CN110878259A - 冬虫夏草菌丝的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其包括以下步骤：步骤一、取蛋白胨、葡萄籽粉、洋葱粉、蜂蜜、硫酸镁和硫胺素加入至去离子水中，得混合液；步骤二、向混合液中加入食用菌菌糠，并向其中加入聚乳酸空心微球和碳纳米管，得发酵培养基；步骤三、将冬虫夏草液体菌种与发酵培养基混合均匀，并置于发酵罐内，发酵10～14h后过滤去除滤液得第二发酵物；步骤四、向第二发酵物中加入补充液，继续发酵12～14天后得冬虫夏草菌丝体。本发明能够将菌种与培养基混合均匀，保证固体发酵过程中，培养基良好的疏松通气性，为冬虫夏草菌丝提高极佳的生长环境，进而提高冬虫夏草人工培育的效率和菌丝成品质量。

Description

冬虫夏草菌丝的发酵方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。更具体地说，本发明涉及一种的冬虫夏草菌丝的发酵方法。

背景技术

冬虫夏草是一种珍贵的药用真菌，属于国家二类保护植物，冬虫夏草生长于自然界中的特殊区域，如我国西藏、青海、云南、四川及甘肃等省区3000～5000m的高寒草甸区；由于冬虫夏草具有极高的药用价值，对肾功能衰竭，久咳虚喘，免疫力低下等都有很好的疗效，使得当今社会对冬虫草草的需求量越来越大，人们前往冬虫夏草的生长地进行滥采滥挖，导致冬虫夏草的生长环境受到严重破坏，自然界中的冬虫夏草的野生资源越来越少，几乎处于极度濒危的境地。人工培育冬虫夏草极大丰富了冬虫夏草的产量和应用。

现有的人工培育冬虫夏草主要通过液体发酵和固体发酵实现，液体发酵中由于其培养基的流动性，使得菌丝体生长环境不稳，导致菌丝质量较差；固体发酵可为菌丝提供平稳的生长环境，但现有的固体发酵工艺中普遍存在菌种与固体培养基混合不均匀、固体培养基的透气性差的缺陷，进而导致菌丝繁殖受影响，获得的菌丝品质也不高。

因此，亟需提供一种能够为冬虫夏草菌丝提供平稳、疏松透气的生长环境的固体发酵方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其能够将菌种与培养基混合均匀，保证固体发酵过程中，培养基良好的疏松通气性，为冬虫夏草菌丝提高极佳的生长环境，进而提高冬虫夏草人工培育的效率和菌丝成品质量。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其包括以下步骤：

步骤一、按重量份数计，取1～3份的蛋白胨、0.5～0.8份的葡萄籽粉、0.3～0.6份的洋葱粉、1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁和0.14～0.18份硫胺素依次加入至200～300份的去离子水中，充分搅拌30～40min，得混合液；

步骤二、在搅拌下向所述混合液中加入40～50份的食用菌菌糠，继续搅拌20～30min后，依次向所述混合液中加入1～3份的聚乳酸空心微球和1～3份的碳纳米管，然后升温至110～120℃继续搅拌2～3h，得发酵培养基，搅拌期间向其中通入无菌气体；

步骤三、将经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种与步骤三得到的发酵培养基按照体积比为0.02:1的比例进行混合均匀，得第一发酵物，将所述第一发酵物置于发酵罐内，于18～20℃的温度下发酵，10～14h后过滤去除滤液，然后将所述发酵罐的内部压力调至0.8～1.2MPa，保压10～20min后，瞬时泄压，重复操作1～3次后，得第二发酵物；

步骤四、取1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁、0.14～0.18份硫胺素和8～9份的去离子水混合，并经过灭菌处理得补充液，将所述补充液加入至所述第二发酵物中，并于18～20℃的温度下发酵，12～14天后得发酵物料，从所述发酵物料中分离并收集冬虫夏草菌丝体。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，在步骤三之前，向所述发酵罐内通入无菌气体，将所述发酵罐内的空气完全置换为无菌气体；

步骤四中，在发酵的12～14天期间，每隔2天向所述发酵罐内通入无菌气体，通气时间为20～30min。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，步骤四中，所述补充液的加入具体为：将所述补充液从所述发酵罐的顶部加入至所述第二发酵物中，所述补充液加入的同时，将所述发酵罐的底部与抽吸泵连通，在抽吸泵的作用下，将所述补充液向下引流，当所述补充液渗透至所述第二发酵物的底部时，关闭抽吸泵。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，步骤四中，从所述发酵物料中分离并收集冬虫夏草菌丝体具体为：发酵12～14天后，从发酵罐内取出发酵物料，并向发酵物料中加入蒸馏水，使得水位高于发酵物料，将发酵物料与蒸馏水的混合物置于超声震荡下处理，30～40min后过滤收集滤渣，重复操作2～4次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过60～100目筛，即得冬虫夏草菌丝体。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，扩大培养的冬虫夏草液体菌种的培养方法为：将冬虫夏草的被毛孢菌种在无菌条件下接种至斜面培养基上，置于18～20℃的摇床上培养100～120h，得斜面母菌种；将斜面母菌种接种至锥形瓶内的液体培养基中，摇床培养100～120h后即得；

所述斜面培养基包括以下重量份数的原料：10～20份的玉米汁、15～25份的蜂蜜、1.2～2.4份的琼脂；斜面培养基的pH为6～6.7；

所述液体培养基包括以下重量份数的原料：1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁、0.14～0.18份的硫胺素、0.0007～0.002份的维生素B1和50～80份的水。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，所述食用菌菌糠经过了预处理，具体为：将食用菌菌糠置于温度为150～200℃、压力为5～8MPa的反应釜中，保压20～30min后瞬时泄压，食用菌菌糠从反应釜的喷管中喷出，即得。

优选的是，所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，聚乳酸空心微球的粒径为20～30nm；碳纳米管的粒径为30～50nm。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明对冬虫夏草菌种首先进行短期的液体发酵，待菌丝稳固的缠绕在碳纳米管载体上以后，转成固体发酵，为菌丝后期生长提高稳定的环境，本发明首先将经过扩大培养的液体菌种与液态的发酵培养基混合，使得菌种均匀的分散于培养基中，在适宜的环境下进行发酵培养10～14h，菌种长出细小得菌丝体并稳定吸附在培养基中的碳纳米管载体上以后，再进行过滤，从液体发酵转成固体发酵，为菌丝体的后续生长提供更加稳定的环境；规避了现有的液体发酵中因不断搅拌、翻动而造成的损伤，现有的固体发酵中菌种与固体培养基混合不均匀，固体培养基透气性较差的问题；

2、食用菌菌糠为食用菌栽培的废料、菌渣或余料，其含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素，具有容重小，疏松且通气性好得优点，本发明选用食用菌菌糠作为培养基的基质，代替现有及时中得木屑、棉籽壳和麦麸，不仅具有降低人工培育成本的优点，同时提高了培养基的疏松透气性，进一步的食用菌菌糠中含有食用菌培养过程中残留的次生代谢产物，可与冬虫夏草菌丝的生长产生感化作用，促进冬虫夏草菌丝的生长；

聚乳酸具有良好的透气性，聚乳酸还具有生物可降解性，本发明在培养基中混入聚乳酸空心微球，提高了固体发酵培养基的环保性，进一步提高固体发酵过程中培养基良好的透气性；

碳纳米管具有特殊结构、具有良好的生物相溶性，在发酵培养基中加入碳纳米管，在前期的液体发酵过程中，由于碳纳米管的特殊结构菌种长出的菌丝可缠绕在碳纳米管表面，初生的细小菌丝体附着在碳纳米管上，减少菌丝体在液体培养基中的流动性，随着菌丝体的逐渐生长，为进一步保证发酵混合的稳定性，本发明在液体发酵10～14h后将发酵体系中的液体过滤掉，过滤过程中由于菌丝体缠绕在碳纳米管上，不会随液体流失掉，进而实现从液体发酵向固体发酵的转变；

3、第一发酵物发酵一段时间后进行过滤去除滤液，剩余的滤渣经过加压、保压、瞬时泄压，一方面将滤渣中存留的液体排出，另一方面可在滤渣中形成气孔，提高培养基的疏松透气性；为弥补过滤过程中无机盐的流失，向第二发酵物中加入补充液，以保证培养基为冬虫夏草的菌丝正常提供充足的营养。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明所用的冬虫夏草的被毛孢菌种均为蝙蝠蛾被毛孢菌种，购买自中国工业微生物菌种保藏中心，菌种编号：14017。

<实施例1>

本发明提供一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其包括以下步骤：

步骤一、按重量份数计，取1份的蛋白胨、0.5份的葡萄籽粉、0.3份的洋葱粉、1份的蜂蜜、0.14份的硫酸镁和0.14份硫胺素依次加入至200份的去离子水中，充分搅拌30min，得混合液；

步骤二、在搅拌下向所述混合液中加入40份的食用菌菌糠，继续搅拌20min后，依次向所述混合液中加入1份的聚乳酸空心微球和1份的碳纳米管，然后升温至110℃继续搅拌2h，得发酵培养基，搅拌期间向其中通入无菌气体；

其中，聚乳酸空心微球的粒径为20nm；碳纳米管的粒径为30nm；

所述食用菌菌糠经过了预处理，具体为：将食用菌菌糠置于温度为150℃、压力为5MPa的反应釜中，保压20min后瞬时泄压，食用菌菌糠从反应釜的喷管中喷出，即得；

步骤三、将冬虫夏草的被毛孢菌种在无菌条件下接种至斜面培养基上，置于18℃的摇床上培养100h，得斜面母菌种；将斜面母菌种接种至锥形瓶内的液体培养基中，摇床培养100h后，得经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种；

其中，所述斜面培养基包括以下重量份数的原料：10份的玉米汁、15份的蜂蜜、1.2份的琼脂；斜面培养基的pH为6；

所述液体培养基包括以下重量份数的原料：1份的蜂蜜、0.14份的硫酸镁、0.14份的硫胺素、0.0007份的维生素B1和50份的水；

步骤四、将经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种与步骤三得到的发酵培养基按照体积比为0.02:1的比例进行混合均匀，得第一发酵物，将所述第一发酵物置于发酵罐内，于18℃的温度下发酵，10h后过滤去除滤液，然后将所述发酵罐的内部压力调至0.8MPa，保压10min后，瞬时泄压，重复操作1次后，得第二发酵物；

其中，在将所述第一发酵物置于发酵罐内之前，向所述发酵罐内通入无菌气体，将所述发酵罐内的空气完全置换为无菌气体；

步骤五、取1份的蜂蜜、0.14份的硫酸镁、0.14份硫胺素和8份的去离子水混合，并经过灭菌处理得补充液，将所述补充液从所述发酵罐的顶部加入至所述第二发酵物中，所述补充液加入的同时，将所述发酵罐的底部与抽吸泵连通，在抽吸泵的作用下，将所述补充液向下引流，当所述补充液渗透至所述第二发酵物的底部时，关闭抽吸泵；于18℃的温度下继续发酵12天得发酵物料，发酵期间每隔2天向所述发酵罐内通入无菌气体，通气时间为20min；

步骤六、从发酵罐内取出发酵物料，向发酵物料中加入蒸馏水，使得水位高于发酵物料，将发酵物料与蒸馏水的混合物置于超声震荡下处理，30min后过滤收集滤渣，重复操作2次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过60目筛，即得冬虫夏草菌丝体。

<实施例2>

本发明提供一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其包括以下步骤：

步骤一、按重量份数计，取3份的蛋白胨、0.8份的葡萄籽粉、0.6份的洋葱粉、3份的蜂蜜、0.18份的硫酸镁和0.18份硫胺素依次加入至300份的去离子水中，充分搅拌40min，得混合液；

步骤二、在搅拌下向所述混合液中加入50份的食用菌菌糠，继续搅拌30min后，依次向所述混合液中加入3份的聚乳酸空心微球和3份的碳纳米管，然后升温至120℃继续搅拌3h，得发酵培养基，搅拌期间向其中通入无菌气体；

其中，聚乳酸空心微球的粒径为30nm；碳纳米管的粒径为50nm；

所述食用菌菌糠经过了预处理，具体为：将食用菌菌糠置于温度为200℃、压力为8MPa的反应釜中，保压30min后瞬时泄压，食用菌菌糠从反应釜的喷管中喷出，即得；

步骤三、将冬虫夏草的被毛孢菌种在无菌条件下接种至斜面培养基上，置于20℃的摇床上培养120h，得斜面母菌种；将斜面母菌种接种至锥形瓶内的液体培养基中，摇床培养120h后，得经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种；

其中，所述斜面培养基包括以下重量份数的原料：20份的玉米汁、25份的蜂蜜、2.4份的琼脂；斜面培养基的pH为6.7；

所述液体培养基包括以下重量份数的原料：3份的蜂蜜、0.18份的硫酸镁、0.18份的硫胺素、0.002份的维生素B1和80份的水；

步骤四、将经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种与步骤三得到的发酵培养基按照体积比为0.02:1的比例进行混合均匀，得第一发酵物，将所述第一发酵物置于发酵罐内，于20℃的温度下发酵，14h后过滤去除滤液，然后将所述发酵罐的内部压力调至1.2MPa，保压20min后，瞬时泄压，重复操作3次后，得第二发酵物；

其中，在将所述第一发酵物置于发酵罐内之前，向所述发酵罐内通入无菌气体，将所述发酵罐内的空气完全置换为无菌气体；

步骤五、取3份的蜂蜜、0.18份的硫酸镁、0.18份硫胺素和9份的去离子水混合，并经过灭菌处理得补充液，将所述补充液从所述发酵罐的顶部加入至所述第二发酵物中，所述补充液加入的同时，将所述发酵罐的底部与抽吸泵连通，在抽吸泵的作用下，将所述补充液向下引流，当所述补充液渗透至所述第二发酵物的底部时，关闭抽吸泵；于20℃的温度下继续发酵14天后得发酵物料，发酵期间每隔2天向所述发酵罐内通入无菌气体，通气时间为30min；

步骤六、从发酵罐内取出发酵物料，向发酵物料中加入蒸馏水，使得水位高于发酵物料，将发酵物料与蒸馏水的混合物置于超声震荡下处理，40min后过滤收集滤渣，重复操作4次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过100目筛，即得冬虫夏草菌丝体。。

<实施例3>

本发明提供一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，其包括以下步骤：

步骤一、按重量份数计，取2份的蛋白胨、0.7份的葡萄籽粉、0.5份的洋葱粉、2份的蜂蜜、0.16份的硫酸镁和0.16份硫胺素依次加入至250份的去离子水中，充分搅拌35min，得混合液；

步骤二、在搅拌下向所述混合液中加入45份的食用菌菌糠，继续搅拌25min后，依次向所述混合液中加入2份的聚乳酸空心微球和2份的碳纳米管，然后升温至115℃继续搅拌2.5h，得发酵培养基，搅拌期间向其中通入无菌气体；

其中，聚乳酸空心微球的粒径为25nm；碳纳米管的粒径为40nm；

所述食用菌菌糠经过了预处理，具体为：将食用菌菌糠置于温度为180℃、压力为6MPa的反应釜中，保压25min后瞬时泄压，食用菌菌糠从反应釜的喷管中喷出，即得；

步骤三、将冬虫夏草的被毛孢菌种在无菌条件下接种至斜面培养基上，置于19℃的摇床上培养110h，得斜面母菌种；将斜面母菌种接种至锥形瓶内的液体培养基中，摇床培养110h后，得经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种；

其中，所述斜面培养基包括以下重量份数的原料：15份的玉米汁、20份的蜂蜜、1.8份的琼脂；斜面培养基的pH为6.4；

所述液体培养基包括以下重量份数的原料：2份的蜂蜜、0.16份的硫酸镁、0.16份的硫胺素、0.0013份的维生素B1和65份的水；

步骤四、将经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种与步骤三得到的发酵培养基按照体积比为0.02:1的比例进行混合均匀，得第一发酵物，将所述第一发酵物置于发酵罐内，于19℃的温度下发酵，12h后过滤去除滤液，然后将所述发酵罐的内部压力调至1.0MPa，保压15min后，瞬时泄压，重复操作2次后，得第二发酵物；

其中，在将所述第一发酵物置于发酵罐内之前，向所述发酵罐内通入无菌气体，将所述发酵罐内的空气完全置换为无菌气体；

步骤五、取2份的蜂蜜、0.16份的硫酸镁、0.16份硫胺素和8.5份的去离子水混合，并经过灭菌处理得补充液，将所述补充液从所述发酵罐的顶部加入至所述第二发酵物中，所述补充液加入的同时，将所述发酵罐的底部与抽吸泵连通，在抽吸泵的作用下，将所述补充液向下引流，当所述补充液渗透至所述第二发酵物的底部时，关闭抽吸泵；于19℃的温度下继续发酵13天后得发酵物料，发酵期间每隔2天向所述发酵罐内通入无菌气体，通气时间为25min；

步骤六、从发酵罐内取出发酵物料，向发酵物料中加入蒸馏水，使得水位高于发酵物料，将发酵物料与蒸馏水的混合物置于超声震荡下处理，35min后过滤收集滤渣，重复操作3次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过80目筛，即得冬虫夏草菌丝体。

<实施例4>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤二中不加入聚乳酸空心微球，其余条件和参数同实施例3。

<实施例5>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤二中不加入碳纳米管，其余条件和参数同实施例3。

<实施例6>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤二中将食用菌菌糠替换为等量的麦麸，其余条件和参数同实施例3。

<实施例7>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤二中将食用菌菌糠不经过预处理，其余条件和参数同实施例3。

<实施例8>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤四中于19℃的温度下发酵，12h后不过滤、不经过步骤五，直接继续发酵13天后得发酵物料，随后将发酵物料置于超声震荡下处理，35min后过滤收集滤渣，重复操作3次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过80目筛，即得冬虫夏草菌丝体；其余条件和参数同实施例3。

<实施例9>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤四中于19℃的温度下发酵，12h后过滤去除滤液，得第二发酵物，即不经过加压、保压和瞬时泄压的过程，其余条件和参数同实施例3。

<实施例10>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤五中第二发酵物料中不加入补充液，直接于19℃的温度下继续发酵13天后得发酵物料；其余条件和参数同实施例3。

<实施例11>

一种冬虫夏草菌丝的发酵方法，与实施例3的不同在于，步骤五中向第二发酵物料中补充液时，直接倒入第二发酵物料中，不经过抽吸泵的抽吸过程；其余条件和参数同实施例3。

<对比例1>

一、将实施例1～3制得的发酵菌丝与天然冬虫夏草外观和成分进行对比：

外观对比：冬虫夏草虫体与子座断面颜色为白色，微有弹性，气微腥，味微苦。采用本发明1～3生产出发酵冬虫夏草菌丝颜色均为白色，气味与味道与天然冬虫夏草具有相近似的微腥、微苦性状。说明通过本发明的人工发酵方法能够获得外管与天然冬虫夏草一致的产品。

二、天然冬虫夏草菌丝作为对照组，按照以下方法检测本发明实施例1～11的制备得到的冬虫夏草菌丝体、以及对照组提供的菌丝体的有效成分，并统计检测数据，结果如表1所示：

1、腺苷、虫草素的测定方法为：采用液相色谱测定，色谱条件为选用Dikma^TMC₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水(15:85)，用0.45μm滤膜过滤，柱温为30℃，流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；腺苷对照品、虫草素对照品购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；

随机取样0.5g冬虫夏草菌丝体的样品，置于具塞的锥形瓶中，向锥形瓶中加入体积分数为90％的甲醇10mL，将锥形瓶瓶塞塞紧，随后摇匀，称定重量，加热回流30min后冷却，再次称定重量，然后用体积分数为90％的甲醇补足损失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液为供试品溶液，取10μL供试品溶液，按照上述色谱条件测试样品中腺苷的含量(μg/g)和虫草素的含量(μg/g)；

2、虫草多糖的测定方法：采用3,5二硝基水杨酸比色法，先测定冬虫夏草中的总糖和还原糖的含量；

2.1、用葡萄糖配制成每5mL含糖0.2～1mg的系列标准溶液，用722S分光光度计，依次测系列标准溶液在520nm处的吸光度A，获取糖含量C与吸光度A的关系回归方程式一：C＝xA+y；

2.2、总糖测定：向0.25g冬虫夏草样品中加入15mL的蒸馏水和10mL浓度为6mol/L的HCl，沸水浴30min后自然冷却至室温，然后加入7.5mL的体积分数为30％的NaOH水溶液，搅拌均匀后定容至250mL的容量瓶中，离心，吸取2mL上清液，移入25mL容量瓶，用蒸馏水补足至5mL，然后加入1.5mLDNS试剂(用3,5二硝基水杨酸配制而成)，沸水浴5min，冷却后定容得待测液一，从待测液一中吸取试液一至比色皿中，用722S分光光度计，测试液一在520nm处的吸光度A₁，将A₁代入上述回归方程式一中计算得到对应的试液一中总糖含量C₁，并根据以下公式计算样品中总糖含量：样品总糖含量＝(C₁×250×0.9)/(2×0.25)mg/g，[备注：0.9为校准系数]；

2.3、还原糖测定：向0.25g冬虫夏草样品中加入25mL的蒸馏水，在53℃下水浴30min，随后冷却定容至50mL的容量瓶中，离心，吸取2mL上清液，移入25mL容量瓶，用蒸馏水补足至5mL，然后加入1.5mLDNS试剂(用3,5二硝基水杨酸配制而成)，沸水浴5min，冷却后定容得待测液二，从待测液二中吸取试液二至比色皿中，用722S分光光度计，测试液二在520nm处吸光度A₂，将A₂代入上述回归方程式一中计算得到对应的试液二中还原糖含量C₂，并根据以下公式计算样品中还原糖的含量：样品总糖含量＝(C₂×50)/(2×0.25)mg/g；

2.4、冬虫夏草样品中多糖含量(mg/g)＝样品中总糖含量-样品中还原糖含量；

3、虫草酸测定：采用高碘酸钠比色法，用甘露醇(虫草酸就是甘露醇)配制程10～90μg/mL的系列标准溶液，用分光光度计分别测各个标准溶液在420nm处的吸光度B，获取虫草酸含量D与吸光度B的光系回归方程式二：D＝zB+v；

称取冬虫夏草样品0.5g，放入500mL的烧杯中，并加入200mL蒸馏水，将烧杯的杯口用薄膜封口，然后放入沸水浴中，2h后取出烧杯，冷却后转移至250mL容量瓶中，定容，离心，用微量取样器取300μL上清液，加入蒸馏水补足至1mL，然后加1mL高碘酸钠试液，室温放置10min，加2mL0.1％鼠李糖，再加入4mL新配的Nash试剂(用醋酸铵、乙酰丙酮等配制)，53℃下水浴15min，冷却后定容得待测液三，从待测液三中吸取试液三至比色皿中，用分光光度计，测试液三在420nm处吸光度B₁，将B₁代入上述回归方程式二中计算得到对应的试液三中虫草酸含量D₁，并根据一下公式计算样品中虫草酸的含量：样品虫草酸含量＝(D₁×10^-3×250)/(0.3×0.5)mg/g；

三、制备得到的菌丝体产量的测定：制备得到的冬虫夏草菌丝体mg，步骤四中经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种的体积为vL，菌丝体的产量＝m/v；按照上述产量计算方法分别测定本发明实施例1～11的菌丝体的产量，并统计结果如表1所示。

表1测定结果

由表1可知，本发明实施例1～11制备得到冬虫夏草菌丝体的有效成分的含量均优于天然冬虫夏草的菌丝的有效成分的含量，本发明适合于冬虫夏草的商业化的人工培育；1～3制备得到的冬虫夏草菌丝体的产量明显高于实施例4～11的产量，由此说明首先进行液体发酵随后转成固体发酵，向发酵培养基中加入聚乳酸空心微球，加入碳纳米管，采用菌糠基质，对菌糠进行预处理，对第二发酵物料进行加压、保压和泄压处理，以及采用上加下抽吸的方式向第二发酵物料中加入补充液，均可提高冬虫夏草菌丝体的产量，对于冬虫夏草菌丝体的有效成分的含量也有显著改善。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤一、按重量份数计，取1～3份的蛋白胨、0.5～0.8份的葡萄籽粉、0.3～0.6份的洋葱粉、1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁和0.14～0.18份硫胺素依次加入至200～300份的去离子水中，充分搅拌30～40min，得混合液；

步骤二、在搅拌下向所述混合液中加入40～50份的食用菌菌糠，继续搅拌20～30min后，依次向所述混合液中加入1～3份的聚乳酸空心微球和1～3份的碳纳米管，然后升温至110～120℃继续搅拌2～3h，得发酵培养基，搅拌期间向其中通入无菌气体；

步骤三、将经过扩大培养的冬虫夏草液体菌种与步骤三得到的发酵培养基按照体积比为0.02:1的比例进行混合均匀，得第一发酵物，将所述第一发酵物置于发酵罐内，于18～20℃的温度下发酵，10～14h后过滤去除滤液，然后将所述发酵罐的内部压力调至0.8～1.2MPa，保压10～20min后，瞬时泄压，重复操作1～3次后，得第二发酵物；

步骤四、取1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁、0.14～0.18份硫胺素和8～9份的去离子水混合，并经过灭菌处理得补充液，将所述补充液加入至所述第二发酵物中，并于18～20℃的温度下发酵，12～14天后得发酵物料，从所述发酵物料中分离并收集冬虫夏草菌丝体。

2.如权利要求1所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，在步骤三之前，向所述发酵罐内通入无菌气体，将所述发酵罐内的空气完全置换为无菌气体；

步骤四中，在发酵的12～14天期间，每隔2天向所述发酵罐内通入无菌气体，通气时间为20～30min。

3.如权利要求2所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，步骤四中，所述补充液的加入具体为：将所述补充液从所述发酵罐的顶部加入至所述第二发酵物中，所述补充液加入的同时，将所述发酵罐的底部与抽吸泵连通，在抽吸泵的作用下，将所述补充液向下引流，当所述补充液渗透至所述第二发酵物的底部时，关闭抽吸泵。

4.如权利要求3所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，步骤四中，从所述发酵物料中分离并收集冬虫夏草菌丝体具体为：发酵12～14天后，从发酵罐内取出发酵物料，并向发酵物料中加入蒸馏水，使得水位高于发酵物料，将发酵物料与蒸馏水的混合物置于超声震荡下处理，30～40min后过滤收集滤渣，重复操作2～4次，得菌丝粗料，将所述菌丝粗料置于低温干燥箱内干燥至恒重，粉碎，过60～100目筛，即得冬虫夏草菌丝体。

5.如权利要求4所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，扩大培养的冬虫夏草液体菌种的培养方法为：将冬虫夏草的被毛孢菌种在无菌条件下接种至斜面培养基上，置于18～20℃的摇床上培养100～120h，得斜面母菌种；将斜面母菌种接种至锥形瓶内的液体培养基中，摇床培养100～120h后即得；

所述斜面培养基包括以下重量份数的原料：10～20份的玉米汁、15～25份的蜂蜜、1.2～2.4份的琼脂；斜面培养基的pH为6～6.7；

所述液体培养基包括以下重量份数的原料：1～3份的蜂蜜、0.14～0.18份的硫酸镁、0.14～0.18份的硫胺素、0.0007～0.002份的维生素B1和50～80份的水。

6.如权利要求5所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，所述食用菌菌糠经过了预处理，具体为：将食用菌菌糠置于温度为150～200℃、压力为5～8MPa的反应釜中，保压20～30min后瞬时泄压，食用菌菌糠从反应釜的喷管中喷出，即得。

7.如权利要求6所述的冬虫夏草菌丝的发酵方法，其特征在于，聚乳酸空心微球的粒径为20～30nm；碳纳米管的粒径为30～50nm。