CN106676032B - 一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，所述方法包括采用茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2进行液体发酵，以及在茯苓发酵用液体种子培养基和/或液体发酵培养基中加入马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B。利用本发明提供的方法可以实现茯苓菌丝体产量的最优最大化，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，可工业化生产茯苓酸，不仅解决了利用松树兜来栽培茯苓菌核对野生松林资源的破坏，而且为将来茯苓药食用价值的综合开发和工厂化生产奠定基础和提供技术保障；本发明工艺简单、有效、发酵周期短、在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及药用真菌液体发酵领域，尤其涉及一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法。
背景技术
茯苓属药用真菌，不仅具有医疗保健作用，还可以食用，是我国传统的名贵中药材和历史悠久的食品。茯苓味甘、淡、平，具有利水渗湿、健脾补中、宁心安神等功效。茯苓酸是茯苓特有的一种四环三萜化合物，也是茯苓的主要活性成分之一，具有多种与药效有关的药理活性。据研究报道茯苓酸在干燥茯苓菌核中的含量在0.1462％-0.2996％。茯苓酸具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、镇静催眠等方面的作用。目前茯苓酸主要来源于茯苓菌核，而利用松树兜来栽培茯苓菌核对松林破坏严重。开发研究新方法来获取茯苓酸十分必要。
CN104357524A公开了一种使茯苓高产三萜酸的纯小麦培养基，表明了一套测定纯小麦栽培料培养过程中的总三萜、多糖和三萜酸的方法与步骤，通过该方法测定的固体栽培料在培养到25天使三萜酸达到最大量，其中胞外三萜酸高达130mg/L，是液体发酵胞外三萜酸浓度的2倍以上。然而，其发酵周期较长，不利于加快工业化生产。
因此，如何研发一种发酵周期短、茯苓菌丝体和茯苓酸产量高的培养方法已成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，利用该方法可以实现茯苓菌丝体产量的最大化，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，可工业化生产茯苓酸，不仅解决了利用松树兜来栽培茯苓菌核对野生松林资源的破坏，而且为将来茯苓药食用价值的综合开发和工厂化生产奠定基础和提供技术保障。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏日期为2016年1月15日，保藏编号为GDMCC No.60007。
该菌为多孔科菌真菌，菌丝为多核菌丝体，无锁状联合，粗壮分枝少，具有明显的隔膜。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂平板上的生长状态为：5-7天菌丝铺满直径为75mm的平板，具有茯苓特有的芳香味。培养基基底黄色，菌丝乳白色，气生菌丝发达，爬壁能力强，常有网状交联，交联处有细小淡黄色水珠，形成菌索。
本发明所述茯苓菌株ZJ2经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，将获得的序列与Genbank中所登录的茯苓序列比对，与茯苓(Poria cocos)相似性为99％。
第二方面，本发明还提供了一种茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，所述液体种子培养基的组成为：
马铃薯150-200g，葡萄糖5-10g，纤维素5-10g，马尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO4 2-3g，MgSO4·7H2O 1.5-2g，KH2PO4 2-4g，复合维生素B0.1-0.2g，其余为水；并调节pH至6.5-7。
本发明所提供的茯苓发酵用液体种子培养基中，由于在原料中增加了马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B组分，三者产生协同增效作用，可以大幅增加茯苓菌丝体产量，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，并解决了利用松树兜来栽培茯苓菌核而带来的对野生松林资源破坏的技术问题。
根据本发明，以每升计，所述马铃薯的含量为150-200g，例如150g、155g、160g、165g、170g、175g、180g、185g、190g、195g或200g；所述葡萄糖的含量为5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述纤维素的含量为5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述马尾松根浸提物的含量为20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述甘油的含量为1-3g，例如1g、1.2g、1.5g、1.8g、2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述(NH4)2SO4的含量为2-3g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述MgSO4·7H2O的含量为1.5-2g，例如1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g或2g；所述KH2PO4的含量为2-4g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g、3g、3.3g、3.5g、3.8g或4g；所述复合维生素B的含量为0.1-0.2g，例如0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。
本发明中，所述茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，所述液体种子培养基优选的组成为：
马铃薯180-200g，葡萄糖8-10g，纤维素5-8g，马尾松根浸提物25-30g，甘油1-2g，(NH4)2SO4 2-2.5g，MgSO4·7H2O 1.5-1.8g，KH2PO4 2-2.5g，复合维生素B 0.12-0.18g，其余为水；并调节pH至6.5-6.8。
本发明中，所述茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，所述液体种子培养基进一步优选的组成为：
马铃薯200g，葡萄糖10g，纤维素5g，马尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 1.5g，KH2PO4 2.5g，复合维生素B 0.14g，其余为水；并调节pH至6.5。
根据本发明，所述马尾松浸提物可以采用如下方法进行制备：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在40-45℃下干燥至恒重，粉碎后，过30-40目筛；称取20-30g马尾松根粉末放入容器中，加入2-3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬20-40min，纱布过滤除去沉淀；滤液经6000-8000r/min离心5-15min后，取上清液，得到所述马尾松浸提物。
示例性地，所述马尾松浸提物具体采用如下方法进行制备：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在40℃下干燥至恒重，粉碎后，过40目筛；称取30g马尾松根粉末放入500mL的烧杯中，加入2-3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬30min，纱布过滤除去沉淀，滤液经6000r/min离心10min后，把上清液定容至相当于含原材料30g/L，得到所述马尾松浸提物。
本发明中的马尾松浸提物优选采用上述方法制得，但并非仅限该方法，只要本领域技术人员根据公知技术可实现对马尾松树根的浸提即可。
根据本发明，所述纤维素，例如可以是食品级的微晶纤维素，其粒径为20-80μm，极限聚合度≤350。但并非仅限于此，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。
根据本发明，所述复合维生素B是指：每0.1g复合维生素B中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。根据本发明，所述茯苓发酵用液体种子培养基可以应用于第一方面所述茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的液体发酵培养，也可应用于其它公知的茯苓菌株，其对于实现茯苓菌丝体产量的增加，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量都起到至关重要的作用。
第三方面，本发明还提供了一种茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，所述液体发酵培养基的组成为：
葡萄糖20-30g，纤维素5-10g，马尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO42-3g，MgSO4·7H2O 1.5-2g，KH2PO4 1-2g，KNO3 1-2g，复合维生素B 0.1-0.2g，其余为水；并调节pH至6.5-7。
本发明所提供的茯苓发酵用液体发酵培养基中，由于在原料中增加了马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B组分，三者产生了协同增效作用，可以大幅增加茯苓菌丝体产量，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，并解决了利用松树兜来栽培茯苓菌核而带来的对野生松林资源破坏的技术问题。
根据本发明，以每升计，所述葡萄糖的含量为20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述纤维素的含量为5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述马尾松根浸提物的含量为20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述甘油的含量为1-3g，例如1g、1.2g、1.5g、1.8g、2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述(NH4)2SO4的含量为2-3g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述MgSO4·7H2O的含量为1.5-2g，例如1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g或2g；所述KH2PO4的含量为1-2g，例如1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.5g、1.6g、1.7g、1.9g或2g；所述KNO3的含量为1-2g，例如1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.5g、1.6g、1.7g、1.9g或2g；所述复合维生素B的含量为0.1-0.2g，例如0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。
本发明中，所述茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，所述液体发酵培养基优选的组成为：
葡萄糖25-30g，纤维素8-10g，马尾松根浸提物25-30g，甘油1-2g，(NH4)2SO42-2.2g，MgSO4·7H2O 1.5-1.6g，KH2PO4 1-1.2g，KNO3 1-1.5g，复合维生素B0.11-0.13g，其余为水；并调节pH至6.5-6.6。
本发明中，所述茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，所述液体发酵培养基进一步优选的组成为：
葡萄糖30g，纤维素10g，马尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO4 1g，KNO3 1g，复合维生素B 0.14g，其余为水；并调节pH至6.5。
根据本发明，所述茯苓发酵用液体发酵培养基中的马尾松浸提物与本发明第二方面所述的马尾松浸提物制备方法相同，在此不做赘述。
根据本发明，所述茯苓发酵用液体发酵培养基中的纤维素和复合维生素B的具体组分及选择与本发明第二方面所述的纤维素和复合维生素B组分的选择相同，在此不做赘述。
根据本发明，所述茯苓发酵用液体发酵培养基可以应用于第一方面所述茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的液体发酵培养，也可应用于其它公知的茯苓菌株，其利于实现茯苓菌丝体产量的增加，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，并缩短发酵周期。
采用将所述茯苓发酵用液体发酵培养基与本发明第二方面所述的茯苓发酵用液体种子培养基进行组合，将其共同用于茯苓的液体发酵培养时，相比采用单一的培养基，即单独采用所述液体发酵培养基或所述液体种子培养基，这两者可产生协同作用，进一步增加了茯苓菌丝体产量，提高了菌丝体中茯苓酸的含量，从根本上解决了利用松树兜来栽培茯苓菌核对野生松林资源的破坏；同时还可大大缩短发酵周期，利于工业化生产。
采用将所述茯苓发酵用液体发酵培养基与本发明第二方面所述的茯苓发酵用液体种子培养基进行组合，并将其用于本发明第一方面所述茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的液体发酵培养时，可实现茯苓菌丝体产量的最优最大化，使其生物量(干重)达到14.8g/L以上，同时提高菌丝体中茯苓酸的含量，其产量可达到0.384％以上。
第四方面，本发明还提供了一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，其包括对茯苓进行液体发酵的操作。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，采用如本发明第一方面所述的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2进行液体发酵，也可以采用本领域公知的茯苓菌种进行，只是利用第一方面所述的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2进行液体发酵，相比本领域公知的茯苓菌种，可进一步提高茯苓菌丝体和茯苓酸含量。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，在液体种子培养基和/或液体发酵培养基中加入马尾松浸提物，其有助于提高茯苓菌丝体和茯苓酸的含量；以每升培养基计，所述马尾松浸提物的加入量优选为20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g。在该添加量下的液体种子培养基和/或液体发酵培养基，其能够促进茯苓菌丝体的快速生长，从而实现茯苓菌丝体和茯苓酸的质量最优，产量大幅增加。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，在液体种子培养基和/或液体发酵培养基中还可以加入纤维素和复合维生素B，该两种组分的加入可提高培养基中的溶解氧浓度，促进茯苓菌丝体的发酵，并可与上述马尾松浸提物发生协同增效作用，进一步提高茯苓菌丝体和茯苓酸的产量；以每升培养基计，所述纤维素的加入量优选为5-10g，5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述复合维生素B的加入量优选为0.1-0.2g，0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，所述液体种子培养基和液体发酵培养基中的马尾松浸提物与本发明第二方面所述的马尾松浸提物制备方法相同，在此不做赘述。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，所述液体种子培养基和液体发酵培养基中的纤维素和复合维生素B的具体组分及选择与本发明第二方面所述的纤维素和复合维生素B组分的选择相同，在此不做赘述。
根据本发明，在对茯苓进行液体发酵时，可直接采用如本发明第二方面所述的茯苓发酵用液体种子培养基和/或如本发明第三方面所述的茯苓发酵用液体发酵培养基。
本发明所述提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，可以包括以下步骤：
(1)斜面试管菌种活化培养：将茯苓菌株的菌丝块接种于斜面试管培养基，在25-27℃下培养7-15d，得到斜面菌种；
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液：在摇瓶中装入液体种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将步骤(1)得到的斜面菌种接种到液体种子培养基中，在22-28℃、转速100-180r/min下振荡培养4-8天，得到液体摇瓶种子液；
(3)接种到液体发酵培养基：将步骤(2)得到的种子液按7％-15％的接种量接入液体发酵培养基中，接种后于黑暗条件，22-28℃、转速100-180r/min下振荡培养7-10天，得到茯苓菌丝体；
(4)测定茯苓酸含量。
本发明中，对于步骤(3)所述的发酵培养条件，优选采用如下操作：
将步骤(2)得到的种子液按15％的接种量接入液体发酵培养基中，接种后于黑暗条件、25℃、转速180r/min下培养7天。
利用上述优选的培养条件，可进一步增加发酵液中茯苓菌丝生物量(干重)，提高茯苓酸产量。
根据本发明，步骤(4)所述测定茯苓酸含量的方法包括：
1)将茯苓菌丝体干燥后研磨成粉末，向其加入甲醇，所述茯苓菌丝体粉末与甲醇的质量体积比为1:30，密塞后称定重量；
2)经甲醇浸泡1-2h后在40-50℃下超声处理10-30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，上清液即为待测样品溶液；
3)采用反相高效液相色谱法进行茯苓酸的测定。
根据本发明，步骤3)所述反相高效液相色谱法的色谱条件为：Diamonsil C18(2)色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸(80％:20％)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm。本领域技术人员也可以根据实际需要选择其它色谱条件，以能检测茯苓酸含量为准。
第五方面，本发明还提供了如第一方面所述茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2、第二方面所述茯苓发酵用液体种子培养基或第三方面所述茯苓发酵用液体发酵培养基在生产制备茯苓菌丝体或茯苓酸中的用途。
与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)经本发明的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2、培养基或方法得到的发酵液中茯苓菌丝生物量(干重)可达14.8g/L以上，茯苓酸产量达到0.384％以上；发酵周期可缩短至7天；
(2)本发明提供的方法可解决利用松树兜来栽培茯苓菌核对野生松林资源的破坏，而且为将来茯苓药食用价值的综合开发和工厂化生产奠定基础和提供技术保障；
(3)本发明工艺简单、有效、发酵周期短，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的。
附图说明
图1是茯苓酸标准品反相高效液相色谱图；
图2是本发明的茯苓发酵菌丝体反相高效液相色谱图。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明中，所述马尾松浸提物可以采用如下方法进行制备：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在40-45℃下干燥至恒重，粉碎后，过30-40目筛；称取20-30g马尾松根粉末放入容器中，加入2-3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬20-40min，纱布过滤除去沉淀；滤液经6000-8000r/min离心5-15min后，取上清液，得到所述马尾松浸提物。
本发明中，采用如下方法来测定茯苓酸含量：
1)将茯苓菌丝体干燥后研磨成粉末，向其加入甲醇，所述茯苓菌丝体粉末与甲醇的质量体积比为1:30，密塞后称定重量；
2)经甲醇浸泡1h后在50℃下超声处理10min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，上清液即为待测样品溶液；
3)采用反相高效液相色谱法进行茯苓酸的测定，色谱条件为：Diamonsil C18(2)色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸(80％:20％)；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm。
图1示出了茯苓酸标准品的反相高效液相色谱图，保留时间为横坐标，电压强度为纵坐标。
图2示出了本发明的茯苓发酵菌丝体的反相高效液相色谱图，保留时间为横坐标，电压强度为纵坐标。
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：
实施例1
茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的分离与鉴定
以2011年3月从湖南靖州县茯苓种植基地获得茯苓菌核，其菌核经过表面消毒后采用组织分离的方法分离纯化，获得一种茯苓原始菌株，接入PDA斜面培养基制备斜面母种，斜面母种再接种至固体栽培培养基，获得茯苓子实体，将茯苓子实体中的担孢子经过培育获得了一株茯苓酸含量高的菌株，即本发明所使用的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2。
本发明所述茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR扩增和测序，将获得的ITS序列(如SEQ NO.1所示)与Genbank中所登录的茯苓序列比对，与它最近的茯苓(Poria cocos)相似性为99％。
实施例2
一种茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，其组成为：
马铃薯150g，葡萄糖10g，纤维素10g，马尾松根浸提物20g，甘油3g，(NH4)2SO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，KH2PO4 2g，复合维生素B 0.1g，其余为水；并调节pH至6.6。
马尾松浸提物采用如下方法进行制备：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在45℃下干燥至恒重，粉碎后，过30目筛；称取20g马尾松根粉末放入容器中，加入3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬30min，纱布过滤除去沉淀；滤液经8000r/min离心15min后，取上清液，得到所述马尾松浸提物。
所述纤维素采用食品级的微晶纤维素，其粒径为20-80μm，极限聚合度≤350；所述复合维生素B中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B60.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。
实施例3
一种茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，其组成为：
马铃薯180g，葡萄糖8g，纤维素7g，马尾松根浸提物25g，甘油2g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 1.8g，KH2PO4 3g，复合维生素B 0.2g，其余为水；并调节pH至7。
其中马尾松根浸提物的制备方法同实施例2，只需将马尾松根粉末调整为25g；纤维素和复合维生素B的选择同实施例2。
实施例4
一种茯苓发酵用液体种子培养基，以每升计，其组成为：
马铃薯200g，葡萄糖10g，纤维素5g，马尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O 1.5g，KH2PO4 2.5g，复合维生素B 0.14g，其余为水；并调节pH至6.5。
其中马尾松根浸提物的制备方法同实施例2，只需将马尾松根粉末调整为30g；纤维素和复合维生素B的选择同实施例2。
对比例1
与实施例4相比，除不添加马尾松根浸提物外，其它与实施例4相同。
对比例2
与实施例4相比，除不添加纤维素外，其它与实施例4相同。
对比例3
与实施例4相比，除不添加复合维生素B外，其它与实施例4相同。
对比例4
与实施例4相比，除不添加马尾松根浸提物和纤维素外，其它与实施例4相同。
对比例5
与实施例4相比，除不添加纤维素和复合维生素B外，其它与实施例4相同。
实施例5
一种茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，其组成为：
葡萄糖25g，纤维素7g，马尾松根浸提物26g，甘油2g，(NH4)2SO4 2.5g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO4 1.5g，KNO3 2g，复合维生素B 0.16g，其余为水；并调节pH至7。
马尾松浸提物采用如下方法进行制备：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在45℃下干燥至恒重，粉碎后，过30目筛；称取26g马尾松根粉末放入容器中，加入3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬30min，纱布过滤除去沉淀；滤液经8000r/min离心15min后，取上清液，得到所述马尾松浸提物。
所述纤维素采用食品级的微晶纤维素，其粒径为20-80μm，极限聚合度≤350；所述复合维生素B中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B60.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。
实施例6
一种茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，其组成为：
葡萄糖20g，纤维素5g，马尾松根浸提物20g，甘油3g，(NH4)2SO4 3g，MgSO4·7H2O2g，KH2PO4 2g，KNO3 2g，复合维生素B 0.1g，其余为水；并调节pH至6.8。
其中马尾松根浸提物的制备方法同实施例5，只需将马尾松根粉末调整为20g；纤维素和复合维生素B的选择同实施例5。
实施例7
一种茯苓发酵用液体发酵培养基，以每升计，其组成为：
葡萄糖30g，纤维素10g，马尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO4 2g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO4 1g，KNO3 1g，复合维生素B 0.14g，其余为水；并调节pH至6.5。
其中马尾松根浸提物的制备方法同实施例5，只需将马尾松根粉末调整为30g；纤维素和复合维生素B的选择同实施例5。
对比例6
与实施例7相比，除不添加马尾松根浸提物外，其它与实施例7相同。
对比例7
与实施例7相比，除不添加纤维素外，其它与实施例7相同。
对比例8
与实施例7相比，除不添加复合维生素B外，其它与实施例7相同。
对比例9
与实施例7相比，除不添加马尾松根浸提物和纤维素外，其它与实施例7相同。
对比例10
与实施例7相比，除不添加纤维素和复合维生素B外，其它与实施例7相同。
实施例8
一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，其包括以下步骤：
(1)斜面试管菌种活化培养：将实施例1的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的菌丝块接种于斜面试管培养基，在27℃下培养10d，得到斜面菌种；
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液：在摇瓶中装入实施例4的液体种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将步骤(1)得到的斜面菌种接种到液体种子培养基中，在26℃、转速100r/min下振荡培养4天，得到液体摇瓶种子液；
(3)接种到液体发酵培养基：将步骤(2)得到的种子液按15％的接种量接入实施例7的液体发酵培养基中，接种后于黑暗条件，22℃、转速120r/min下振荡培养8天，得到茯苓菌丝体；
(4)测定茯苓酸含量。
实施例9
一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，其包括以下步骤：
(1)斜面试管菌种活化培养：将实施例1的茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2的菌丝块接种于斜面试管培养基，在25℃下培养7d，得到斜面菌种；
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液：在摇瓶中装入实施例4的液体种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将步骤(1)得到的斜面菌种接种到液体种子培养基中，在25℃、转速180r/min下振荡培养7天，得到液体摇瓶种子液；
(3)接种到液体发酵培养基：将步骤(2)得到的种子液按15％的接种量接入实施例7的液体发酵培养基中，接种后于黑暗条件，25℃、转速180r/min下振荡培养7天，得到茯苓菌丝体；
(4)测定茯苓酸含量。
实施例10
与实施例9相比，将茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2替换成保藏编号为CCTCC NO.M2010361的茯苓菌株，其它与实施例9相同。
实施例11
与实施例9相比，将茯苓(Poria cocos)菌株ZJ2替换成保藏编号为CGMCC NO.6660的茯苓菌株，其它与实施例9相同。
实施例12
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成实施例3的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
实施例13
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成实施例2的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
对比例11
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成对比例1的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
对比例12
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成对比例2的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
对比例13
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成对比例3的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
对比例14
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成对比例4的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
对比例15
与实施例9相比，将液体种子培养基替换成对比例5的液体种子培养基，其它与实施例9相同。
实施例14
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成实施例6的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
实施例15
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成实施例5的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例16
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成对比例6的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例17
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成对比例7的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例18
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成对比例8的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例19
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成对比例9的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例20
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换成对比例10的液体发酵培养基，其它与实施例9相同。
对比例21
与实施例9相比，将液体种子培养基替换为CN102199543A中公开的种子培养基，具体为：葡萄糖20g/L、酵母浸膏4g/L、蛋白胨5g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L，初始pH5.5，蒸馏水1L，其它与实施例9相同。
对比例22
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换为CN102199543A中公开的液体发酵基础培养基，具体为：葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，初始pH 5.5，蒸馏水1L，其它与实施例9相同。
对比例23
与实施例9相比，将液体种子培养基替换为CN103627695A中公开的培养基，具体为：马尾松浸液1.0％-4.0％，马铃薯水煮液15％-20％，葡萄糖0.8-1.2％，其它与实施例9相同。
对比例24
与实施例9相比，将液体发酵培养基替换为CN103627695A中公开的液体发酵培养基，具体为：马尾松浸液1.0％-4.0％，微晶纤维0.8％-3.5％，葡萄糖1.0％-3.5％，甘油0.01％-0.05％，硫酸铵0.1％-0.4％，硫酸镁0.1％-0.3％，氢氧化钾0.02％-0.06％，磷酸0.02％-0.05％，pH5.5，其它与实施例9相同。
将实施例8-15和对比例11-24得到的茯苓菌丝体(干重)和茯苓酸进行含量测定，其结果如表1所示。
表1
| 菌丝体/g/L | 茯苓酸/％ | 菌丝体/g/L | 茯苓酸/％ | ||
| 实施例8 | 12.9 | 0.371 | 实施例14 | 12.0 | 0.375 |
| 实施例9 | 14.8 | 0.384 | 实施例15 | 13.7 | 0.366 |
| 实施例10 | 13.9 | 0.360 | 对比例16 | 11.0 | 0.301 |
| 实施例11 | 14.2 | 0.355 | 对比例17 | 4.7 | 0.399 |
| 实施例12 | 12.3 | 0.370 | 对比例18 | 12.2 | 0.390 |
| 实施例13 | 10.9 | 0.351 | 对比例19 | 4.2 | 0.272 |
| 对比例11 | 12.1 | 0.322 | 对比例20 | 4.0 | 0.387 |
| 对比例12 | 7.6 | 0.330 | 对比例21 | 11.0 | 0.311 |
| 对比例13 | 9.2 | 0.347 | 对比例22 | 7.6 | 0.363 |
| 对比例14 | 7.1 | 0.350 | 对比例23 | 7.0 | 0.334 |
| 对比例15 | 6.8 | 0.368 | 对比例24 | 13.1 | 0.387 |
通过表1可以看出，与对比例11-15相比，实施例9中的液体种子培养基通过添加马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B，三者产生了协同增效作用，相比采用马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B中的单一组分或采用任意两种的组合，其均提高了菌丝体干重和茯苓酸含量；与对比例16-20相比，实施例9中的液体发酵培养基通过添加马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B，三者产生了协同增效作用，相比采用马尾松浸提物、纤维素和复合维生素B中的单一组分或采用任意两种的组合，其同样提高了菌丝体干重和茯苓酸含量。
另外，通过表1还可以看出，与对比例11-24分别相比，实施例9中的液体种子培养基与液体发酵培养基二者组合后也产生了协同作用，相比采用单一的液体种子培养基或液体发酵培养基，其能最大程度地提高了茯苓菌丝生物量，增加了茯苓酸含量，并将发酵周期缩短至7天。
综上所述，经本发明方法得到的发酵液中茯苓菌丝生物量(干重)可达14.8g/L以上，茯苓酸产量达到0.384％以上；发酵周期可缩短至7天；可解决利用松树兜来栽培茯苓菌核对野生松林资源的破坏，而且为将来茯苓药食用价值的综合开发和工厂化生产奠定基础和提供技术保障；同时，本发明工艺简单、有效、发酵周期短，在工业化生产中具有应用价值，可成功实现明显提高表达产物产量的目的。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 怀化学院
<120> 一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1613
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggcttatcga gggaggcaga ggacctccgc gaattcaagg agggcaggac tccgctagca 60
gggcggctgc ggccccttgg ccgtcctcgc gtaaggttgg gctaacgtgt ccggtcggag 120
tgggttcaag gcacacgttg taacgacacg cgtgtgatgc cctcacgtaa cccagtcgag 180
ccctgtgtgg atcgcgcgga agatgctgtc cggtgagcga agccaatcgc gacccgggcc 240
ggcctgttcg gaggcaagca gctatccgtt agtgtgaagc cgataacgac ccagtccggc 300
gtgttaagcc gaacacgact cggtcggacc tgtgagtctt gtaaggccct tcggcttgcg 360
tccgcctcta tggccgccgt cgtgggggac gacattctct cttgaactcg gaaaaccgga 420
cgccctccca ttcatggagg agagagggcc gtctaagacc cgcttggctt gacctgttgc 480
accgtctaca gccatcttcc gagtgtgtgc aatgggagag aacgaagccc gcgattgggg 540
aattcgagat gccctcccat ttattggggc gtggggaggt ttgtgtactc ccagaccagc 600
tccgagtcgt gccgccgtct actaccacag acctttgtct gagaccgctg gccgatgccg 660
tcgagcacgt cacaagtcat cctcgaattc acatccgtcc gtctatgacg ggcgcggccc 720
actacggacg tgagagttcg ttaacacggg tcgcgagcgt ccgttaacac gggcgtgagc 780
gtccgttacg gtaccgtctt tctcgataga caaagccctt tggcacccct tcacatacca 840
cacccgtgca cctattgccg cggtgcaagg cccacgttcg gtccttccgc gcgtgtgaag 900
ccctctgccc gcggcgccct tacaaacccc ataatgtcag aacgttgtcc cgatataaca 960
atgaaagagt ttaataacaa ctctcagcga cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga 1020
acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaatcc agtgaatcat cgaacctttg 1080
aacgcacctt gcgcccctcg gtattccgag gagcatgcct gtttgagcgt cgcggaaccc 1140
tcaactccgt ccgcctttgt tggggcgggc tcggagcttg gaattggagg ccctttgccg 1200
cgcctttccc ttctacgatc cgtagaccgg gggtggccgc gcggctcctc ccaaacgcat 1260
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ggggaccgct ccgaaaggaa gagggaaaat aaaagatctc gactccggtt tggcgtccct 1560
cctccctccg ccgtctcgag gcgtcagaaa cccttgacct cagatcaggc agg 1613
Claims (5)
1.一种提高茯苓液体发酵菌丝体中茯苓酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用茯苓(Wolfiporia cocos)菌株ZJ2进行液体发酵；所述茯苓(Wolfiporia cocos)菌株ZJ2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏日期为2016年1月15日，保藏编号为GDMCC No.60007；
在茯苓发酵用液体种子培养基和/或液体发酵培养基中加入马尾松根浸提物；以每升培养基计，所述马尾松根浸提物的加入量为20-30g；
在茯苓发酵用液体种子培养基和/或液体发酵培养基中还加入纤维素和复合维生素B；以每升培养基计，所述纤维素的加入量为5-10g；所述复合维生素B的加入量为0.1-0.2g；
所述马尾松根浸提物采用如下方法制备得到：
将马尾松树根洗净放入干燥箱中，在40-45℃下干燥至恒重，粉碎后，过30-40目筛；称取20-30g马尾松根粉末放入容器中，加入2-3倍体积的蒸馏水，加热煮沸后，小火煎熬20-40min，纱布过滤除去沉淀；滤液经6000-8000r/min离心5-15min后，取上清液，得到所述马尾松根浸提物；
所述复合维生素B是指：每0.1g复合维生素B中含有维生素B1 3mg，维生素B2 1.5mg，维生素B6 0.2mg，烟酰胺10mg和泛酸钙1mg。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用茯苓发酵用液体种子培养基和/或茯苓发酵用液体发酵培养基；
以每升计，所述液体种子培养基的组成为：
马铃薯150-200g，葡萄糖5-10g，纤维素5-10g，马尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO4 2-3g，MgSO4·7H2O 1.5-2g，KH2PO4 2-4g，复合维生素B 0.1-0.2g，其余为水；并调节pH至6.5-7；
以每升计，所述液体发酵培养基的组成为：
葡萄糖20-30g，纤维素5-10g，马尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO42-3g，MgSO4·7H2O 1.5-2g，KH2PO4 1-2g，KNO3 1-2g，复合维生素B 0.1-0.2g，其余为水；并调节pH至6.5-7。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)斜面试管菌种活化培养：将茯苓菌株的菌丝块接种于斜面试管培养基，在25-27℃下培养7-15d，得到斜面菌种；
(2)通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液：在摇瓶中装入液体种子培养基，在高温高压下灭菌，待自然冷却至室温，将步骤(1)得到的斜面菌种接种到液体种子培养基中，在22-28℃、转速100-180r/min下振荡培养4-8天，得到液体摇瓶种子液；
(3)接种到液体发酵培养基：将步骤(2)得到的种子液按7％-15％的接种量接入液体发酵培养基中，接种后于黑暗条件，22-28℃、转速100-180r/min下振荡培养7-10天，得到茯苓菌丝体；
(4)测定茯苓酸含量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述测定茯苓酸含量的方法包括：
1)将茯苓菌丝体干燥后研磨成粉末，向其加入甲醇，所述茯苓菌丝体粉末与甲醇的质量体积比为1:30，密塞后称定重量；
2)经甲醇浸泡1-2h后在40-50℃下超声处理10-30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，上清液即为待测样品溶液；
3)采用反相高效液相色谱法进行茯苓酸的测定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)所述反相高效液相色谱法的色谱条件为：Diamonsil C18(2)色谱柱，其规格为250mm×4.6mm，粒径5μm；流动相：乙腈-0.1％甲酸，体积比为80％:20％；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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