CN104130947A - 冬虫夏草的固体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冬虫夏草的固体发酵方法，属于生物工程技术领域。它包括以下步骤：A、将扩大培养的冬虫夏草种子发酵菌液，接种到发酵罐中的发酵培养基上进行培养；B、取样检验，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，向发酵罐内加入已灭菌处理的灭菌辅料，均匀搅拌发酵液，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体，将其均匀分布在已经灭菌处理的固体发酵房内培养床上，进行固体培养；C、取样检验，当菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右，发酵结束。本发明所述的方法能有效避免菌丝在液体培养过程中因不断搅拌、翻动而造成损伤；且菌丝孢子不易流失，从而获得优质高产的冬虫夏草菌丝产品。

Description

冬虫夏草的固体发酵方法

技术领域

本发明涉及冬虫夏草的固体发酵方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

冬虫夏草是国家二类保护植物。主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肃等省(区)的高山草甸中，具有滋肾补肺、养心益肝、增强抗病能力的功效。

近年来国内外市场需求量倍增，价格猛涨，造成人为过度采挖，使虫草资源遭到严重破坏，市场供不应求。深层发酵生产的冬虫夏草菌丝与天然虫草具有相似的成份及类同的药理作用，目前，工厂里普遍采用的是深层液体发酵工艺。

但是冬虫夏草菌丝深层发酵工艺，因为发酵系统的搅拌，翻动，造成对菌丝体的破坏和伤害，所获得的菌丝体短小，并且破碎，而且在液体分离冬虫夏草菌丝的时候，孢子因为微小而会大量流失。

发明内容

为了克服以上技术问题，本发明的目的在于提供一种冬虫夏草的固体发酵方法。此方法能有效避免菌丝在液体培养过程中因不断搅拌、翻动而造成损伤；且菌丝孢子不易流失,从而获得优质高产的冬虫夏草菌丝产品。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种冬虫夏草的固体发酵方法，包括以下步骤：

A、将扩大培养的冬虫夏草种子发酵菌液，接种到发酵罐中的发酵培养基上进行培养，冬虫夏草种子菌液的体积为发酵罐中发酵液体积的10—15％，其培养条件为：温度15—20℃、摇床转速100—120r/min、PH5.5—6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.5-1.0VVm，培养时间60—72小时；

所述发酵培养基按质量计算其组成为：葡萄糖为2.0％、蛋白胨为4.0％、KH₂PO₄为0.20％、MgSO₄为0.10％、玉米浆为0.15％、糖蜜为0.25％，其余为水；

B、取样检验，此时菌丝体生长健壮，大小均匀，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，经过发酵罐流加系统向发酵罐内加入已灭菌处理的下列灭菌辅料(均按发酵液体质量比计算)：1.7％的生物多糖增稠剂，3.5％的蛋白胨，3.5％的葡萄糖，5％的去皮马铃薯粉，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸镁，1.0％的牛肉膏，3.0％的茧蛹粉；均匀搅拌发酵液，在生物多糖的作用下，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体，将其均匀分布在已经灭菌处理的固体发酵房内培养床上，进行固体培养；

C、对冬虫夏草菌丝取样检验，菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右，发酵结束。

所述冬虫夏草种子发酵菌液的培养条件为：温度18—20℃、摇床转速110r/min、PH6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.8VVm，培养时间60—72小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所采取的冬虫夏草的固体发酵方法为先期液体扩大培养；中后期经过生物多糖增稠作用，形成固体培养，避免了菌丝在液体培养过程中，因为不断的搅拌，翻动而造成的损伤；完成冬虫夏草菌丝的最后发酵生长和对虫夏草菌固体发酵，使得菌丝孢子比较牢固的附在菌丝上，减少菌丝孢子损失，从而实现冬虫夏草菌丝的固体的培养，获得优质高产的冬虫夏草菌丝产品。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但要求保护的范围并不局限于本实施例所述内容。

实施例1、本发明为一种冬虫夏草的固体发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

A、将扩大培养的冬虫夏草种子发酵菌液，接种到发酵罐中的发酵培养基上进行培养，冬虫夏草种子菌液的体积为发酵罐中发酵液体积的10—15％，其培养条件为：温度15—20℃、摇床转速100—120r/min、PH5.5—6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.5-1.0VVm，培养时间60—72小时；

所述发酵培养基按质量计算其组成为：葡萄糖为2.0％、蛋白胨为4.0％、KH₂PO₄为0.20％、MgSO₄为0.10％、玉米浆为0.15％、糖蜜为0.25％，其余为水；

B、取样检验，此时菌丝体生长健壮，大小均匀，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，经过发酵罐流加系统向发酵罐内加入已灭菌处理的下列灭菌辅料(均按发酵液体质量比计算)：1.7％的生物多糖增稠制剂，3.5％的蛋白胨，3.5％的葡萄糖，5％的去皮马铃薯粉，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸镁，1.0％的牛肉膏，3.0％的茧蛹粉，发酵液经过均匀搅拌，在生物多糖黄原胶的作用下，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体；均匀分布在，已经灭菌处理的固体发酵房内培养床上，进行固体培养；

对冬虫夏草菌丝取样检验，菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右。

实施例2、实施例2与实施例1的不同点在于所述冬虫夏草种子发酵菌液的培养条件为：温度18—20℃、摇床转速110r/min、PH6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.8VVm，培养时间60—72小时。

实施例3、一种冬虫夏草的固体发酵方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、使用生物多糖增稠，对菌丝固体培养；

A、将扩大培养的冬虫夏草种子发酵菌液，接种到发酵罐中的发酵培养基上进行培养，冬虫夏草种子菌液的体积为发酵罐中发酵液体积的12％，其培养条件为：温度20℃、摇床转速120r/min、PH5.5、罐压0.08MPa、通气量1.0VVm，培养时间60小时；

所述发酵培养基按质量计算其组成为：葡萄糖为2.0％、蛋白胨为4.0％、KH2PO4为0.20％、MgSO4为0.10％、玉米浆为0.15％、糖蜜为0.25％，其余为水；

B、取样检验，此时菌丝体生长健壮，大小均匀，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，经过发酵罐流加系统向发酵罐内加入已灭菌处理的下列灭菌辅料(均按发酵液体质量比计算)：1.7％的生物多糖增稠制剂，3.5％的蛋白胨，3.5％的葡萄糖，5％的去皮马铃薯粉，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸镁，1.0％的牛肉膏，3.0％的茧蛹粉，发酵液经过均匀搅拌，在生物多糖黄原胶的作用下，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体；均匀分布在，已经灭菌处理的固体发酵房内培养床上，进行固体培养；

对冬虫夏草菌丝取样检验，菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右。

实施例4、以5m³发酵系统，冬虫夏草固体发酵实例为例，其发酵方法包括以下步骤：

1、冬虫夏草菌种分离培养；

选健状、子囊孢子成熟的子座，套灭菌纸袋收集孢子，在无菌条件下，取少许子囊孢子移接入斜面培养基上，然后置于15—18℃温度条件下培养，待菌落直径达到0.5—1.0cm时，挑取菌丝纯化培养。

2、摇瓶种子培养；

2.1、灭菌：培养基配方为:去皮马铃薯粉20g/L，牛肉膏10g/L，生长素0.5μg/L，茧蛹粉30g/L，蔗糖30g/L、蛋白胨15g/L、MgSO4·7H2O，0.5g/L，KH2PO4，0.5g/L、K2HPO4，0.5g/L、腺嘌呤0.5g/L，pH5.5—6.0；将配制好的液体培养基分装，250ml三角瓶装量为100ml，用棉塞和牛皮纸封口后，在高压锅内，120—125℃条件下灭菌40min。

2.2、接菌：选用纯化的试管菌种，在超净工作台上，挑取菌丝接入三角瓶液体中，每瓶接一支固体菌种。接菌时，确保无菌操作。

2.3、培养条件：菌丝生长适宜的温度为18—20℃，摇床转速为100—120r/min，培养时间为4—5天。

2.4、菌丝检测：观察菌丝生长及菌液变化情况，菌丝生长健状、速度快、菌液澄清，则表明无杂菌感染。在培养结束后，将菌液制片，在显微镜下进行镜检，镜检后，菌液中菌体均匀健壮，无其它杂菌时，方能接入种子罐中培养。

3.、500升种子罐扩大培养；

3.1、设备灭菌：使用净化蒸气对空罐、通气管道、空气过滤器及罐体附属管道、阀门进行灭菌，确保无死角，在压力为0.1—0.15MPa，温度为121—124℃条件下，持续灭菌40min。

3.2、培养基灭菌：500升种子罐扩大培养和摇瓶种子培养所用液体培养基相同，装量为容器容量的60—70％，然后在压力为0.12—0.15MPa，温度为121—126℃条件下灭菌40min，及时更换无菌风维持压力，启动冷水循环系统进行降温,待温度降到25℃左右时用种瓶对种子罐接种。

3.3、种子罐接种：将摇瓶种子液，在无菌操作台上，收集于接种瓶中。在酒精火焰保护下，启用灭菌好的无菌接种系统，将培养好的摇瓶种子接入种子罐中。

优选培养条件为：温度18—20℃、转速100—120r/min、PH5.5—6、罐压0.05—0.1MPa、通气量通气量为0.5-1.0VVm，培养时间40—48小时。

4、5m³发酵罐发酵培养；

4.1、设备灭菌：使用净化蒸气对空罐、通气管道、空气过滤器及罐体附属管道、阀门进行灭菌，确保无死角，在压力为0.1—0.15MPa，温度为121—124℃的条件下持续灭菌40min。

4.2、培养基灭菌：发酵培养基组成为：葡萄糖2.0％；蛋白胨4.0％；KH2PO4，0.20％；MgSO4，0.10％；玉米浆0.15％；糖蜜0.25％；装量为容器容量的60—70％，然后在压力0.12—0.15MPa，温度121—126℃条件下灭菌40min，及时更换无菌风维持压力，启动冷水循环系统进行降温，温度降到25℃左右。

4.3、种子罐对发酵转种：使用净化蒸气对种子罐到发酵罐的转种管道灭菌，压力0.1—0.15MPa，温度121—124℃，持续灭菌40min。灭菌时间到，及时更换无菌风吹凉保压。调节种子罐和发酵罐的压力，启用灭菌好的无菌接种系统，通过种子罐的压力大于发酵罐的压力，使种子液转接入发酵罐中。

4.4、发酵培养：培养条件为温度18—20℃、转速100—120r/min、PH5.5—6、罐压0.05—0.1MPa、通气量通气量为0.5-1.0VVm，培养60—72小时左右。

5、使用生物多糖增稠，对菌丝固体培养；

发酵罐内培养60—72小时左右，取样检验，此时菌丝体生长健壮，大小均匀，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，经过发酵罐流加系统，向发酵罐中菌液，加入已经灭菌处理的，按发酵液体质量比的：1.7％生物多糖增稠制剂，3.5％蛋白胨，3.5％葡萄糖，5％去皮鲜马铃薯粉，0.1％磷酸氢二钾，0.05％硫酸镁，1.0％牛肉膏，3.0％茧蛹粉的灭菌辅料。发酵液经过均匀搅拌，在生物多糖的作用下，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体，进行固体培养。

对获得的冬虫夏草菌丝进行检验，菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右。

Claims (2)

1.一种冬虫夏草的固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将扩大培养的冬虫夏草种子发酵菌液，接种到发酵罐中的发酵培养基上进行培养，冬虫夏草种子菌液的体积为发酵罐中发酵液体积的10—15％，其培养条件为：温度15—20℃、摇床转速100—120r/min、PH5.5—6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.5-1.0VVm，培养时间60—72小时；

所述发酵培养基按质量计算其组成为：葡萄糖为2.0％、蛋白胨为4.0％、KH₂PO₄为0.20％、MgSO₄为0.10％、玉米浆为0.15％、糖蜜为0.25％，其余为水；

B、取样检验，此时菌丝体生长健壮，大小均匀，对取样菌液经高速离心机分离菌体，当每100mL发酵液湿菌体含量大于9克时，经过发酵罐流加系统向发酵罐内加入已灭菌处理的下列灭菌辅料(均按发酵液体质量比计算)：1.7％的生物多糖增稠剂，3.5％的蛋白胨，3.5％的葡萄糖，5％的去皮马铃薯粉，0.1％的磷酸氢二钾，0.05％的硫酸镁，1.0％的牛肉膏，3.0％的茧蛹粉；均匀搅拌发酵液，在生物多糖的作用下，增稠形成富含冬虫夏草菌丝的膏状胶体，将其均匀分布在已经灭菌处理的固体发酵房内培养床上，进行固体培养；

C、对冬虫夏草菌丝取样检验，菌丝直径达到20μm左右，孢子直径12μm左右，发酵结束。

2.如权利要求1所述的冬虫夏草的固体发酵方法，其特征在于：所述冬虫夏草种子发酵菌液的培养条件为：温度18—20℃、摇床转速110r/min、PH6、罐压0.05—0.1MPa、通气量0.8VVm，培养时间60—72小时。