CN108865904B

CN108865904B - 一种中国被毛孢扩大培养基及其培养的中国被毛孢和培养方法

Info

Publication number: CN108865904B
Application number: CN201811002350.6A
Authority: CN
Inventors: 沙涛; 张亚平; 何志红; 杨小雨; 王丁卉
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2018-08-30
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2038-08-30
Also published as: CN108865904A

Abstract

本发明提供了一种中国被毛孢扩大培养基及其培养的中国被毛孢和培养方法，属于微生物培养技术领域。在本发明中，每1L扩大培养基包括以下含量的组分：8～12g的蚕蛹浸提液、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉和0.05～0.2g的维生素B1，水定容至1L。利用本发明提供的扩大培养基培养的中国被毛孢，与天然冬虫夏草成分相比，差异较小，说明本发明培养的中国被毛孢有成为冬虫夏草的替代品的潜质。

Description

一种中国被毛孢扩大培养基及其培养的中国被毛孢和培养方法

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种中国被毛孢扩大培养基及其培养的中国被毛孢和培养方法。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是一种被人们普遍接受的药用真菌，是鳞翅目蝙蝠蛾属的虫草蝙蝠蛾(Hepialus armoricamus Oberthur)幼虫感染中国被毛孢真菌(Hirsutella sinensis)后，在体内大量繁殖而形成的虫菌复合体。冬虫夏草是我国传统名贵中药，与人参、鹿茸齐名，具有抑制肿瘤细胞生长、调节免疫、促进造血、抗炎抑菌、抗心律失常、抗病毒等作用。

近20年来，国内的一些科研院所相继开展了人工培养和深层发酵培养虫草菌丝体的研究，但虫草真菌保健品大部分停留在利用液体培养菌丝体阶段，利用中国被毛孢菌种发酵方法生产出菌粉，其缺点是操作步骤繁多，不易于大规模生产，菌粉中肾保健作用有效成分较低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种有助于缩小发酵产物与天然冬虫夏草活性成分差异的中国被毛孢扩大培养基及其培养的中国被毛孢和培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种中国被毛孢扩大培养基，每1L扩大培养基包括以下含量的组分：8～12g的蚕蛹浸提液、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉和0.05～0.2g的维生素B1，水定容至1L。

优选的，所述蚕蛹浸提液的制备方法包括如下步骤：

(1)将蚕蛹干燥、破碎，得蚕蛹粉；

(2)将所述蚕蛹粉与水混合，90～100℃温度下浸提15～30min，用八层纱布过滤，固液分离，得蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。

优选的，所述步骤(2)所述蚕蛹粉的质量与水的体积比为1kg：1.8～2.5L。

本发明提供了一种中国被毛孢的培养方法，包括如下步骤：

(a)将中国被毛孢原始菌种接种至改良固体PDA培养基，活化培养，得活化中国被毛孢菌种；

(b)将所述活化中国被毛孢菌种接种至上述方案所述扩大培养基中，15～18℃扩大培养20～40d，得中国被毛孢液体菌种；

(c)将所述中国被毛孢液体菌种接种至上述方案制备蚕蛹浸提液时产生的蚕蛹渣中，发酵培养，得到中国被毛孢菌粉。

优选的，所述步骤(a)中每1L改良固体PDA培养基包括以下含量的组分：150～250g的马铃薯、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉、0.3～0.8g的KH2PO4、0.3～0.8g的MgSO4，8～12g的琼脂，水定容至1L。

优选的，所述步骤(a)中活化培养的温度为15～18℃，活化培养的时间为45～60d。

优选的，按照体积质量比计，所述步骤(c)中中国被毛孢液体菌种的接种量为蚕蛹渣质量的1％～5％；发酵培养的温度为15～20℃，发酵培养的时间为180～270d。

本发明还提供了上述方法制备得到的中国被毛孢菌粉

有益效果：本发明提供了一种中国被毛孢扩大培养基，每1L扩大培养基包括以下含量的组分：8～12g的蚕蛹浸提液、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉和0.05～0.2g的维生素B1，水定容至1L。本发明以蚕蛹浸提液作为扩大培养基的主要成分，使中国被毛孢吸收利用，与天然冬虫夏草成分相比，差异较小，说明本发明培养的中国被毛孢有成为冬虫夏草的替代品的潜质。

本发明提供了利用上述扩大培养基培养中国被毛孢的方法，将活化后的中国被毛孢菌种接种至上述扩大培养基进行扩繁，再将扩繁后的中国被毛孢液体菌种接种蚕蛹渣固体培养。经测定：按照本发明所述方法得到的培养产物与天然冬虫夏草的主要成分一致，为人工生产冬虫夏草类似药品提供了新的思路，且培养步骤简单，有利于大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例4中HPLC的检测结果，其中，图1-1为本发明实施例4得到的中国被毛孢菌粉成分，图1-2为天然冬虫夏草成分，图1-3为50％甲醇对照。

具体实施方式

本发明提供的所述扩大培养基中包括蚕蛹浸提液。在本发明中，每1L扩大培养基中蚕蛹浸提液的用量为8～12g，优选为10g。所述蚕蛹浸提液为培养基提供生长因子及氮源。

在本发明中，所述蚕蛹浸提液优选按照如下方法制备获得：

(1)将蚕蛹干燥，破碎，得蚕蛹粉；

(2)将所述蚕蛹粉与水混合，浸提，固液分离，得蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。

本发明将蚕蛹干燥、破碎，得蚕蛹粉。在本发明中，所述干燥的方式优选为自然晾干。所述破碎后蚕蛹粉的粒径优选≤1mm。

得到蚕蛹粉后，本发明将所述蚕蛹粉与水混合，浸提，固液分离，得蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。在本发明中，所述蚕蛹粉的质量与水体积比优选为1kg：1.8～2.5L，更优选为1kg：2L。所述浸提的温度优选为90～110℃，更优选为98～102℃；浸提的时间优选为15～30min，更优选为20min。本发明对固液分离的方法不作特别限定，本领域常规采用的过滤或离心等方法均可。

本发明所述扩大培养基中还包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和维生素B1。在本发明中，每1L扩大培养基中葡萄糖的用量为15～25g，优选为20g；所述蛋白胨的用量为8～12g，优选为10g；酵母粉的用量为3～8g，优选为5g；维生素B1的用量为0.05～0.2g，优选为0.1g。在本发明中，所述葡萄糖的功能是提供碳源，所述蛋白胨的功能是提供氮源，所述酵母粉和维生素B1为培养基提供生长因子。本发明对所述葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和维生素B1的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。本发明对所述扩大培养基的制备的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方案即可。

利用本发明提供的扩大培养基培养中国被毛孢，有利于缩小发酵的产物与天然冬虫夏草中成分的差别。

本发明提供了一种利用上述扩大培养基培养中国被毛孢的方法，包括如下步骤：

(a)将中国被毛孢原始菌种接种至改良固体PDA培养基，活化培养，得活化后的中国被毛孢菌种；

(b)将所述活化后的中国被毛孢菌种接种至上述方案制备的扩大培养基中，扩繁培养，得中国被毛孢液体菌种；

(c)将所述中国被毛孢液体菌种接种至上述方案中蚕蛹浸提液制备时产生的副产物蚕蛹渣中，固体培养，得到中国被毛孢菌粉。

本发明先将中国被毛孢原始菌种接种至改良固体PDA培养基，活化培养，得活化后的中国被毛孢菌种。在本发明中，所述改良固体PDA培养基的组成优选为：每1L改良固体PDA培养基中包括150～250g的马铃薯、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉、0.3～0.8g的KH₂PO₄、0.3～0.8g的MgSO₄和8～12g的琼脂；更优选为：每1L改良固体PDA培养基中包括200g的马铃薯、20g的葡萄糖、10g的蛋白胨、5g的酵母粉、0.5g的KH₂PO₄、0.5g的MgSO₄和10g的琼脂。在本发明的实施例中，所述改良固体PDA培养基优选按照如下步骤配制：先将马铃薯洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加8～12g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH₂PO₄、MgSO₄，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者三角瓶，加塞、包扎，(121℃)灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者到平板，冷却后贮存备用。本发明对上述改良固体PDA培养基的配制原料的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。所述改良固体PDA培养基在本发明中用于中国被毛孢菌种的活化培养，所述活化培养的温度优选为15～18℃，更优选为16～17℃。所述活化培养的时间优选为45～60d，更优选为50～55d。

得活化后的中国被毛孢菌种后，本发明将所述活化后的中国被毛孢菌种接种至所述扩大培养基中，扩繁培养，得中国被毛孢液体菌种。在本发明中，所述扩繁培养的温度优选为15～18℃，更优选为16～17℃。所述扩繁培养的时间优选为20～40d，更优选为25～35d。

得中国被毛孢液体菌种后，本发明将所述中国被毛孢液体菌种接种至上述制备蚕蛹浸提液时产生的副产物蚕蛹渣中，固体培养。在本发明中，所述中国被毛孢液体菌种的接种量优选为蚕蛹渣质量的1％～5％，更优选为2％～4％；所述固体培养的温度优选为15～20℃，更优选为16～19℃。所述固体培养的时间优选为180～270d，更优选为210d～225d。在本发明更优选的实施方案中，所述固体培养分两阶段进行，第一阶段的培养时间优选为180d，第一阶段培养结束后，将培养物搅拌均匀后，再进入第二阶段培养，第二阶段的培养时间优选为60～90d，更优选为75d。

本发明提供了利用上述扩大培养基培养得到的中国被毛孢菌粉。经测定：按照本发明所述方法得到的培养产物与天然冬虫夏草的主要成分一致，且培养步骤简单，有利于大规模生产。

下面结合实施例对本发明提供的一种中国被毛孢扩大培养基及其培养中国被毛孢的方法和产品进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)菌种活化：称量200g马铃薯粉、20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母粉、0.5g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄、10g琼脂，加水溶解定容至1L，搅拌均匀，121℃灭菌20分钟，放斜面或平板，制得改良固体PDA培养基。接种中国被毛孢菌种，17℃培养52天，得活化后的中国被毛孢菌种，待用。

(2)菌种扩繁：将6g蚕蛹粉与12ml水混合，煮沸20mim浸提，过滤，分别得到蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。取蚕蛹浸提液、称量20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母粉和0.1g维生素B1，混合后加水溶解、定容至1L，得到扩大培养基。将扩大培养基分装250ml三角瓶，每瓶150ml，121℃灭菌20min。接种活化后的中国被毛孢菌种，17℃培养30天，得到中国被毛孢液体菌种，待用。

(3)固体培养：以上述蚕蛹渣为固体培养基，接入占固体培养基重量1～5％的中国被毛孢液体菌种，在18℃条件下培养180天后，无菌操作用长勺搅拌均匀，再培养75天，培养基表面长满菌丝。

(4)将培养物干燥、粉碎(PALLASKR帕拉斯多功能破壁料理机，破壁功能粉碎)、100目过筛，即得中国被毛孢菌粉。

实施例2

(1)菌种活化：称量220g马铃薯粉、18g葡萄糖、9g蛋白胨、4g酵母粉、0.5g KH₂PO₄、0.3gMgSO₄、9g琼脂，加水溶解定容至1L，搅拌均匀，121℃灭菌20分钟，放斜面或平板，制得改良固体PDA培养基。接种中国被毛孢菌种，16℃培养45天，得活化后的中国被毛孢菌种，待用。

(2)菌种扩繁：将6g蚕蛹粉与13ml水混合，煮沸18mim浸提，过滤，分别得到蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。取蚕蛹浸提液、称量21g葡萄糖、11g蛋白胨、7g酵母粉和0.06g维生素B1，混合后加水溶解、定容至1L，得到扩大培养基。将扩大培养基分装250ml三角瓶，每瓶150ml，121℃灭菌20min。接种活化后的中国被毛孢菌种，18℃培养34天，得到中国被毛孢液体菌种，待用。

(3)固体培养：以上述蚕蛹渣为固体培养基，接入占固体培养基重量5％的中国被毛孢液体菌种，在19℃条件下培养190天后，无菌操作用长勺搅拌均匀，再培养85天，培养基表面长满菌丝。

实施例3

(1)菌种活化：称量180g马铃薯粉、23g葡萄糖、11g蛋白胨、6g酵母粉、0.4g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄、11g琼脂，加水溶解定容至1L，搅拌均匀，121℃灭菌20分钟，放斜面或平板，制得改良固体PDA培养基。接种中国被毛孢菌种，18℃培养60天，得活化后的中国被毛孢菌种，待用。

(2)菌种扩繁：将5g蚕蛹粉与11ml水混合，煮沸25mim浸提，过滤，分别得到蚕蛹浸提液和蚕蛹渣。取蚕蛹浸提液、称量19g葡萄糖、9g蛋白胨、4g酵母粉和0.15g维生素B1，混合后加水溶解、定容至1L，得到扩大培养基。将扩大培养基分装250ml三角瓶，每瓶150ml，121℃灭菌20min。接种活化后的中国被毛孢菌种，16℃培养26天，得到中国被毛孢液体菌种，待用。

(3)固体培养：以上述蚕蛹渣为固体培养基，接入占固体培养基重量5％的中国被毛孢液体菌种，在19℃条件下培养170天后，无菌操作用长勺搅拌均匀，再培养69天，培养基表面长满菌丝。

实施例4

利用HPLC检测，对比本发明实施例1得到的中国被毛孢菌粉与天然冬虫夏草成分的差异。

(1)样品处理：将固体样品置于电热恒温鼓风干燥箱中，60-80℃干燥，再用研钵将其研磨成粉状，用电子天平称取2.0g溶于25mL 50％甲醇溶液，超声处理30min，静止24h，取上清液，在残渣中加25mL 50％甲醇，作同样处理，收集上清液，超声30min；甩脱脂棉过滤，再用滤纸过滤，滤液进行旋蒸，旋蒸至3～5mL，按1:1体积加入50％甲醇稀释，再用0.35μmol微孔滤膜过滤，滤液取1.5mL装入2.5mLHPLC样品瓶中，上样检测。

(2)洗柱：所用甲醇，乙腈均为色谱纯，且甲醇，乙腈及重蒸水都需抽滤，然后置于超声波清洗仪中超声清洗20min。更换A液，即水相(本试验所用水相需按1/1000体积添加甲酸)，将处理好的水、乙腈、甲醇分别加入A瓶、B瓶、C瓶(设置容量瓶容积为0.99L)内，更换柱子(SB-C185um，4.6×250mm)，设置B液浓度为95％，梯度为5％，至5％(A液会自动变为5％至95％)，流速1mL/min进行洗柱，在此过程中，待四条色谱线趋于平衡时再调梯度，若色谱线所在位置相距较远时，可通过调整按钮来调节其位置，以达到更好的判断效果。

(3)检测样品：将装有滤液的HPLC样品管放入美国安捷伦1200HPLC高效液相色谱仪中，设置跑样体系，进行检测，跑样体系：

柱温：30℃

流速：1.0mL/min

进样量：20μL

吸收光：204nm

选择流动相：

①乙腈-水梯度洗脱，洗脱流程见表1

表1，洗脱流程

对照：取1.5mL50％甲醇作为对照。

重复:每个样品按同样的体系进样检测3次。

检测结果见图1，其中，图1-1为本发明实施例4得到的中国被毛孢菌粉成分，图1-2为天然冬虫夏草成分，图1-3为50％甲醇对照，色谱图检测波长为204nm。

图1中，0～5min，12.5～15min的峰均为溶剂峰；在6.5min、7min、8.5min、11.5min、12min处，蚕蛹粉、冬虫夏草均有峰；冬虫夏草在10min、10.75min有峰，蚕蛹粉则没有；蚕蛹粉在5.5min、6min、8min、9.5min、13min处及15～17.5min均有峰，冬虫夏草则没有，表明这些峰处的成分是蚕蛹粉特有的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种中国被毛孢的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(b)将所述活化中国被毛孢菌种接种至扩大培养基中，15～18℃扩大培养20～40d，得中国被毛孢液体菌种；

(c)将所述中国被毛孢液体菌种接种至蚕蛹渣中，发酵培养，得到中国被毛孢菌粉；

所述步骤(a)中每1L改良固体PDA培养基包括以下含量的组分：150～250g的马铃薯、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉、0.3～0.8g的KH2PO4、0.3～0.8g的MgSO4，8～12g的琼脂，水定容至1L；

每1L扩大培养基包括以下含量的组分：8～12g的蚕蛹浸提液、15～25g的葡萄糖、8～12g的蛋白胨、3～8g的酵母粉和0.05～0.2g的维生素B1，水定容至1L；

所述蚕蛹浸提液和蚕蛹渣的制备方法包括如下步骤：

(1)将蚕蛹干燥、破碎，得蚕蛹粉；

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)所述蚕蛹粉的质量与水的体积比为1kg：1.8～2.5L。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(a)中活化培养的温度为15～18℃，活化培养的时间为45～60d。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的培养方法，其特征在于，按照体积质量比计，所述步骤(c)中中国被毛孢液体菌种的接种量为蚕蛹渣质量的1％～5％；发酵培养的温度为15～20℃，发酵培养的时间为180～270d。