CN107118003A - 一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法和应用，该方法包括以下步骤：1）将蛹虫草的纯菌种接种到液体培养液中，摇床培养得到萌发初期的液体菌种；2）将摇床得到的液体菌种转接到发酵培养液中，通入无菌空气发酵培养得到发酵菌种。本发明还提供了一种高效的菌种培养液的配方，提高了菌种活力，菌球繁殖速度快，污染率低，缩短了发菌周期，从而提高了蛹虫草子实体的生产效率和产量。

Description

一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法和应用
技术领域
本发明涉及应用生物技术原理人工培育真菌的技术领域，具体涉及蛹虫草的培育，更具体地涉及一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法和应用。
背景技术
蛹虫草（Cordyceps militaris）隶属于真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草属（Cordyceps）。蛹虫草是非常著名的药食两用的子囊真菌，也是获得虫草素的主要来源，具有很高的开发利用价值。因野生的虫草十分稀少，资源极缺，为满足市场需求，正积极推进虫草的人工培育，而且人工培育的虫草有效成分接近野生，部分含量甚至高于野生几倍或者几十倍。
在目前的相关技术中，通常都是试管种转接到液体培养液中，再以20℃以下200转/分钟发酵培养7天，即可得到液体生产种。但是，在这个摇床培养的过程中不能给液体菌种定时补充氧气，且液体菌种只能填充摇瓶容积的30%以下，存在摇制时间长、污染率高、发菌时间慢、菌种浓度低和生产效率不高等问题。
发明内容
本发明提供一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，包括以下步骤：
1）将蛹虫草的纯菌种接种到液体培养液中，摇床培养得到萌发初期的液体菌种；
2）将摇床得到的液体菌种转接到发酵培养液中，通入无菌空气发酵培养得到发酵菌种。
本发明提供的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，获得的菌种活力高，菌球繁殖速度快，污染率低，从而提高了蛹虫草子实体的生产效率和产量。
进一步，所述步骤1）中的纯菌种通过孢子弹射或组织分离后得到。
进一步，所述步骤1）中的液体培养液按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B1 0.0009-0.001份。
进一步，所述步骤1）中的液体培养液按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B1 0.00095份。
进一步，所述步骤2）中的发酵培养液按照重量份数计，包括：马铃薯4.6-5份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.25-0.3份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.09-0.1份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B1 0.0009-0.001份。
进一步，所述步骤2）中的发酵培养液按照重量份数计，包括：马铃薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氢钾0.1份，硫酸镁0.1份，脱脂蚕蛹粉0.1份，水50份，维生素B10.001份。
进一步，所述蛋白胨中总氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。
进一步，所述步骤1）中，以200r/min摇床培养2-3天，培养温度为20-23℃。
进一步，所述步骤2）中，通入无菌空气培养5天，培养温度为20-21℃。
进一步，所述步骤2）中，在避光的环境下发酵培养。
进一步，制备培养液所使用的水为矿泉水或蒸馏水，PH值为6-7。
本发明蛹虫草液体发酵菌种的培育方法可广泛用于蛹虫草的培育中，从而提高蛹虫草子实体的生产效率和产量。
本发明提供一种培育蛹虫草的方法，包括：将上述蛹虫草液体发酵菌种的培育方法制备的发酵菌种转接至子实体培养基，继续进行培养。
进一步，将上述蛹虫草液体发酵菌种的培育方法制备的发酵菌种转接至固体培养基，放置到暗培室避光培养得到菌丝体，将菌丝体转色，进行子实体培养。
本发明采用摇床培养与发酵罐发酵培养相结合的方式，解决了背景技术存在的问题。并且，使用的培养液可提供最合适的碳氮比，营养更全面，使虫草在发菌过程中发菌快、稳定，减少菌种的退化，增强抵抗力。与采用传统发菌方法和配方的培养液相比，本发明杂菌污染率降低了15%，后期蛹虫草产量增加了10%-15%。
具体实施方式
在一个具体的实施方案中，实施步骤例如包括：配制摇瓶液体培养液及发酵罐发酵液，将固体菌种转接到液体三角瓶培养基中，在20-23℃下以200转/分钟摇床培养2-3天得到液体菌种，将所述得到的液体菌种转接到灭菌好的发酵罐中，在20-21℃发酵5天即可得到发酵菌种，将所述发酵液转接到子实体培养基上，放置到暗培室避光培养得到菌丝体，将菌丝体转色、进行子实体培养，即可得到高产、虫草素含量高的子实体。
在蛹虫草的液体菌种发酵方法中，不同阶段按照不同的配方及不同方法进行菌种的制作：将固体试管种转接到液体摇床培养液中，通过一段时间的培养得到摇床液体菌种；将摇床液体菌种转接到发酵罐培养液中，继续培养一段时间得到发酵罐菌种；将发酵菌种进行稀释转接到子实体培养基上，继续培养一段时间见光，进行子实体培养，即可得到污染率低、高产的虫草子实体。通过不同的培养条件控制蛹虫草菌种不同时期的生长特性，其中的发酵过程可使菌种稳定、高效的繁殖和生长，因此其产量高，虫草素含量高。
本发明的方法对蛹虫草菌种的选择没有特别要求。
以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但这些内容不应理解为对本发明的限制。其中未具体载明的操作方法依照本领域的常规操作进行，使用的试剂、原料和菌种等均市售获得。其中培养基的组分购自北京奥博星。
实施例（发酵菌种）
第一步 配制摇床培养液
液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B10.00095份。
具体操作如下：称取马铃薯200g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至1137ml，然后分别加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，脱脂蚕蛹粉2.0g，维生素B1 0.02g，溶解搅拌均匀分装在500L的三角瓶中，每瓶约280ml，将装有液体三角瓶放置灭菌，121℃灭菌30分钟，灭菌后取出放凉备用。
将灭菌放凉的三角瓶培养基放置于超净工作台上紫外线灭菌30min，再将试管固体菌种在无菌的环境下转接到三角瓶液体培养液中，在22℃下以200转/分钟摇床培养3天得到液体菌种。
注：培养基的配制一定要严格控制质量和数量，例如马铃薯以200g最佳，为了使其有效的营养得到更好的释放，应在制作过程中把马铃薯切成小块，此外配制所需要的水为矿泉水，灭菌时温度控制在121℃，灭菌时间不要超过30min。
第二步 配制发酵罐发酵液并灭菌
发酵罐液体培养液按照重量份数计，包括：马铃薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氢钾0.1份，硫酸镁0.1份，脱脂蚕蛹粉0.1份，水50份，维生素B1 0.001份。
具体操作如下：称取马铃薯4800g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至50升，然后分别加入1000g葡萄糖，蛋白胨250g，磷酸二氢钾100g，硫酸镁100g，脱脂蚕蛹粉100g，维生素B1 1g；溶解搅拌均匀倒至发酵罐中进行高温灭菌。
发酵罐灭菌流程：（本发酵罐用于液体菌种发酵）首先将发酵罐内外胆的排气阀门打开，确定内外胆无压力，然后关闭下阀门；在外胆中注入清水至外胆2/3处关闭上阀门，将配制好的溶液倒至发酵罐中；盖好盖子旋紧四周紧固螺母；开启电源总开关；接通加热电源加热至125℃保温15分钟，按照顺序开启阀门，菌种输出阀及下级阀；管道消毒二级阀、管道消毒一级阀、清洁空气阀、一级过滤器排气阀，最后开启蒸汽阀门，保持15分钟，注意各管道排放蒸汽的均匀性。按照顺序再关闭各个阀门，先干燥一级过滤器，接通气源，开一级过滤器排气阀，开中间排气阀，保持20分钟，至在中间排气阀手感干燥，关闭中间排气阀，开二级过滤器阀门，保持20分钟，至该阀门手感干燥，关闭阀门。关闭加热电源，自然冷却至100℃以下，此时内胆压力表显示0.1MPa，开一分钟一级过滤器排气阀，随后关闭该阀，开启气泵，打开气源，清洁空气阀，保持内胆正压0.05MPa。开启热水阀，再打开外胆的进水阀，用冷水将热水顶出，控制好水的流量，冷却内胆溶液至常温18℃。
将加料口的火焰圈加入95%的酒精，并点燃，先少量开排气阀，使压力降至0.02MPa并保持，开加料口到刚松动并旋下，按照无菌操作放入附近的无菌盒子中，再将上述得到的液体菌种转接到灭菌好的发酵罐料口，随后按照无菌操作取出加料口，在火焰圈上消毒，盖上旋紧，再开全上排气阀。
第三步 培养发酵菌种液
将接种好的稀释罐菌液转移到消毒好的避光培养间中，通好无菌空气气流量60L/min，培养温度为21℃，发酵5天，即可得到发酵菌种。
所得发酵菌种经过稀释再转接至子实体培养基上，再经过培养转色以及子实体培养得到污染率低、产量高的子实体。
对比例（摇制菌种）
配制摇床培养液
液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B10.00095份。
具体操作如下：称取马铃薯200g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至1137ml，然后分别加入葡萄糖18.9g，加入蛋白胨9.5g，酵母浸粉9.5g，磷酸二氢钾2.0g，硫酸镁1.0g，脱脂蚕蛹粉2.0g，维生素B1 0.02g，溶解搅拌均匀分装在500L的三角瓶中，每瓶约280ml，将装有液体三角瓶放置灭菌，121℃灭菌30分钟，灭菌后取出放凉备用。
将灭菌放凉的三角瓶培养基放置于超净工作台上紫外线灭菌30min，再将试管固体菌种在无菌的环境下转接到三角瓶液体培养液中，在22℃下以200转/分钟摇床培养8天得到液体菌种。
注：培养基的配制一定要严格控制质量和数量，例如马铃薯以200g最佳，为了使其有效的营养得到更好的释放，应在制作过程中把马铃薯切成小块，此外配制所需要的水为矿泉水，灭菌时温度控制在121℃，灭菌时间不要超过30min。
所得液体菌种经过稀释再转接至子实体培养基上，再经过培养转色以及子实体培养得到子实体（该部分的操作与实施例相同）。
比较结果：菌种转接至子实体培养基后，实施例的杂菌污染率相比对比例降低15%，实施例的后期产量相比对比例增加13%。
另外，相比较于摇床制作的液体菌种，发酵菌种比摇床菌种发的更快更均匀。比较在子实体上的发菌，发酵菌种6-7天即可发满，摇床菌种则需要10-12天。比较转色时间，发酵菌种接种的后期需要2天转色，而摇床菌种接种的后期则需要4天转色。
以上所述仅为本发明的优选实施方案，并不用于限制本发明，对于本领域的科技人员本发明可以有更多改变和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进均包含在本发明内。

Claims (10)

1.一种蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，包括以下步骤：
1）将蛹虫草的纯菌种接种到液体培养液中，摇床培养得到萌发初期的液体菌种；
2）将摇床得到的液体菌种转接到发酵培养液中，通入无菌空气发酵培养得到发酵菌种。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤1）中的液体培养液按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.8-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B1 0.0009-0.001份。
3.根据权利要求2所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤1）中的液体培养液按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.9份，蛋白胨0.45份，酵母浸粉0.45份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B10.00095份。
4.根据权利要求1所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤2）中的发酵培养液按照重量份数计，包括：马铃薯4.6-5份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.25-0.3份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.09-0.1份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B10.0009-0.001份。
5.根据权利要求4所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤2）中的发酵培养液按照重量份数计，包括：马铃薯4.8份，葡萄糖1份，蛋白胨0.25份，磷酸二氢钾0.1份，硫酸镁0.1份，脱脂蚕蛹粉0.1份，水50份，维生素B1 0.001份。
6.根据权利要求2至5任一项所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述蛋白胨中总氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%。
7.根据权利要求1至5任一项所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤1）中，以200r/min摇床培养2-3天，培养温度为20-23℃。
8.根据权利要求1至5任一项所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法，其特征在于，所述步骤2）中，在避光的环境中通入无菌空气培养5天，培养温度为20-21℃。
9.权利要求1-8任一项所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法在蛹虫草培育中的应用。
10.一种培育蛹虫草的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-8任一项所述的蛹虫草液体发酵菌种的培育方法制备的发酵菌种转接至子实体培养基，继续进行培养。
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