种子于二级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养8天。
发酵罐发酵培养：培养基为：葡萄糖1.0％，玉米粉2.5％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉1.5％，黄豆芽粉1.5％，酵母粉0.5％，麸皮0.5％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.05％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以20％的接种量接种二级种子罐种子，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养8天生长浓稠。
放罐及进料：放出发酵液体积80％的发酵液，按原发酵体积补入新的发酵培养基，在同等条件下继续培养5-6天生长浓稠。如此重复发酵6罐批。
固液分离、干燥和粉碎：每批放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
6罐批菌丝体粉平均收率为30.4千克/吨发酵液。
实施例2
斜面种子的制备：DCH斜面培养基：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，用pH 5.6-6.0的无机离子溶液(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)配制。将经过活化的菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养33天。该菌种选自工业微生物菌种保藏管理中心CICC，编号14088。
摇瓶种子的制备：摇瓶培养基：葡萄糖1.5％，玉米粉1.5％，糖蜜1.5％，土豆3.0％；活蚕蛹4.0％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉1.0％，麸皮1.5％；硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.05％，其余为水。首先将土豆切小块，蚕蛹剪碎、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min，过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，将斜面菌种接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，100-130rpm培养15天。
一级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，玉米粉2.0％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉1.0％，麸皮1.0％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以10％的接种量接种摇瓶种子于一级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养7天。
二级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，玉米粉2.0％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉1.0％，麸皮1.0％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min，过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以15％的接种量接种一级种子于二级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养6天。
发酵罐发酵培养：培养基为葡萄糖1.5％，玉米粉2.0％，糖蜜1.5％；蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉1.0％，麸皮1.0％，蛋白胨1.0％；硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以20％的接种量接种二级种子罐种子于发酵罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养7天生长浓稠。
放罐及补料：放出发酵体积80％的发酵液，按原发酵体积补入新的发酵培养基，在温17-19℃继续培养6天生长浓稠。如此重复发酵7罐批。
固液分离、干燥和粉碎：每批放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
7罐批菌丝体粉平均收率为31.6千克/吨发酵液。
实施例3
斜面种子的制备：DCH斜面培养基：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，用pH 5.6-6.0的无机离子溶液(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)配制。将经过活化的菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养34天。该菌种选自工业微生物菌种保藏管理中心CICC，编号14088。
摇瓶种子的制备：摇瓶培养基：葡萄糖1.5％，玉米粉2.0％，糖蜜1.0％，土豆5.0％；活蚕蛹5.0％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉0.4％，麸皮1.5％；硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将土豆切成小块，蚕蛹剪碎、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后将斜面菌种接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，100-130rpm培养14天。
一级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，玉米粉2.0％蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1.0％，麸皮1.0％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以8％接种量接种摇瓶种子于一级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养8天。
二级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，玉米粉2.0％蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1.0％，麸皮1.0％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以20％的接种量接种一级种子于二级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养6天。
发酵罐发酵培养：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，玉米粉2.0％，蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1.0％，麸皮1.0％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以10％接种量接种二级种子罐种子，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养9天生长浓稠。
放罐及补料：放出发酵液体积90％的发酵液，按原发酵体积补入新的发酵培养基，在温17-19℃继续培养7天。如此重复发酵6罐批。
固液分离、干燥和粉碎：每批放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
6罐批菌丝体粉平均收率为35.1千克/吨发酵液。
实施例4
斜面种子的制备：DCH斜面培养基：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，用pH 5.6-6.0的无机离子溶液(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)配制。将经过活化的菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养31天。该菌种选自工业微生物菌种保藏管理中心CICC，编号14088。
摇瓶种子的制备：摇瓶培养基：葡萄糖2.0％，玉米粉2.0％，糖蜜0.5％，土豆6.0％；蚕蛹粉2.5％，黄豆芽粉1.0％，酵母粉0.5％，麸皮1.0％；硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.04％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸和适量水微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，将斜面菌种接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，100-130rpm培养15天。
一级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，淀粉1.5％，蚕蛹粉3.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，麸皮1.5％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸、淀粉、淀粉酶加适量水液化并微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以10％的接种量接种摇瓶种子于一级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养6天。
二级种子罐种子制备：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，淀粉1.5％，蚕蛹粉3.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，麸皮1.5％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸、淀粉、淀粉酶加适量水液化并微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以20％接种量接种一级种子于二级种子罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养6天。
发酵罐发酵培养：培养基为葡萄糖1.5％，糖蜜1.0％，淀粉1.5％，蚕蛹粉3.5％，黄豆芽粉0.5％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，麸皮1.5％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.02％，其余为水。首先将蚕蛹粉、玉米粉、麦麸、淀粉、淀粉酶加适量水液化并微沸提取30min,过滤后取滤液，加入其它成分，灭菌降温后，以20％接种量接种二级种子罐种子于发酵罐，温度17-19℃，搅拌转速100-120rpm,通气1：0.2-0.4vvm,培养8天生长浓稠。
放罐及补料：放出发酵液体积85％的发酵液，按原发酵体积补入新的发酵培养基，在温17-19℃继续培养8-9天。如此重复发酵8罐批。
固液分离、干燥和粉碎：每批放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
8罐批菌丝体粉平均收率为35.7千克/吨发酵液。
实施例5：对比试验
将本发明实施例生产的产品与CN201210389147.5和CN200710024324.9效果最好的实施例进行收率、活性成分含量比较，见表1。
表1
表1说明：
样品1为CN201210389147.5实施例4生产的中国被毛孢菌粉；
样品2为CN201210389147.5实施例5生产的中国被毛孢菌粉；
样品3为CN200710024324.9实施例2生产的冬虫夏草菌粉；
样品4为CN200710024324.9实施例3生产的冬虫夏草菌粉；
样品5为本发明实施例1生产的冬虫夏草菌丝粉；
样品6为本发明实施例3生产的冬虫夏草菌丝粉。

Claims (2)

1.一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法，其特征在于：具体是用冬虫夏草菌为菌种，通过斜面菌种培养，摇瓶种子培养，一级种子罐、二级种子罐培养，发酵罐培养，成熟发酵液按发酵液体积的80-90％v/v放罐，然后补入发酵培养基至原发酵体积继续培养，如此连续培养6-8罐批；每次放罐发酵液进行固液分离，将固体烘干、粉碎而成冬虫夏草菌丝体粉。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产冬虫夏草菌丝体粉的方法，具体步骤如下：
(1)斜面种子的培养：
斜面培养基选择中国工业微生物菌种保藏管理中心DCH培养基，按重量体积比(％)计：蔗糖5.0％，酵母粉0.3％，胰蛋白胨1.0％，琼脂粉1.0％，无机离子溶液pH 5.6-6.0(硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，氯化钠1克、氯化钙0.3克、硫酸锰0.01克、硫酸锌0.01克、硫酸亚铁0.01克、硫酸铜0.01克，蒸馏水定容1000毫升)；
培养基分装后121℃灭菌，倾制斜面，将经过活化的菌种接种于斜面培养基，在15-18℃培养30-35天；
(2)摇瓶种子的培养：
摇瓶种子培养基：按重量体积比(％)计：葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.0-2.5％，淀粉0-2.0％，糖蜜0.5-1.5％，土豆2.0-6.0％；蚕蛹粉0-3.0％，活蚕蛹0-6.0％，黄豆芽粉0.5-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水；
培养基分装后，121℃灭菌，降温后将培养好的斜面种子接种于摇瓶培养基于摇床上，温度17-19℃，转速100-150rpm培养10-15天；
(3)一级种子罐种子的培养：
种子罐培养基：按重量体积比(％)计，葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.5-2.5％，糖蜜0.5-1.5％，土豆0-2.0％，淀粉0-2.0％；蚕蛹粉1.5-3.5％，黄豆饼粉0-1.5％，黄豆芽粉0-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％，蛋白胨0-1.0％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水；
一级种子罐培养基经消毒降温后，将摇瓶种子以5-10％接种量接种于一级种子罐，控制温度17-19℃,通气1：0.2-0.4vvm,培养8-10天；
(4)二级种子罐种子培养：
培养基配方同一级种子罐，培养基经消毒降温后，将一级种子罐种子以10-20％接种量接种于二级种子罐，控制温度17-19℃,通气1：0.2-0.4vvm,培养6-8天；
(5)发酵罐培养：
发酵罐培养基：按重量体积比(％)计：葡萄糖1.0-2.0％，玉米粉1.5-2.5％，糖蜜0.5-1.5％，淀粉0-2.0％；蚕蛹粉1.5-3.5％，黄豆饼粉0-1.5％，黄豆芽粉0-1.5％，酵母粉0.2-1.0％，麸皮0.5-1.5％，蛋白胨0-1.0％；硫酸镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.02-0.1％，其余为水；
发酵罐培养基经过消毒、降温后，以10-20％接种量接入二级种子罐种子，控制温度17-19℃，通气1：0.2-0.4vvm,培养7-9天；
(6)放罐及进料：
按发酵液体积的80-90％v/v放出发酵液，然后将消毒降温后的发酵培养基补入发酵罐至原发酵体积，控制温度17-19℃，通气1：0.2-0.4vvm,继续培养5-7天，如此连续6-8罐批；
(7)固液分离、干燥、粉碎：
将每批放罐发酵液及时进行固液分离，将固体烘干，将该菌丝体粉碎至粉末状制成冬虫夏草菌丝体粉。
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