CN111378777A - 用于鉴别生药的引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于开发并提供一种能够准确地鉴定加工处理后的候选生药的待测植物是否为基原植物，并鉴别该候选生药为目标生药的手段，以及使用该手段的鉴别方法。针对各种生药，设计了能够从加工处理后的待测植物中稳定地获取碱基序列信息，并且在基原植物中能够对具有特异性的碱基序列的基原植物的基因组DNA或叶绿体DNA中的特定区域进行扩增的引物组。本发明提供了该引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够确认各种生药样品为日本药局方或日本药局方以外的生药标准(以下称为“局外生规”)所规定的基原植物的核酸扩增反应引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法。
背景技术
关于生药，在第十七修订版的日本药局方或局外生规2015中，规定了基原植物。基原植物是指作为某种生药的原料的植物(原植物)，按照每种生药都以种为单位进行了规定。例如，生药“地黄”的基原植物是赤野地黄Rehmannia glutinosa Liboschitzvar.purpurea Makino或地黄Rehmannia glutinosa Liboschitz(玄参科)，除此以外的植物种，即使是同属近缘种，原则上也不会认定为“地黄”。但是，生药一般是在对基原植物进行了加热、干燥等各种加工处理的状态下流通的。因此，人们往往无法从外观上对以外观与基原植物近似的植物种(近似种)为原料的伪品生药和以基原植物为原料的生药进行区分。很多伪品生药，其生药本来的药效往往无法保障，另外价格也很便宜。所以，准确地确认流通的生药是否是以本来的基原植物为原料是一项重要工作。通常通过提取候选生药的植物中所含有的核酸，确定种特异性的区域的碱基序列，可以鉴定出作为检测对象的待测植物是否为对象生药的基原植物(非专利文献1)。但如前所述，很多生药经过了加工处理，此外长期保存会使它们受到经时变化，因此往往会出现样品中的DNA受损和/或片段化的情况以及来源于霉菌、真菌等菌类的DNA混入的情况。所以，对从生药采集的核酸进行碱基序列确定本身十分困难，到目前为止还无法准确地鉴定原植物。
因此，需要一种通过从经过了加热等加工处理的候选生药的待测植物中稳定且准确地获取碱基序列信息，来准确地鉴定出该待测植物是否为基原植物，确认其为未混入或未替换为异种植物的真正生药的技术。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：丸山卓郎等，2013年，特产种苗，16:70-76
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于开发并提供一种能够准确地确认加工处理后的候选生药的待测植物是否为目标生药的基原植物，并鉴别该候选生药为目标生药的手段，以及使用该手段的鉴别方法。
解决问题的技术方案
本发明人对各种生药的基原植物中的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面地研究，结果发现：各生药的基原植物中，特异性的碱基序列存在于特定区域；另外，该区域也能够稳定地从加工处理后的待测植物中获取碱基序列信息。根据这些发现，本发明人成功地开发出了能够对所述特定区域进行扩增的引物组，以及能够使用该引物组准确地鉴定出候选生药的待测植物是否为基原植物，并且鉴别出候选生药为目标生药的方法。本说明书提供了基于作为该鉴别手段的引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法的以下发明。
(1)一种用于鉴别生药的引物组，其中，所述生药选自于由以下生药组成的组：茯苓、地黄、延胡索、葛根、防风、远志、薄荷、麻黄、大枣/酸枣仁、栝楼根/栝楼仁、吴茱萸、前胡、知母、麦冬、白芷、威灵仙、茵陈蒿、地骨皮、砂仁、忍冬藤、川骨、桑白皮、羌活、枇杷叶、硬紫草、杜仲，
所述引物组是由以下所示碱基序列组成的多核苷酸：茯苓时，为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；地黄时，为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；延胡索时，为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；葛根时，为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；防风时，为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52；远志时，为SEQID NO:65和SEQ ID NO:66；薄荷时，为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74；麻黄时，为SEQ IDNO:85和SEQ ID NO:86，或者SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386；大枣/酸枣仁时，为SEQ IDNO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104；栝楼根/栝楼仁时，为SEQID NO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128；吴茱萸时，为SEQ IDNO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；前胡时，为SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402；知母时，为SEQ ID NO:186和SEQID NO:187；麦冬时，为SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200；白芷时，为SEQ ID NO:213和SEQID NO:214，或者SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417；威灵仙时，为SEQ ID NO:227和SEQ IDNO:228；茵陈蒿时，为SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244；地骨皮时，为SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262；砂仁时，为SEQ ID NO:275和SEQ IDNO:276；忍冬藤时，为SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285；川骨时，为SEQ ID NO:298和SEQ IDNO:299；桑白皮时，为SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313；羌活时，为SEQ ID NO:324和SEQ IDNO:325；枇杷叶时，为SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335；硬紫草时，为SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361；以及杜仲时，为SEQ ID NO:374和SEQID NO:375。
(2)一种生药鉴别套装，其包含选自于由(1)所述的用于鉴别生药的引物组组成的组中一个以上的引物组。
(3)根据(2)所述的生药鉴别套装，其包含记载有扩增产物碱基序列信息的碱基序列表，所述扩增产物通过以从生药的基原植物中制备的核酸为模板并使用用于鉴别该生药的引物进行核酸扩增反应而得到。
(4)一种茯苓的鉴别方法，包括以下步骤：从候选茯苓的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:1所示的碱基序列和与SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:5所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:3所示的碱基序列和与SEQID NO:4所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:11所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茯苓的基原植物，所述候选茯苓被鉴别为茯苓。
(5)一种地黄的鉴别方法，包括以下步骤：从候选地黄的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:17所示的碱基序列和与SEQ ID NO:18所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地黄的基原植物，所述候选地黄被鉴别为地黄。
(6)一种延胡索的鉴别方法，包括以下步骤：从候选延胡索的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQID NO:26所示的碱基序列和与SEQ ID NO:27所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:28所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为延胡索的基原植物，所述候选延胡索被鉴别为延胡索。
(7)一种葛根的鉴别方法，包括以下步骤：从候选葛根的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:40所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:37所示的碱基序列和与SEQ ID NO:38所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:41所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:39所示的碱基序列和与SEQ ID NO:40所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQID NO:46所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为葛根的基原植物，所述候选葛根被鉴别为葛根。
(8)一种防风的鉴别方法，包括以下步骤：从候选防风的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:51所示的碱基序列和与SEQ ID NO:52所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:53所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为防风的基原植物，所述候选防风被鉴别为防风。
(9)一种远志的鉴别方法，包括以下步骤：从候选远志的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQID NO:65所示的碱基序列和与SEQ ID NO:66所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:67所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为远志的基原植物，所述候选远志被鉴别为远志。
(10)一种薄荷的鉴别方法，包括以下步骤：从候选薄荷的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:73所示的碱基序列和与SEQ ID NO:74所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:75所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为薄荷的基原植物，所述候选薄荷被鉴别为薄荷。
(11)一种麻黄的鉴别方法，包括以下步骤：从候选麻黄的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86，或者由SEQ ID NO:385和SEQ IDNO:386所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rbcL区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:85所示的碱基序列和与SEQ ID NO:86所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:87～SEQ ID NO:89中任一个所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:385所示的碱基序列和与SEQ ID NO:386所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:387～SEQ ID NO:389中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麻黄的基原植物，所述候选麻黄被鉴别为麻黄。
(12)一种大枣/酸枣仁的鉴别方法，包括以下步骤：从候选大枣/酸枣仁的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ IDNO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:101所示的碱基序列和与SEQ ID NO:102所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:105所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:103所示的碱基序列和与SEQ ID NO:104所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:115所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为大枣/酸枣仁的基原植物，所述候选大枣/酸枣仁被鉴别为大枣/酸枣仁。
(13)一种栝楼根/栝楼仁的鉴别方法，包括以下步骤：从候选栝楼根/栝楼仁的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rpl16内含子区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:125所示的碱基序列和与SEQ IDNO:126所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:129～SEQ IDNO:131中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:127所示的碱基序列和与SEQ IDNO:128所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:135～SEQ IDNO:137中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为栝楼根/栝楼仁的基原植物，所述候选栝楼根/栝楼仁被鉴别为栝楼根/栝楼仁。
(14)一种吴茱萸的鉴别方法，包括以下步骤：从候选吴茱萸的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:141所示的碱基序列和与SEQ ID NO:142所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:147中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:143所示的碱基序列和与SEQ ID NO:144所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:158～SEQ ID NO:160中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为吴茱萸的基原植物，所述候选吴茱萸被鉴别为吴茱萸。
(15)一种前胡的鉴别方法，包括以下步骤：从候选前胡的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者由SEQ ID NO:401和SEQID NO:402所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:171所示的碱基序列和与SEQ ID NO:172所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:401所示的碱基序列和与SEQ ID NO:402所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:404所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为前胡的基原植物，所述候选前胡被鉴别为前胡。
(16)一种知母的鉴别方法，包括以下步骤：从候选知母的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:186所示的碱基序列和与SEQ ID NO:187所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:188所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为知母的基原植物，所述候选知母被鉴别为知母。
(17)一种麦冬的鉴别方法，包括以下步骤：从候选麦冬的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:199所示的碱基序列和与SEQ ID NO:200所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:201所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麦冬的基原植物，所述候选麦冬被鉴别为麦冬。
(18)一种白芷的鉴别方法，包括以下步骤：从候选白芷的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214，或者由SEQ ID NO:416和SEQID NO:417所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:213所示的碱基序列和与SEQ ID NO:214所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:215所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ IDNO:416所示的碱基序列和与SEQ ID NO:417所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:418所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为白芷的基原植物，所述候选白芷被鉴别为白芷。
(19)一种威灵仙的鉴别方法，包括以下步骤：从候选威灵仙的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:227所示的碱基序列和与SEQ ID NO:228所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:229～SEQ ID NO:231中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为威灵仙的基原植物，所述候选威灵仙被鉴别为威灵仙。
(20)一种茵陈蒿的鉴别方法，包括以下步骤：从候选茵陈蒿的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的petD-rpoA区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:241所示的碱基序列和与SEQ ID NO:242所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:245所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:243所示的碱基序列和与SEQ ID NO:244所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:253所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茵陈蒿的基原植物，所述候选茵陈蒿被鉴别为茵陈蒿。
(21)一种地骨皮的鉴别方法，包括以下步骤：从候选地骨皮的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的trnH-psbA区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:261所示的碱基序列和与SEQ ID NO:262所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:263或SEQ ID NO:264所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地骨皮的基原植物，所述候选地骨皮被鉴别为地骨皮。
(22)一种砂仁的鉴别方法，包括以下步骤：从候选砂仁的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:276所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:275所示的碱基序列和与SEQ ID NO:276所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:277所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为砂仁的基原植物，所述候选砂仁被鉴别为砂仁。
(23)一种忍冬藤的鉴别方法，包括以下步骤：从候选忍冬藤的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:284所示的碱基序列和与SEQ ID NO:285所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:286所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为忍冬藤的基原植物，所述候选忍冬藤被鉴别为忍冬藤。
(24)一种川骨的鉴别方法，包括以下步骤：从候选川骨的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:298所示的碱基序列和与SEQ ID NO:299所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:300所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为川骨的基原植物，所述候选川骨被鉴别为川骨。
(25)一种桑白皮的鉴别方法，包括以下步骤：从候选桑白皮的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:312所示的碱基序列和与SEQ ID NO:313所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:314所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为桑白皮的基原植物，所述候选桑白皮被鉴别为桑白皮。
(26)一种羌活的鉴别方法，包括以下步骤：从候选羌活的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ IDNO:324所示的碱基序列和与SEQ ID NO:325所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:326或SEQ ID NO:327所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为羌活的基原植物，所述候选羌活被鉴别为羌活。
(27)27.一种枇杷叶的鉴别方法，包括以下步骤：从候选枇杷叶的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:332所示的碱基序列和与SEQ ID NO:333所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:336所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQID NO:334所示的碱基序列和与SEQ ID NO:335所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:348所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为枇杷叶的基原植物，所述候选枇杷叶被鉴别为枇杷叶。
(28)一种硬紫草的鉴别方法，包括以下步骤：从候选硬紫草的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:360所示的碱基序列和与SEQ ID NO:361所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:362所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为硬紫草的基原植物，所述候选硬紫草被鉴别为硬紫草。
(29)一种杜仲的鉴别方法，包括以下步骤：从候选杜仲的待测植物中提取核酸；以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；确定扩增产物的碱基序列；以及将扩增产物中在SEQ ID NO:374所示的碱基序列和与SEQ ID NO:375所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:376所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为杜仲的基原植物，所述候选杜仲被鉴别为杜仲。
发明效果
通过使用本发明的用于鉴别生药的引物组进行本发明的生药鉴别方法，即使是经过了生药加工处理的植物，也能够准确地鉴定出该植物是否为日本药局方/局外生规所认可的生药的基原植物，由此能够切实地防止异种植物的混入等。
根据本发明的用于鉴别生药的套装，能够容易地实施本发明的生药鉴别方法，可以简便地鉴别各种生药。
附图说明
图1是将标准的茯苓的序列与其他品系茯苓的同源序列进行比对的图；
图2是将标准的茯苓的序列与其他品系茯苓的同源序列进行比对的图；
图3是将标准的地黄的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图4-1是将标准的延胡索的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图4-2是图4-1的续图；
图5是将标准的葛根的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图6是将标准的葛根的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图7-1是将标准的防风的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图7-2是图7-1的续图；
图8-1是将标准的远志的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图8-2是图8-1的续图；
图9-1是将标准的薄荷的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图9-2是图9-1的续图；
图10-1是将标准的麻黄的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图10-2是图10-1的续图；
图10-3是图10-2的续图；
图11-1是将标准的大枣和酸枣仁的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图11-2是图11-1的续图；
图12-1是将标准的大枣和酸枣仁的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图12-2是图12-1的续图；
图13是将标准的栝楼根和栝楼仁的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图14-1是将标准的栝楼根和栝楼仁的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图14-2是图14-1的续图；
图15-1是将标准的吴茱萸的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图15-2是图15-1的续图；
图15-3是图15-2的续图；
图16-1是将标准的吴茱萸的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图16-2是图16-1的续图；
图17-1是将标准的前胡的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图17-2是图17-1的续图；
图17-3是图17-2的续图；
图18-1是将标准的知母的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图18-2是图18-1的续图；
图19-1是将标准的麦冬的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图19-2是图19-1的续图；
图20-1是将标准的白芷的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图20-2是图20-1的续图；
图21-1是将标准的威灵仙的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图21-2是图21-1的续图；
图22-1是将标准的茵陈蒿的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图22-2是图22-1的续图；
图22-3是图22-2的续图；
图23-1是将标准的茵陈蒿的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图23-2是图23-1的续图；
图24-1是将标准的地骨皮的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图24-2是图24-1的续图；
图25-1是将标准的砂仁的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图25-2是图25-1的续图；
图26-1是将标准的忍冬藤的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图26-2是图26-1的续图；
图27-1是将标准的川骨的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图27-2是图27-1的续图；
图28-1是将标准的桑白皮的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图28-2是图28-1的续图；
图29是将标准的羌活的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图30-1是将标准的枇杷叶的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图30-2是图30-1的续图；
图30-3是图30-2的续图；
图31是将标准的枇杷叶的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图32-1是将标准的硬紫草的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图32-2是图32-1的续图；
图33-1是将标准的杜仲的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图33-2是图33-1的续图；
图34-1是将标准的麻黄的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图34-2是图34-1的续图；
图35-1是将标准的前胡的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图35-2是图35-1的续图；
图35-3是图35-2的续图；
图36是将标准的白芷的序列与其他近缘种的同源序列进行比对的图；
图37-1是表示使用用于鉴别生药的引物组只扩增生药和近缘植物来源的生药，而不扩增远缘植物来源的生药的电泳照片；
图37-2是图37-1的续图；
图37-3是图37-2的续图；
图37-4是图37-3的续图；
图37-5是图37-4的续图；
图37-6是图37-5的续图。
具体实施方式
1.用于鉴别生药的引物组
1-1.概要
本发明的第一实施方式为用于鉴别生药的引物组。本实施方式的引物组由核酸组成，在后述的第三实施方式所述生药鉴别方法中作为用于鉴定待测植物是否为目标生药的基原植物的手段而被使用。
1-2.定义
下面对本说明书中常用的术语进行定义。
本说明书中，“生药”是指可以作为汉方药原料，具有药理效果的来源于天然产物的物质，包括动物、植物或全部或部分菌类以及矿物。本说明书中，尤其符合第十七修订版日本药局方(2016年3月7日厚生劳动省告示第64号)、日本药局方外生药标准2015(2015年12月25日药生审查初1225第1号厚生劳动省医药·生活卫生局审查管理课长通知)所规定的来源于植物和菌类的以下生药。具体而言，为茯苓、地黄、延胡索、葛根、防风、远志、薄荷、麻黄、大枣、酸枣仁、栝楼根、栝楼仁、吴茱萸、前胡、知母、麦冬、白芷、威灵仙、茵陈蒿、地骨皮、砂仁、忍冬藤、川骨、桑白皮、羌活、枇杷叶、硬紫草和杜仲。
需要说明的是，虽然在分类学上菌类并不属于植物，但在本说明书中为了方便起见，将菌类包含在植物中。因此，只要没有特别说明，在本说明书中记载为“植物”时，是指“植物和/或菌类”。例如，在本说明书中记载为“基原植物”时，是指“基原植物和/或基原菌类”。
生药的“基原”是指表示作为生药原料的植物、动物、或矿物及其使用部位和加工方法的术语。例如，包括作为某种生药原料的植物的种类、用于该生药的植物的部位以及制成生药时的加工方法。其中，将作为生药原料的植物、即生药的原植物称为“基原植物”。“原植物”是指作为原料的植物。基原植物原则上按每种生药而定。例如，关于上述生药，茯苓的基原植物为茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)；地黄的基原植物为赤野地黄Rehmannia glutinosa Liboschitz var.purpurea Makino或地黄Rehmanniaglutinosa Liboschitz(玄参科)；延胡索的基原植物为延胡索Corydalisturtschaninovii Besser forma yanhusuo Y.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)；葛根的基原植物为野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)；防风的基原植物为防风Saposhnikoviadivaricata Schischkin(伞形科)；远志的基原植物为远志Polygala tenuifoliaWilldenow(远志科)；薄荷的基原植物为薄荷Mentha arvensis Linne var.piperascensMalinvaud(唇形科)；麻黄的基原植物为草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedraintermedia Schrenk et C.A.Meyer或木贼麻黄Ephedra equisetina Bunge(麻黄科)；大枣的基原植物为枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)；酸枣仁的基原植物为酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)；栝楼根/栝楼仁的基原植物为栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz、日本栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz var.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteata Voigt(葫芦科)；吴茱萸的基原植物为吴茱萸Euodiaruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodiaofficinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)；前胡的基原植物为白花前胡Peucedanumpraeruptorum Dunn或紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanumdecursivum Maximowicz)(伞形科)；知母的基原植物为知母Anemarrhena asphodeloidesBunge(百合科)；麦冬的基原植物为麦冬Ophiopogon japonicus Ker-Gawler(百合科)；白芷的基原植物为白芷Angelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet etSavatier(伞形科)；威灵仙的基原植物为威灵仙Clematis chinensis Osbeck、东北铁线莲Clematis mandshurica Ruprecht或棉团铁线莲Clematis hexapetala Pallas(毛茛科)；茵陈蒿的基原植物为茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)；地骨皮的基原植物为枸杞Lycium chinense Miller或宁夏枸杞Lycium barbarum Linne(茄科)；砂仁的基原植物为绿壳砂Amomum xanthioides Wallich(姜科)；忍冬藤的基原植物为忍冬Lonicerajaponica Thunberg(忍冬科)；川骨的基原植物为日本萍蓬草Nuphar japonicum DeCandolle(睡莲科)；桑白皮的基原植物为桑Morus alba Linne(桑科)；羌活的基原植物为羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium forbesiiBoissieu(伞形科)；枇杷叶的基原植物为枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)；硬紫草的基原植物为紫草Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科)；杜仲的基原植物为杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科)。各生药的基原植物有时只包含一种，有时包含数个同属近缘种，只要是其中任一种即可。
根据其形态，生药分为全形生药、切断生药或粉末生药。“全形生药”是指对作为其药用的植物体或其一部分进行干燥和/或简单加工而成的生药。这里所说的“简单加工”列举有：切断、(高压)蒸汽处理、加热、溶液中浸泡等。“切断生药”是指将全形生药切成小片或小块或进行破碎而成的生药，或者是粗切、中切或细切而成的生药。“粉末生药”是指将全形或切断生药制成粗粉末、中粉末或微粉末而成的生药。本说明书中的生药可以是其中任一形态。优选为全形生药或切断生药。
如前述的基原定义中所述，当生药是由植物的一部分组成时，生药的基原植物的哪一部分作为其药用的部分按每种生药而定。各生药作为药用的部分，在本领域中为公知事项，例如，记载于第十七修订版日本药局方(前文所述)中。
本说明书中，“伪品生药”是指在特定的生药中，将基原植物以外的植物种(例如同属近缘种)等作为原料，使用与该特定的生药相同的部位进行相同的加工处理而得到的产物。在很多情况下，伪品生药由于外观等与生药相似，故难以与生药区别开。但是，如前所述，各生药中以基原植物以外的植物种为原料的产物，其植物种即使是基原植物的近缘种，此外即使具有与生药相同的药理作用，原则上也不能认作是该生药。
本说明书中，“鉴别”是指通过对候选生药的待测植物是否为目标生药的基原植物进行鉴定，来辨别该候选生药是正品生药还是伪品生药，或辨别生药中是否混入有来源于异种植物的伪品生药。
本说明书中，“候选生药”是指生药的外观及加工状态虽与特定的生药相似，但其原植物是否为基原植物尚不清楚。候选生药可以包括正品生药、伪品生药或其混合物。例如，市场上流通的生药中，不能保证来源于其基原植物的生药，就属于本发明的候选生药。
本说明书中，“待测植物”是指候选生药的原植物，即用于后述的第三实施方式所述生药鉴别方法中的待测植物。本说明书中，组成候选生药的植物组织，可以作为第三实施方式所述生药鉴别方法的检测对象。例如列举有：叶、茎、芽、叶鞘、叶柄、球芽、地下茎(包括球茎、鳞茎/球根、根茎、块茎等)、根(包括块根、气根等)、种子、胚轴、果实等。
本说明书中，“核酸(分子)”是指原则上以核苷酸为组成单位，通过磷酸二酯键将这些核苷酸连接而成的生物高分子。通常是由DNA、RNA等天然核酸组成。DNA时，除了基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA等能在细胞内存在的所有DNA分子外，还包含从mRNA通过反转录反应制备的cDNA。另外，RNA时，包含mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、tmRNA、miRNA等能在细胞内存在的所有RNA分子。此外，也可以像本实施方式的用于鉴别生药的引物那样，在人工合成的核酸分子的情况下，除了天然核酸以外，还可以包含化学修饰核酸及假核酸(擬似核酸)。化学修饰核酸及假核酸，例如列举有：肽核酸(PNA：Peptide Nucleic Acid)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、交联化核酸(BNA/LNA：桥核酸(Bridged Nucleic Acid)/锁核酸(Locked Nucleic Acid))、吗啉基核酸等。列举有：甲基膦酸酯(methyl phosphonate)型DNA/RNA、磷硫酰(phosphorothioate)型DNA/RNA、亚磷酰胺(phosphoramidite)型DNA/RNA、2'-O-甲基型DNA/RNA等。
1-3.组成
本说明书中，“用于鉴别生药的引物”(本说明书中常简称为“引物”，因此，只要没有特别说明，本说明书中的引物是指用于鉴别生药的引物)是指在后述的生药鉴别方法中使用的用于核酸扩增的引物，由19个碱基～25个碱基组成的核酸分子(寡核苷酸)组成。优选为由天然核酸(DNA和/或RNA)组成。在稳定性高、合成容易且低廉方面，特别优选为由DNA组成的引物。根据需要，组成引物的碱基序列的全部或部分中也可以包含化学修饰核酸及假核酸。另外，引物也可以用标记物质和/或修饰物质来修饰。标记物质没有特别限制。例如，可以利用荧光物质和/或猝灭物质或放射性同位素(例如32P、33P、35S)等。作为荧光物质的具体示例，列举有：FITC、DIG、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、荧光胺及其衍生物，以及罗丹明及其衍生物等。另外，作为猝灭物质的具体示例，列举有：TAMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3等。修饰物质也没有特别限制。例如，列举有生物素和抗生物素蛋白、链霉亲和素或中性亲和素或磁珠等的标记物质及修饰物质，这些可以使用各大生产商销售的市售品。
引物碱基序列上的标记物质及修饰物质的修饰位置没有特别限制。使用的标记物质及修饰物质的特性，根据目的适当决定即可。标记物质一般多在5’或3’末端部进行修饰，当然并不限于此。另外，一个引物也可以用一种以上的标记物质及修饰物质来修饰。标记物质及修饰物质对引物的修饰方法使用公知方法进行即可。
本说明书中，“用于鉴别生药的引物组”是指一组由正向引物及反向引物组成的用于鉴别生药的引物。本实施方式的用于鉴别生药的引物组如表1所示，针对各生药设计有一组以上。
[表1]
具体而言，关于正向引物和反向引物，茯苓为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；地黄为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；延胡索为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；葛根为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQ IDNO:40；防风为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52；远志为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；薄荷为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74；麻黄为SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86，或者SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386；大枣/酸枣仁为SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104；栝楼根/栝楼仁为SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128；吴茱萸为SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；前胡为SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者SEQ ID NO:401和SEQ IDNO:402；知母为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187；麦冬为SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200；白芷为SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214，或者SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417；威灵仙为SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228；茵陈蒿为SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ IDNO:243和SEQ ID NO:244；地骨皮为SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262；砂仁为SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:276；忍冬藤为SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285；川骨为SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299；桑白皮为SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313；羌活为SEQ ID NO:324和SEQID NO:325；枇杷叶为SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335；硬紫草为SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361；以及杜仲为SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375。
本实施方式的用于鉴别生药的引物组能够通过核酸扩增法对待测植物中特定核酸区域进行扩增。本说明书中，“特定核酸区域”是指在各生药中的基原植物的核酸分子中具有特异性的碱基序列的区域。选为特定核酸区域的区域，必须是组成基原植物的原植物种与不包含在基原植物中的近缘种之间碱基序列不同的区域。但是，一般在近缘种、尤其是同属近缘种内，基因的碱基序列中的一致性往往较高，基原植物中特异性的特定核酸区域受到限制。另一方面，当基原植物特异性高，与近缘种之间碱基序列的差异过大时，引物只能与基原植物杂交，难以进行引物设计。因此，特定核酸区域必须是在基原植物与近缘种间保守的区域，且在二者的碱基序列上具有一定程度差异的区域。这种特定核酸区域，按各生药而定。具体而言，如果是茯苓、地黄、延胡索、葛根、防风、薄荷、大枣/酸枣仁、吴茱萸、前胡、知母、麦冬、白芷、威灵仙、砂仁、川骨、桑白皮、羌活、枇杷叶和硬紫草，则相当于核基因组中的核糖体DNA的ITS区域；远志、忍冬藤和杜仲属于叶绿体DNA的psbA-trnH区域；如果是麻黄，则相当于叶绿体DNA的rbcL区域；如果是栝楼根/栝楼仁，则相当于叶绿体DNA的rpl16内含子区域；如果是茵陈蒿，则相当于叶绿体DNA的petD-rpoA区域；如果是地骨皮，则相当于叶绿体DNA的trnH-psbA区域。
“核糖体(ribosome)DNA”(本说明书中常记作“rDNA”)是指编码参与蛋白质合成的核糖体RNA(本说明书中常记作“rRNA”)的基因。真核生物的rRNA，不限其种类，已知有18SrRNA、5.8S rRNA以及28S rRNA这三种，分别对其进行编码的18S rDNA、5.8S rDNA、28SrDNA在基因组上连续存在，重复有从数百到数万份拷贝的重复序列。“ITS(IntenalTranscribed Spacer，内转录间隔区)”是指存在于18S rDNA与5.8S rDNA之间以及存在于5.8S rDNA与28S rDNA之间的序列，分别称为ITS1及ITS2。rDNA的碱基序列一般广泛地在从酵母到高等植物及哺乳动物的种间保守，但由于ITS1及ITS2会在加工过程中被除去，因此会观察到高度的变异积累。本说明书中，将上述两个ITS和存在于其间的5.8s rDNA一并称为“ITS区域”。
“psbA”是指编码作为光系统II反应中心D1蛋白的基因，存在于植物和藻类的叶绿体基因组和蓝细菌基因组中。植物的psbA基因在叶绿体基因组中存在1个拷贝，在其上游与trnH基因相邻。另外，“trnH”是指编码运送氨基酸的一种即组氨酸的转运RNA(TransferRNA)的基因。近年来，关于使用DNA序列鉴定生物物种，正在推进DNA条形码项目，在植物鉴定方面则提出了叶绿体DNA的trnH-psbA基因间区域作为候选之一。在本说明书中，“psbA-trnH区域”和“trnH-psbA区域”是指该trnH-psbA基因间区域。
“rbcL”是指组成核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rbc：ribulose1,5-bisphosphate carboxylase)的L亚基(Large subunit，大亚基)。rbc存在于具有还原性磷酸戊糖途径的所有原核及真核光合生物以及化能合成细菌中，在种间高度保守。“rbcL区域”是指存在于叶绿体DNA中，编码rbcL的rbcL基因的部分区域。
“rpl16”是指编码组成核糖体蛋白质的大亚基(Large subunit)的蛋白质之一的RPL16的基因，存在于叶绿体DNA中。“rpl16内含子区域”是指rpl16基因的内含子部分区域。核糖体蛋白质基因的碱基序列一般在生物种间高度保守，但由于内含子区域会在剪接过程中被除去，因此会观察到高度的变异积累。
“petD”是指编码光合电子传递系统蛋白质的基因，来自photosyntheticelectron transport(光合电子传递)。pet基因包括编码细胞色素b6f复合体的亚基的基因，以及编码可动性电子传递成分即光系统I的作为电子供体发挥功能的质体蓝素和细胞色素c553、光系统I的电子受体即铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的基因。petD基因是编码亚基IV的基因。另外，“rpoA”是指组成细菌RNA聚合酶和编码质体RNA聚合酶(PEP)的*核心酶的亚基(α2ββ’ω和α2ββ’β”)的基因。细菌中的α、β、β’和ω基因分别称为rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ(rpo：RNA聚合酶)。在高等植物中，α、β、β’和β”基因均被色素体基因组编码，分别记作rpoA、rpoB、rpoC1和rpoC2。在本说明书中，“petD-rpoA区域”是指petD-rpoA基因间区域。
使用用于鉴别各生药的引物组进行扩增的特定核酸区域的碱基序列，其将在以生药的基原植物的核酸分子(基因组DNA或叶绿体DNA)为模板时的碱基序列作为该生药的“生药标准序列”。每组引物的生药标准序列数因每种生药而异。这是因为各生药中基原植物的原植物数及特定核酸区域数不同。用于鉴别各生药的引物组所对应的标准序列的SEQ IDNO示于表2。需要说明的是，在本说明书中，各标准序列是在生药基原植物的特定核酸区域的碱基序列中，在用于鉴别生药的引物组的正向引物的碱基序列和与反向引物的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列。换言之，各标准序列不包含用于鉴别生药的引物组的正向引物的碱基序列和与反向引物的碱基序列互补的碱基序列。
[表2]
具体而言，使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的用于鉴别茯苓的引物组时茯苓标准序列为SEQ ID NO:5所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示碱基序列组成的用于鉴别茯苓的引物组时茯苓标准序列为SEQ ID NO:11所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示碱基序列组成的用于鉴别地黄的引物组时地黄标准序列为SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示碱基序列组成的用于鉴别延胡索的引物组时延胡索标准序列为SEQID NO:28所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示碱基序列组成的用于鉴别葛根的引物组时葛根标准序列为SEQ ID NO:41所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示碱基序列组成的用于鉴别葛根的引物组时葛根标准序列为SEQ IDNO:46所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示碱基序列组成的用于鉴别防风的引物组时防风标准序列为SEQ ID NO:53所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示碱基序列组成的用于鉴别远志的引物组时远志标准序列为SEQ ID NO:67所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示碱基序列组成的用于鉴别薄荷的引物组时薄荷标准序列为SEQ ID NO:75所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:85和SEQID NO:86所示碱基序列组成的用于鉴别麻黄的引物组时麻黄标准序列为SEQ ID NO:87～SEQ ID NO:89中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的用于鉴别麻黄的引物组时麻黄标准序列为SEQ ID NO:387～SEQ ID NO:389中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示碱基序列组成的用于鉴别大枣/酸枣仁的引物组时大枣/酸枣仁标准序列为SEQ ID NO:105所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的用于鉴别大枣/酸枣仁的引物组时大枣/酸枣仁标准序列为SEQ ID NO:115所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:125和SEQID NO:126所示碱基序列组成的用于鉴别栝楼根/栝楼仁的引物组时栝楼根/栝楼仁标准序列为SEQ ID NO:129～SEQ ID NO:131中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的用于鉴别栝楼根/栝楼仁的引物组时栝楼根/栝楼仁标准序列为SEQ ID NO:135～SEQ ID NO:137中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142所示碱基序列组成的用于鉴别吴茱萸的引物组时吴茱萸标准序列为SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:147中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:143和SEQID NO:144所示碱基序列组成的用于鉴别吴茱萸的引物组时吴茱萸标准序列为SEQ ID NO:158～SEQ ID NO:160中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172所示碱基序列组成的用于鉴别前胡的引物组时前胡标准序列为SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的用于鉴别前胡的引物组时前胡标准序列为SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:404所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示碱基序列组成的用于鉴别知母的引物组时知母标准序列为SEQ ID NO:188所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200所示碱基序列组成的用于鉴别麦冬的引物组时麦冬标准序列为SEQ ID NO:201所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示碱基序列组成的用于鉴别白芷的引物组时白芷标准序列为SEQ ID NO:215所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的用于鉴别白芷的引物组时白芷标准序列为SEQ ID NO:418所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228所示碱基序列组成的用于鉴别威灵仙的引物组时威灵仙标准序列为SEQ ID NO:229～SEQ ID NO:231中任一个所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242所示碱基序列组成的用于鉴别茵陈蒿的引物组时茵陈蒿标准序列为SEQ ID NO:245所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的用于鉴别茵陈蒿的引物组时茵陈蒿标准序列为SEQ ID NO:253所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262所示碱基序列组成的用于鉴别地骨皮的引物组时地骨皮标准序列为SEQ ID NO:263或SEQ ID NO:264所示的碱基序列；使用由SEQ IDNO:275和SEQ ID NO:276所示碱基序列组成的用于鉴别砂仁的引物组时砂仁标准序列为SEQ ID NO:277所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285所示碱基序列组成的用于鉴别忍冬藤的引物组时忍冬藤标准序列为SEQ ID NO:286所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299所示碱基序列组成的用于鉴别川骨的引物组时川骨标准序列为SEQ ID NO:300所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313所示碱基序列组成的用于鉴别桑白皮的引物组时桑白皮标准序列为SEQ ID NO:314所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325所示碱基序列组成的用于鉴别羌活的引物组时羌活标准序列为SEQ ID NO:326或SEQ ID NO:327所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333所示碱基序列组成的用于鉴别枇杷叶的引物组时枇杷叶标准序列为SEQID NO:336所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的用于鉴别枇杷叶的引物组时枇杷叶标准序列为SEQ ID NO:348所示的碱基序列；使用由SEQID NO:360和SEQ ID NO:361所示碱基序列组成的用于鉴别硬紫草的引物组时硬紫草标准序列为SEQ ID NO:362所示的碱基序列；使用由SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375所示碱基序列组成的用于鉴别杜仲的引物组时杜仲标准序列为SEQ ID NO:376所示的碱基序列。
根据需要，用于各生药鉴定的引物在5’末端侧可以带有标签序列、条形码序列、接头序列等。
引物优选利用化学合成法进行合成。根据用于上述生药鉴定的引物组中的正向引物和反向引物的碱基序列信息来合成即可。合成也可以利用核酸合成受托服务。
2.生药鉴别套装
2-1.概要
本发明的第三实施方式为生药鉴别套装。本实施方式的生药鉴别套装包含在实施第三实施方式所记载的生药鉴别方法方面所需的要素作为组成要素，该第三实施方式为鉴别待测植物是否为生药的基原植物。本实施方式中使用生药鉴别套装，因此能够简便地进行待测植物的生药鉴别。
2-2.组成
作为必需的组成要素，本实施方式的生药鉴别套装包含第一实施方式所记载的用于鉴别生药的引物组。本实施方式的生药鉴别套装中，用于针对一种生药进行鉴别的引物组可以包含2组以上。另外，一个套装所包含的生药种类也可以为两种以上。
作为可选组成要素，生药鉴别套装可以包含各生药的标准序列信息。“各生药的标准序列信息”是指通过以从各生药的基原植物中制备的核酸为模板并使用用于鉴别该生药的引物进行核酸扩增反应而得到的扩增产物的碱基序列信息。生药鉴别套装中可以以在记录于纸质媒介或CD-ROM等电子媒介等信息传递媒介中的状态，或者作为通过互联网提供信息的URL来包含用于鉴别生药的引物组所对应的标准序列信息。
另外，生药鉴别套装可以包含用于从待测植物中提取核酸分子的试剂(例如氯化苄、表面活性剂等)、使用用于鉴别生药的引物组进行核酸扩增反应所需的试剂(耐热性DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等)和/或使用说明书等。
3.生药鉴别方法
3-1.概要
本发明的第三实施方式为生药鉴别方法。本实施方式的生药鉴别方法是通过使用第一实施方式所记载的用于鉴别生药的引物组准确地鉴定候选生药的待测植物是否为目标生药的基原植物，由此鉴别该候选生药是否为目标生药的方法。使用本实施方式的方法，可以简便且准确地鉴别生药。
3-2.方法
作为必须步骤，本实施方式的生药鉴别方法包括核酸提取步骤、核酸扩增步骤、碱基序列确定步骤以及比对鉴别步骤。下面对各步骤进行具体说明。
(1)核酸提取步骤
“核酸提取步骤”是指从候选生药的待测植物中提取核酸分子的步骤。在多数情况下，作为本方法中检测对象的待测植物被施以蒸汽处理、加热、干燥、溶液浸泡等加工处理。因此，选取经过这些加工处理的待测植物的一部分，利用该领域中的常规方法提取核酸分子即可。关于核酸提取方法，根据要提取的核酸分子的种类使用合适的方法即可。例如，提取DNA时，可以使用CTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide，溴代十六烷基三甲胺)法、氯化苄法等。另外列举有AGPC(酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿)法。关于这些方法的具体步骤等，可参考该领域的操作流程。关于操作流程，例如列举有Green,MR and Sambrook,J,(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Fourth Ed.,(《分子克隆实验指南(第4版)》)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。此外，从植物体中提取各种核酸分子的套装，由QIAGEN公司、Takara Bio Inc.、东洋纺公司、赛默飞世尔科技公司、普洛麦格公司等各生命科学厂商正在销售，也可以利用这些产品。
(2)核酸扩增步骤
“核酸扩增步骤”是指以在所述核酸提取步骤中获得的待测植物的核酸分子为模板，使用第一实施方式所记载的用于生药鉴定的引物组，对特定核酸区域进行扩增的步骤。
本说明书中，“核酸扩增法”是指使用引物，利用聚合酶对目的核酸进行扩增的方法。例如，列举有：PCR法(包括RT-PCR法)、NASBA(Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification，依赖核酸序列的扩增)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，等温的和嵌合引物起始的核酸扩增)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification，环介导等温扩增)(注册商标)法(包括RT-LAMP法)等。本发明中使用的核酸扩增法没有限制，优选为PCR法。另外，用作模板的核酸分子为mRNA时(例如为rbcL mRNA时)，核酸扩增步骤使用如NASBA法的RNA扩增法，或者如RT-PCR法及RT-LAMP法的在利用反转录反应将mRNA制备为cDNA后使用DNA扩增法。
本步骤中使用的用于生药鉴定的引物组是针对候选生药作为鉴别对象时的目标生药的基原植物的引物组。
关于各核酸扩增方法，参考该领域中已公知的各种操作流程所记载的条件进行即可。作为操作流程集的示例，列举有前述的Green,MR and Sambrook,J,(2012)、DominguesL.(2017)PCR:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,Humana Press或Park DJ,(2010)PCR Protocols,Methods in Molecular Biology,Third Edition,HumanaPress等。需要说明的是，本步骤中，在模板的互补链合成时，当掺入除了G-C碱基对或A-T碱基对以外的错误时，则在后述的比对鉴别步骤中，在检验碱基序列与标准序列的不同时，会导致错误的比对结果，故鉴别精度会明显降低。因此，在用于核酸扩增反应的聚合酶中，优选使用在互补链合成时错误率低的高保真聚合酶(例如Pfu DNA聚合酶)。
如前所述，用于核酸扩增的套装由各生命科学厂商正在销售，也可以利用这些产品。这种情况下，关于核酸扩增方法的条件等，按照附带或各厂商推荐的操作流程即可。
(3)碱基序列确定步骤
“碱基序列确定步骤”是指对通过所述核酸扩增步骤获得的扩增产物的碱基序列进行确定的步骤。
在核酸扩增步骤之后获得的扩增产物是待测植物中的特定核酸区域。对该扩增产物的碱基序列进行确定。
根据需要，扩增产物也可以在确定碱基序列之前进行纯化和/或克隆。扩增产物的纯化可以利用该领域中公知的各种核酸纯化法。例如，列举有利用凝胶电泳的分离提取方法、使用二氧化硅基质及二氧化硅膜等的吸附纯化方法等。关于核酸的纯化方法，可以参考各种操作流程集所记载的方法。例如，列举有前述的Green,MR and Sambrook,J,(2012)、Domingues L.(2017)，或Park DJ,(2010)等。另外，多数的核酸纯化套装也由前述的各生命科学厂商正在销售，也可以利用这些产品。这种情况下，关于核酸纯化方法的具体条件等，按照附带或各厂商推荐的操作流程即可。
扩增产物的克隆可以通过将获得的扩增产物导入质粒等中，再转入到大肠杆菌等宿主内，从而以从其转化体中回收的方式实现。关于扩增产物的克隆法，按照该领域中公知的、前述操作流程集等所记载的方法进行即可。关于该扩增产物的克隆，各生命科学厂商正在销售各种用于克隆的套装。例如，用于扩增产物的克隆的套装列举有Mighty TA-cloningKit(Takara Bio Inc.)等。使用这些市售的套装会很方便。
扩增产物的碱基序列确定法利用该领域中公知的碱基序列确定法实施即可。例如，除了通常的桑格法(双脱氧法)以外，还可列举有：焦磷酸测序法(罗氏公司)、合成测序法(Illumina公司)、连接测序法(赛默飞世尔科技公司)、离子半导体测序法(赛默飞世尔科技公司)等下一代测序法。这些方法除了该领域中公知的、各种操作流程集所记载的以外，也可以参考各公司网页上公开的方法。
本步骤中确定的扩增产物的碱基序列的准确性，从本发明的主旨来看是很重要的。因此，优选如桑格法的序列读取错误率低的碱基序列确定法。
(4)比对鉴别步骤
“比对鉴别步骤”是指将所述碱基序列确定步骤中确定的待测植物中的特定核酸区域的碱基序列与目标生药的基原植物中的标准序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则该待测植物被鉴别为该基原植物，所述候选生药被鉴别为目标生药的步骤。
基原植物的标准序列是在与待测植物相同的条件下，对基原植物进行核酸提取步骤、核酸扩增步骤以及碱基序列确定步骤而获得的特定核酸区域的碱基序列。基原植物中具有特异性的序列，即使是基原植物的同属近缘种及近似种，原则上该标准序列的部分碱基也是不同的。
需要说明的是，如上所述，在本说明书中，标准序列是在生药基原植物的特定核酸区域的碱基序列中，在用于鉴别生药的引物组的正向引物的碱基序列和与反向引物的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列。
因此，将待测植物的扩增产物中在用于鉴别生药的引物组的正向引物的碱基序列和与反向引物的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列，与基原植物的标准序列进行比对，如果该序列完全一致，则可准确地鉴定出待测植物是基原植物。如果待测植物是目标生药的基原植物，则可鉴别出该候选生药是目标生药。另一方面，如果该序列不一致，则认定待测植物不是基原植物，或混有非基原植物的植物种。因此，可鉴别出候选生药不是目标生药。
下面针对各种生药中，准确地鉴定出待测植物是否为目标生药的基原植物，并根据其结果鉴别生药的具体步骤进行说明。
(茯苓的鉴别方法)
从候选茯苓的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:1和SEQID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:1所示的碱基序列和与SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与茯苓的标准序列即SEQ ID NO:5所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:3所示的碱基序列和与SEQ ID NO:4所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与茯苓的标准序列即SEQ ID NO:11所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茯苓的基原植物，所述候选茯苓被鉴别为茯苓。
(地黄的鉴别方法)
从候选地黄的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:17和SEQID NO:18所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:17所示的碱基序列和与SEQ ID NO:18所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与地黄的标准序列即SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地黄的基原植物，所述候选地黄被鉴别为地黄。
(延胡索的鉴别方法)
从候选延胡索的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:26所示的碱基序列和与SEQ ID NO:27所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与延胡索的标准序列即SEQ IDNO:28所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为延胡索的基原植物，所述候选延胡索被鉴别为延胡索。
(葛根的鉴别方法)
从候选葛根的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:37和SEQID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:37和SEQ IDNO:38所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:37所示的碱基序列和与SEQ ID NO:38所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与葛根的标准序列即SEQ ID NO:41所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:39所示的碱基序列和与SEQ ID NO:40所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与葛根的标准序列即SEQ IDNO:46所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为葛根的基原植物，所述候选葛根被鉴别为葛根。
(防风的鉴别方法)
从候选防风的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:51和SEQID NO:52所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:51所示的碱基序列和与SEQ ID NO:52所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与防风的标准序列即SEQ ID NO:53所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为防风的基原植物，所述候选防风被鉴别为防风。
(远志的鉴别方法)
从候选远志的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:65和SEQID NO:66所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:65所示的碱基序列和与SEQ ID NO:66所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与远志的标准序列即SEQ IDNO:67所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为远志的基原植物，所述候选远志被鉴别为远志。
(薄荷的鉴别方法)
从候选薄荷的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:73和SEQID NO:74所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:73所示的碱基序列和与SEQ ID NO:74所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与薄荷的标准序列即SEQ ID NO:75所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为薄荷的基原植物，所述候选薄荷被鉴别为薄荷。
(麻黄的鉴别方法)
从候选麻黄的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:85和SEQID NO:86，或者由SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rbcL区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:85和SEQID NO:86所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:85所示的碱基序列和与SEQ ID NO:86所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与麻黄的标准序列即SEQ ID NO:87～SEQ ID NO:89中任一个所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:385所示的碱基序列和与SEQ ID NO:386所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:387～SEQ ID NO:389中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麻黄的基原植物，所述候选麻黄被鉴别为麻黄。
(大枣/酸枣仁的鉴别方法)
从候选大枣/酸枣仁的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:101所示的碱基序列和与SEQ ID NO:102所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与大枣/酸枣仁的标准序列即SEQ ID NO:105所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:103所示的碱基序列和与SEQ ID NO:104所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与大枣/酸枣仁的标准序列即SEQ ID NO:115所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为大枣/酸枣仁的基原植物，所述候选大枣/酸枣仁被鉴别为大枣/酸枣仁。
(栝楼根/栝楼仁的鉴别方法)
从候选栝楼根/栝楼仁的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ IDNO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rpl16内含子区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ IDNO:125所示的碱基序列和与SEQ ID NO:126所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与栝楼根/栝楼仁的标准序列即SEQ ID NO:129～SEQ ID NO:131中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:127所示的碱基序列和与SEQ ID NO:128所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与栝楼根/栝楼仁的标准序列即SEQ ID NO:135～SEQ ID NO:137中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为栝楼根/栝楼仁的基原植物，所述候选栝楼根/栝楼仁被鉴别为栝楼根/栝楼仁。
(吴茱萸的鉴别方法)
从候选吴茱萸的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:141所示的碱基序列和与SEQ ID NO:142所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与吴茱萸的标准序列即SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:147中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQID NO:143所示的碱基序列和与SEQ ID NO:144所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与吴茱萸的标准序列即SEQ ID NO:158～SEQ ID NO:160中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为吴茱萸的基原植物，所述候选吴茱萸被鉴别为吴茱萸。
(前胡的鉴别方法)
从候选前胡的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:171所示的碱基序列和与SEQ ID NO:172所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与前胡的标准序列即SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ IDNO:401所示的碱基序列和与SEQ ID NO:402所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:404所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为前胡的基原植物，所述候选前胡被鉴别为前胡。
(知母的鉴别方法)
从候选知母的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:186所示的碱基序列和与SEQ ID NO:187所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与知母的标准序列即SEQ IDNO:188所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为知母的基原植物，所述候选知母被鉴别为知母。
(麦冬的鉴别方法)
从候选麦冬的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:199所示的碱基序列和与SEQ ID NO:200所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与麦冬的标准序列即SEQ IDNO:201所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麦冬的基原植物，所述候选麦冬被鉴别为麦冬。
(白芷的鉴别方法)
从候选白芷的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214，或者由SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:213所示的碱基序列和与SEQ ID NO:214所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与白芷的标准序列即SEQ ID NO:215所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:416所示的碱基序列和与SEQ ID NO:417所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ IDNO:418所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为白芷的基原植物，所述候选白芷被鉴别为白芷。
(威灵仙的鉴别方法)
从候选威灵仙的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:227所示的碱基序列和与SEQ ID NO:228所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与威灵仙的标准序列即SEQ IDNO:229～SEQ ID NO:231中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为威灵仙的基原植物，所述候选威灵仙被鉴别为威灵仙。
(茵陈蒿的鉴别方法)
从候选茵陈蒿的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的petD-rpoA区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:241所示的碱基序列和与SEQ ID NO:242所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与茵陈蒿的标准序列即SEQ ID NO:245所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:243所示的碱基序列和与SEQ ID NO:244所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与茵陈蒿的标准序列即SEQ ID NO:253所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茵陈蒿的基原植物，所述候选茵陈蒿被鉴别为茵陈蒿。
(地骨皮的鉴别方法)
从候选地骨皮的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的trnH-psbA区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:261所示的碱基序列和与SEQ IDNO:262所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与地骨皮的标准序列即SEQID NO:263或SEQ ID NO:264所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地骨皮的基原植物，所述候选地骨皮被鉴别为地骨皮。
(砂仁的鉴别方法)
从候选砂仁的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:276所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:275所示的碱基序列和与SEQ ID NO:276所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与砂仁的标准序列即SEQ IDNO:277所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为砂仁的基原植物，所述候选砂仁被鉴别为砂仁。
(忍冬藤的鉴别方法)
从候选忍冬藤的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:284所示的碱基序列和与SEQ IDNO:285所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与忍冬藤的标准序列即SEQID NO:286所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为忍冬藤的基原植物，所述候选忍冬藤被鉴别为忍冬藤。
(川骨的鉴别方法)
从候选川骨的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:298所示的碱基序列和与SEQ ID NO:299所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与川骨的标准序列即SEQ IDNO:300所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为川骨的基原植物，所述候选川骨被鉴别为川骨。
(桑白皮的鉴别方法)
从候选桑白皮的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:312所示的碱基序列和与SEQ ID NO:313所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与桑白皮的标准序列即SEQ IDNO:314所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为桑白皮的基原植物，所述候选桑白皮被鉴别为桑白皮。
(羌活的鉴别方法)
从候选羌活的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:324所示的碱基序列和与SEQ ID NO:325所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与羌活的标准序列即SEQ IDNO:326或SEQ ID NO:327所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为羌活的基原植物，所述候选羌活被鉴别为羌活。
(枇杷叶的鉴别方法)
从候选枇杷叶的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:332所示的碱基序列和与SEQ ID NO:333所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与枇杷叶的标准序列即SEQ ID NO:336所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:334和SEQID NO:335所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:334所示的碱基序列和与SEQ ID NO:335所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与枇杷叶的标准序列即SEQ ID NO:348所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为枇杷叶的基原植物，所述候选枇杷叶被鉴别为枇杷叶。
(硬紫草的鉴别方法)
从候选硬紫草的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:360所示的碱基序列和与SEQ ID NO:361所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与硬紫草的标准序列即SEQ IDNO:362所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为硬紫草的基原植物，所述候选硬紫草被鉴别为硬紫草。
(杜仲的鉴别方法)
从候选杜仲的待测植物中提取核酸，以该核酸为模板，使用由SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增后，确定扩增产物的碱基序列。之后，将扩增产物中在SEQ ID NO:374所示的碱基序列和与SEQ IDNO:375所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与杜仲的标准序列即SEQID NO:376所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为杜仲的基原植物，所述候选杜仲被鉴别为杜仲。
[实施例]
下面利用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于这些实施例。
<实施例1：茯苓的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，茯苓的基原植物为茯苓Wolfiporia cocosRyvarden et Gilbertson(Poria cocos Wolf)(多孔菌科)。但众所周知，同种中有很多种内变异，日本市场上虽然有符合日本药局方规定的品种，但也有可能流通碱基序列不同的多种品系。不同品系中所含的成分有可能不同，为了保证药物的质量，避免混用这些不同品系是有效的方法。
因此，本发明人对茯苓的各品系及其近缘菌的基因组DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，市场主要流通品茯苓具有固定的序列，能够与同种内其他品系等区别开。因此，该区域对于区别茯苓各品系是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对茯苓各品系的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于茯苓各品系，以能够对由各种样品中将可以区别品系间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药样品(茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的菌核)的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于相同基原种内的各品系，则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：007-5F(Bukuryou(茯苓)-f1)(GAGCGTCGCGGAACCCTCAAC；SEQ ID NO:1；10pmol/μL)1μL、反向引物：007-5R(Bukuryou(茯苓)-r3)(CAATCCGGTCCGGGCTAATG；SEQ ID NO:2；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件1)
将PCR反应液1放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×40个循环、72℃×7min。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：007-6F(Bukuryou(茯苓)-f2)(CTCAACTCCGTCCGCCTTTG；SEQ ID NO:3；10pmol/μL)1μL、反向引物：007-6R(Bukuryou(茯苓)-r3)(CAATCCGGTCCGGGCTAATG；SEQ ID NO:4；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件2)
将PCR反应液2放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法：(94℃，4min)、(95℃，30sec；70℃，15sec；72℃，15sec)×3个循环、(95℃，30sec；66℃，15sec；72℃，15sec)×3个循环、(95℃，30sec；62℃，15sec；72℃，15sec)×3个循环、(95℃，30sec；58℃，15sec；72℃，15sec)×3个循环、(95℃，30sec；54℃，15sec；72℃，15sec)×3个循环、(95℃，30sec；48℃，1.5min；72℃，2.5min)×20个循环、(72℃，7min.)×1个循环。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
在PCR之后，利用凝胶电泳法确认目的特定核酸区域的扩增产物，并将其分离。具体而言，在PCR之后的反应液中添加2μL的BlueJuice凝胶加样缓冲液，制备样本溶液。将总量2％NuSieve+SeaKEM(Takara Bio Inc.)+1×TAE的凝胶浸泡在Mupid EX-U电泳槽(Mupid公司)中填充的1×TAE缓冲液中，将样品溶液加入孔中之后，在100V×约30分钟的条件下进行了电泳。使用波长为500nm的“LED透照仪LB-16BG”(Nippon Genetics公司)和凝胶成像装置Printgraph AE-6931FXCF(ATTO公司)对目标PCR产物的上样量15μL进行确认，并拍摄了图像。
接着，使用一次性手术刀从目的扩增产物中切取预期大小的条带，使用illustraGFX PCR纯化套装(GE Healthcare日本公司)提取后，使用同一套装中的Type4缓冲液20μL进行洗脱。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
为了循环序列反应的优化，使用Nanodrop 2000C(Biomedical Science公司)测定扩增产物的浓度，用TE缓冲液稀释以达到适宜浓度。
将BigDye Terminator v.3.1溶液(赛默飞世尔科技公司)0.8μL、5×缓冲液(赛默飞世尔科技公司)0.4μL、蒸馏水0.8μL、扩增核酸时使用的引物(1pmol/μL)1μL、纯化扩增产物1μL进行混合，将其200μL装入96孔板，使用GeneAmp 9700(赛默飞世尔科技公司)按照BigDye Terminator v.3.1手册所指定的条件进行了循环测序。
反应后，通过BigDye Terminator v.3.1手册中指定的EDTA乙醇沉淀法，获得纯化扩增产物。
在ABI PRISM(注册商标)3500xL遗传分析仪(赛默飞世尔科技公司)中，使用50cm毛细管、POP7并按照该仪器的手册，确定扩增产物的碱基序列。
之后，利用VectorNTI 9.0for Windows(赛默飞世尔科技公司)中的ContigExpress，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的茯苓及其他品系茯苓的同源序列进行比对(表3和表4，以及图1和图2)。
[表3]
使用引物组007-5F&007-5R(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
[表4]
使用引物组007-6F&007-6R(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图1和图2中获得的核内核糖体DNA中的ITS区域分别为使用引物组007-5F&007-5R和引物组007-6F&007-6R进行PCR扩增，并确定碱基序列的部分区域的序列。片段的长度分别为153bp和138bp(包含引物的长度)，通常如果可以使用引物组007-5F&007-5R来确定片段长度为153bp的部分区域，则无需使用引物组007-6F&007-6R进行试验。需要说明的是，关于片段化严重的样品，如果不能使用引物组007-5F&007-5R成功进行PCR扩增，则可以利用能够应对更短片段的引物组007-6F&007-6R，来确定138bp(包含引物的长度)的碱基序列。这两组引物组共同显示出6个位点的鉴别位点。
图1中，首先，在第27位、第32位、第83位为C和在第89位为T的是茯苓Wolfiporiacocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的主要品系，样品与该品系一致。在第56位、第59位，不能通过各自位点来区别茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的主要品系与同种内其他品系，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的主要品系与同种内其他品系，必要条件是评价第27位、第32位、第83位或第89位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
另外，图2与图1相同，首先，在第13位、第18位、第69位为C和在第75位为T的是茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的主要品系，样品与该品系一致。在第42位、第45位，不能通过各自位点来区别茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden etGilbertson(多孔菌科)的主要品系与同种内其他品系，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别茯苓Wolfiporia cocos Ryvarden et Gilbertson(多孔菌科)的主要品系与同种内其他品系，必要条件是评价第13位、第18位、第69位或第75位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
<实施例2：地黄的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，地黄的基原植物为赤野地黄Rehmanniaglutinosa Liboschitz var.purpurea Makino或地黄Rehmannia glutinosa Liboschitz(玄参科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种湖北地黄(Rehmannia henryi)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对地黄及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，地黄在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别地黄与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对地黄与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于地黄与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(赤野地黄Rehmannia glutinosaLiboschitz var.purpurea Makino或地黄Rehmannia glutinosa Liboschitz(玄参科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：011-1F(Jiou(地黄)-ITS1-f1)(CAACCTCTCGCCGCGTTCCC；SEQ ID NO:17；10pmol/μL)1μL、反向引物：011-1R(Jiou(地黄)-ITS1-r3)(CGAGAGACATCCTTTCCCCCC；SEQ ID NO:18；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的地黄和其他近缘种的同源序列进行比对(表5和图3)。
[表5]
使用引物组011-1F&011-1R(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图3表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出5个位点的鉴别位点。在第8位、第17位、第75位、第92位、第97位，不能通过各自位点来区别赤野地黄Rehmanniaglutinosa Liboschitz var.purpurea Makino或地黄Rehmannia glutinosa Liboschitz(玄参科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例3：延胡索的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，延胡索的基原植物为延胡索Corydalisturtschaninovii Besser forma yanhusuo Y.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种东北延胡索(Corydalis ambigua)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对延胡索及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，延胡索在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别延胡索与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对延胡索与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于延胡索与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(延胡索Corydalisturtschaninovii Besser forma yanhusuo Y.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种中的金球黄堇(Corydalis boweri)、石生黄堇(Corydalissaxicola)、川鄂黄堇(Corydalis wilsonii)、灰绿黄堇(Corydalis adunca)、东北延胡索(Corydalis ambigua)、阿山黄堇(Corydalis nobilis)、钩距黄堇(Corydalis hamata)，则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：019-1F(019-T1F)(ACASAGGCCCCGGGAGGCCGRCG；SEQ ID NO:26；10pmol/μL)1μL、反向引物：019-1R(019-T1R)(TTCAGCGGGTGGTCCCGCCTGAC；SEQ ID NO:27；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的延胡索和其他近缘种的同源序列进行比对(表6和图4)。
[表6]
使用引物组019-1F&019-1R(SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图4表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出10个位点的鉴别位点。首先，在第68位为A的只有延胡索Corydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuoY.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)，样品与延胡索Corydalis turtschaninovii Besserforma yanhusuo Y.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)一致。在第35位、第47位、第62位、第63位、第93位、第99位、第104位、第105位、第122位，不能通过各自位点来区别延胡索Corydalisturtschaninovii Besser forma yanhusuo Y.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别延胡索Corydalis turtschaninovii Besser forma yanhusuoY.H.Chou et C.C.Hsu(罂粟科)和其他近缘种，必要条件是评价第68位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计10个位点。
<实施例4：葛根的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，葛根的基原植物为野葛Pueraria lobataOhwi(豆科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种粉葛(Pueraria montanavar.thomsonii)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对葛根及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，葛根在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别葛根与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对葛根与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于葛根与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：021-1F(Kakkon(葛根)-ITS1-f2)(CGGAAGGATCATTGTCGATGC；SEQ ID NO:37；10pmol/μL)1μL、反向引物：021-1R(kakkon-ITS1-r1)(GTGTTTGTTGGGGAAGGAGG；SEQ ID NO:38；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：021-2F(Kakkon(葛根)-ITS2-f1)(GAACGCAAGTTGCGCCCGAAG；SEQ ID NO:39；10pmol/μL)1μL、反向引物：021-2R(kakkon-ITS2-r1)(CGAACTCGATTTTCAACCAAC；SEQ ID NO:40；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的葛根和其他近缘种的同源序列进行比对(表7和表8，以及图5和图6)。
[表7]
使用引物组021-1F&021-1R(SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
[表8]
使用引物组021-2F&021-2R(SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图5表示获得的核内核糖体DNA中的ITS1区域，显示出6个位点的鉴别位点。首先，在第70位为C的只有野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)，样品与野葛Pueraria lobataOhwi(豆科)一致。在第19位、第58位、第95位、第142位、第158位，不能通过各自位点来区别野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)和其他近缘种，必要条件是评价第70位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
另外，图6表示获得的核内核糖体DNA中的ITS2区域，显示出7个位点的鉴别位点。首先，在第60位或第89位为G的只有野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)，样品与野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)一致。在第11位、第50位、第77位、第119位、第127位，不能通过各自位点来区别野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别野葛Pueraria lobata Ohwi(豆科)和其他近缘种，必要条件是评价第60位或第89位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计7个位点。
<实施例5：防风的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，防风的基原植物为防风Saposhnikoviadivaricata Schischkin(伞形科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种珊瑚菜(Glehnialittoralis)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对防风及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，防风在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别防风与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对防风与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于防风与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(防风Saposhnikovia divaricataSchischkin(伞形科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：031-1F(031-T1F)(GTGAACCTGCGGAAGGATCATTG；SEQ ID NO:51；10pmol/μL)1μL、反向引物：031-1R(031-T2R)(GAGATATCCGTTGTCGAGAGTCG；SEQ ID NO:52；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的防风和其他近缘种的同源序列进行比对(表9和图7)。
[表9]
使用引物组031-1F&031-1R(SEQ ID NO：51和SEQ ID NO52)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图7表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出20个位点的鉴别位点。首先，在第14位、第85位为C，在第123位、第210位为T，或者在第164位为A的只有防风Saposhnikovia divaricata Schischkin(伞形科)，样品与防风Saposhnikoviadivaricata Schischkin(伞形科)一致。在第6位、第19位、第38位、第46位、第51位、第55位、第65位、第78位、第88位、第101位、第105位、第117位、第156位、第179位、第198位，不能通过各自位点来区别防风Saposhnikovia divaricata Schischkin(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别防风Saposhnikovia divaricata Schischkin(伞形科)和其他近缘种，必要条件是评价第14位、第85位、第123位、第210位或者第164位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计20个位点。
<实施例6：远志的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，远志的基原植物为远志Polygalatenuifolia Willdenow(远志科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种西伯利亚远志(Polygala sibirica)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对远志及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中psbA-trnH区域的序列中，远志在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别远志与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对远志与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于远志与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(远志Polygala tenuifoliaWilldenow(远志科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于叶绿体DNA中的psbA-trnH区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：033-2F(onji(远志)-psbA-trnH-f1)(CCTAGCTGTTGTAGAAGCTC；SEQ ID NO:65；10pmol/μL)1μL、反向引物：033-2R(onji(远志)-psbA-trnH-r1)(CCAATTCTTTTTTATTATGAG；SEQ IDNO:66；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，48℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的远志和其他近缘种的同源序列进行比对(表10和图8)。
[表10]
使用引物组033-2F&033-2R(SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66)扩增并确定的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域碱基序列
3.结果
图8表示获得的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域，显示出6个位点的鉴别位点。首先，在第159位缺失一个碱基的只有远志Polygala tenuifolia Willdenow(远志科)，样品与远志Polygala tenuifolia Willdenow(远志科)一致。另外，在第187位～第204位连续缺失18个碱基的只有远志Polygala tenuifolia Willdenow(远志科)，样品与远志Polygalatenuifolia Willdenow(远志科)一致。在第23位、第83位、第127位、第144位，不能通过单各自位点来区别远志Polygala tenuifolia Willdenow(远志科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别远志Polygala tenuifolia Willdenow(远志科)和其他近缘种，必要条件是评价第159位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
<实施例7：薄荷的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，薄荷的基原植物为薄荷Mentha arvensisLinne var.piperascens Malinvaud(唇形科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种留兰香(Mentha spicata)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对薄荷及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，薄荷在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别薄荷与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对薄荷与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于薄荷与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(薄荷Mentha arvensis Linnevar.piperascens Malinvaud(唇形科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)PlantMini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：036-1F(ITS3)＊(GCATCGATGAAGAACGCAGC；SEQ ID NO:73；10pmol/μL)1μL、反向引物：036-1R(Hakka_ITS-R1)(GATTGAGATGTTCAACCACCAC；SEQ ID NO:74；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
＊ITS3
White等人.1990.
White T.J.,Bruns T.,Lee S和Taylor J.1990.Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:Innis M.A.,Gelfand D.H.,Sninsky J.J.和White T.J.(编),PCR Protocols:a Guide to Methodsand Applications.pp.315-322.Academic Press,New York.
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，48℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的薄荷和其他近缘种的同源序列进行比对(表11和图9)。
[表11]
使用引物组036-1F&036-1R(SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图9表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出11个位点的鉴别位点。首先，在第93位为Y，在第139位为Y，在第140位为M，在第148位为R，在第161位为S，或者在第184位为Y的只有薄荷Mentha arvensis Linne var.piperascens Malinvaud(唇形科)，样品与薄荷Mentha arvensis Linne var.piperascens Malinvaud(唇形科)一致。在第77位、第83位、第136位、第169位、第216位，不能通过各自位点来区别薄荷Mentha arvensis Linnevar.piperascens Malinvaud(唇形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别薄荷Mentha arvensis Linne var.piperascens Malinvaud(唇形科)和其他近缘种，必要条件是评价第93位、第139位、第140位、第148位、第161位或者第184位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计11个位点。
<实施例8：麻黄的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，麻黄的基原植物为草麻黄Ephedra sinicaStapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Meyer或木贼麻黄Ephedraequisetina Bunge(麻黄科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种山岭麻黄(Ephedragerardiana)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对麻黄及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中rbcL区域的序列中，麻黄在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别麻黄与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对麻黄与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于麻黄与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Meyer或木贼麻黄Ephedra equisetina Bunge(麻黄科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于叶绿体DNA中的rbcL区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：037-6F(rbcLEpF0)(GCGTAGGATTTAAAGCTGGTG；SEQ ID NO:85；10pmol/μL)1μL、反向引物：037-6R(037-6R)(ATTGTCTTCTCCCGGAACAGG；SEQ ID NO:86；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件1)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，50℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
(PCR反应液2)用于叶绿体DNA中的rbcL区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：037-4F(rbcLEpF1)(CTGGTGTTAAAGATTATAGA；SEQ ID NO:385；10pmol/μL)1μL、反向引物：037-4R(rbcLEpR196)(AAGACCATCAGTCCAAACTG；SEQ ID NO:386；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件2)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×1min，45℃×1min，72℃×2min)×45个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的麻黄和其他近缘种的同源序列进行比对(表12、图10和图34)。
[表12]
使用引物组037-6F&037-6R(SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：86)扩增并确定的叶绿体DNA中的rbcL区域碱基序列
使用引物组037-4F&037-4R(SEQ ID NO：385和SEQ ID NO：386)扩增并确定的叶绿体DNA中的rbcL区域碱基序列
3.结果
反应液1、2的区别在于扩增片段长度不同，一般而言，长度越短，扩增成功率越高，但得到的鉴别位点的数量越少，难以用自动测序仪确定序列。本方法是在反应液1中尝试确定序列，当失败时则在反应液2中进行，通过设置这种二阶段的试验，可以降低成本和应对样品的DNA质量的差异。
图10表示获得的叶绿体DNA中的rbcL区域，显示出5个位点的鉴别位点。在第48位、第55位、第89位、第99位、第108位，不能通过各自位点来区别草麻黄Ephedra sinicaStapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Meyer或木贼麻黄Ephedraequisetina Bunge(麻黄科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
能够利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则根据上述图10的信息，满足用于区别符合的品种与其他近缘种的必要条件。
不能利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则可以通过利用PCR反应液2进行扩增和确定序列，来区别符合的品种与其他近缘种。
在图34中表示获得的叶绿体DNA中的rbcL区域，显示出5个位点的鉴别位点。在第34位、第41位、第75位、第85位、第94位，不能通过各自位点来区别草麻黄Ephedra sinicaStapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Meyer或木贼麻黄Ephedraequisetina Bunge(麻黄科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例9：大枣/酸枣仁的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，大枣的基原植物为枣Ziziphus jujubaMiller var.inermis Rehder(鼠李科)；酸枣仁的基原植物为酸枣Ziziphus jujubaMiller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种大果枣(Ziziphus mairei)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对大枣、酸枣仁及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，大枣、酸枣仁在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别大枣、酸枣仁与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对大枣、酸枣仁与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于大枣、酸枣仁与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(大枣：枣Ziziphus jujuba Millervar.inermis Rehder(鼠李科)；酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Huex H.F.Chou(鼠李科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种中的Ziziphus calophylla、凸枣(Ziziphus mucronata)、Ziziphus horsfieldii、叙利亚枣(Ziziphus spina-christi)、Ziziphus glabrata、Ziziphus brunoniana、大果枣(Ziziphus mairei)、蜀枣(Ziziphus xiangchengensis)、滇刺枣(Ziziphus mauritiana)、小果枣(Ziziphus oenoplia)，则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：039-1F(048-T2F)(GATGCGCGGTTGCAGCCTTC；SEQ ID NO:101；10pmol/μL)1μL、反向引物：039-1R(048-T3R)(GATATCCGTTGCCGAGAGTCG；SEQ ID NO:102；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：039-2F(048-T3F)(CTTCCCGGCCGCACAAACG；SEQ ID NO:103；10pmol/μL)1μL、反向引物：039-2R(024-1R＝Ougon-ITS2)(GAGAGCCGAGATATCCGTTGC；SEQ ID NO:104；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的大枣、酸枣仁和其他近缘种的同源序列进行比对(表13和表14，以及图11和图12)。
[表13]
使用引物组039-1F&039-1R(SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
[表14]
使用引物组039-2F&039-2R(SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图11和图12中获得的核内核糖体DNA中的ITS区域分别为使用引物组039-1F&039-1R(引物组048-1F&048-1R)和引物组039-2F&039-2R(引物组048-2F&048-2R)进行PCR扩增，并确定碱基序列的部分区域的序列。片段的长度分别为约170bp和约160bp(包含引物的长度)，通常如果可以使用引物组039-1F&039-1R(048-1F&048-1R)来确定片段长度为约170bp的部分区域，则无需使用引物组039-2F&039-2R(048-2F&048-2R)进行试验。需要说明的是，关于片段化严重的样品，如果不能使用引物组039-1F&039-1R成功进行PCR扩增，则可以利用能够应对更短片段的引物组039-2F&039-2R，来确定约160bp(包含引物的长度)的碱基序列。这两组引物组中，能够进行确定的主要鉴别位点是共同的，但根据作为比对对象的其他近缘种的种类，鉴别位点有时会发生变化，图11和图12中示出了与各个比对对象的鉴别位点。
图11表示使用引物组039-1F&039-1R(引物组048-1F&048-1R)获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出9个位点的鉴别位点。首先，在第121位为A的是枣(Ziziphusjujuba)，也就是说只有大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)；酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)，样品与大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphusjujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)一致。在第18位、第70位、第76位、第81位、第92位、第113位、第118位、第122位，不能通过各自位点来区别大枣：枣Ziziphusjujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Millervar.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)与其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)与其他近缘种，必要条件是评价第121位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计9个位点。
图12表示使用引物组039-2F&039-2R(引物组048-2F&048-2R)获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出9个位点的鉴别位点。首先，在第104位为A的是枣(Ziziphusjujuba)，也就是说只有大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)；酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)，样品与大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphusjujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)一致。在第32位、第54位、第60位、第65位、第96位、第101位、第105位、第106位，不能通过各自位点来区别大枣：枣Ziziphusjujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Millervar.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)与其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别大枣：枣Ziziphus jujuba Miller var.inermis Rehder(鼠李科)和酸枣仁：酸枣Ziziphus jujuba Miller var.spinosa Hu ex H.F.Chou(鼠李科)与其他近缘种，必要条件是评价第104位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计9个位点。
<实施例10：栝楼根/栝楼仁的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，栝楼根、栝楼仁的基原植物均为栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz、日本栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowiczvar.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteata Voigt(葫芦科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种Trichosanthes cucmeroides等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对栝楼根、栝楼仁及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中rpl16内含子部分区域的序列中，栝楼根、栝楼仁在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别栝楼根、栝楼仁与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对栝楼根、栝楼仁与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于栝楼根、栝楼仁与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(栝楼Trichosanthes kirilowiiMaximowicz、日本栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz var.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteata Voigt(葫芦科))及其近缘植物的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种，则从收集的腊叶标本的一部分提取，从而获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于叶绿体DNA中的rpl16内含子部分区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：063-1F(rpl16/F)(GTTTCTTCTCATCCAGCTCC；Nishizawa&Watano 2000；SEQ ID NO:125；10pmol/μL)1μL、反向引物：063-1R(Karokon(栝楼根)-rpl16-R1)(CTATAAAGAGTTTAGTTTTCTATC；SEQ ID NO:126；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR反应液2)用于叶绿体DNA中的rpl16内含子部分区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：063-2F(Karokon(栝楼根)-rpl16-F2)(GATAGAAAACTAAACTCTTTATAG；SEQ ID NO:127；10pmol/μL)1μL、反向引物：063-2R(rpl16/R)(GAAAGAGTCAATATTCGCCC；Nishizawa&Watano 2000；SEQ ID NO:128；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，48℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的栝楼根、栝楼仁和其他近缘种的同源序列进行比对(表15和表16，以及图13和图14)。
[表15]
使用引物组063-1F&063-1R(SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126)扩增并确定的叶绿体DNA中的rp116内含子部分区域碱基序列
[表16]
使用引物组063-2F&063-2R(SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128)扩增并确定的叶绿体DNA中的rp116内含子部分区域碱基序列
3.结果
图13和图14中获得的叶绿体DNA中的rpl16内含子部分区域分别为使用引物组063-1F&063-1R(引物组045-1F&045-1R)和引物组063-2F&063-2R(引物组045-2F&045-2R)进行PCR扩增，并确定碱基序列的区域的序列。
图13表示使用引物组063-1F&063-1R(引物组045-1F&045-1R)获得的叶绿体DNA中的rpl16内含子部分区域，显示出5个位点的鉴别位点。首先，在第58位为C的是栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz、日本栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowiczvar.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteata Voigt(葫芦科)和其他近缘种双边栝楼(Trichosanthes rosthornii)，样品与这些物种一致。仅通过该区域不能区别栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz与其他近缘种双边栝楼(Trichosanthesrosthornii)。
图14表示使用引物组063-2F&063-2R(引物组045-2F&045-2R)获得的叶绿体DNA中的rpl16内含子部分区域，显示出4个位点的鉴别位点。在第54位、第155位、第167位、第174位，不能通过各自位点来区别栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz、日本栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz var.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteata Voigt(葫芦科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别栝楼Trichosanthes kirilowii Maximowicz、日本栝楼Trichosantheskirilowii Maximowicz var.japonica Kitamura或大苞栝楼Trichosanthes bracteataVoigt(葫芦科)和其他近缘种，必须只评价使用引物组063-2F&063-2R(引物组045-2F&045-2R)获得的部分区域(图14)，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求也要评价使用引物组063-1F&063-1R(引物组045-1F&045-1R)获得的部分区域(图13)。
<实施例11：吴茱萸的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，吴茱萸的基原植物为吴茱萸Euodiaruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodiaofficinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种臭檀吴萸(Tetradium daniellii)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对吴茱萸及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，吴茱萸在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别吴茱萸与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对吴茱萸与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于吴茱萸与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(吴茱萸Euodia ruticarpa Hookerfilius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieriDode)(芸香科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：042-1F(Goshuyu(吴茱萸)-ITS1-f1)(CCTGCGGAAGGATCATTGTCG；SEQ ID NO:141；10pmol/μL)1μL、反向引物：042-1R(Goshuyu(吴茱萸)-ITS1-r1)(GTGAAAGAAGGCGCCGCATCC；SEQ ID NO:142；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：042-2F(Goshuyu(吴茱萸)-ITS1-f1)(＝042-1F)(CCTGCGGAAGGATCATTGTCG；SEQ ID NO:143；10pmol/μL)1μL、反向引物：042-2R(Goshuyu(吴茱萸)-ITS1-r2)(GGGAGCGTGCTCTCTCGTTAG；SEQ ID NO:144；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的吴茱萸和其他近缘种的同源序列进行比对(表17和表18，以及图15和图16)。
[表17]
使用引物组042-1F&042-1R(SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：142)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
[表18]
使用引物组042-2F&042-2R(SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
反应液1和2的区别在于扩增片段长度不同，一般而言，长度越短，扩增成功率越高，但得到的鉴别位点的数量越少，难以用自动测序仪确定序列。本方法是在反应液1中尝试确定序列，当失败时则在反应液2中进行，通过设置这种二阶段的试验，可以降低成本和应对样品的DNA质量的差异。
图15表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出14个位点的鉴别位点。首先，在第127位或第193位为T的只有吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalisDode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)，样品与吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodiabodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)一致。在第20位、第33位、第41位、第45位、第82位、第86位、第104位、第112位、第122位、第157位、第175位、第188位，不能通过各自位点来区别吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpaBentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodiarutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)和其他近缘种，必要条件是评价第127位或第193位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计14个位点。
能够利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则根据上述图15的信息，满足用于区别符合的品种与其他近缘种的必要条件。
不能利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则可以通过利用PCR反应液2进行扩增和确定序列，来根据上述图16的信息区别符合的品种与其他近缘种。
图16表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出10个位点的鉴别位点。首先，在第127位为T的只有吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodiarutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)，样品与吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieriDode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)一致。在第20位、第33位、第41位、第45位、第82位、第86位、第104位、第112位、第122位，不能通过各自位点来区别吴茱萸Euodia ruticarpaHooker filius et Thomson(Evodia rutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalisDode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodiabodinieri Dode)(芸香科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别吴茱萸Euodia ruticarpa Hooker filius et Thomson(Evodiarutaecarpa Bentham)、石虎Euodia officinalis Dode(Evodia officinalis Dode)或疏毛吴茱萸Euodia bodinieri Dode(Evodia bodinieri Dode)(芸香科)和其他近缘种，必要条件是评价第127位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计10个位点。
<实施例12：前胡的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，前胡的基原植物为1)白花前胡Peucedanumpraeruptorum Dunn或2)紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种华中前胡(Peucedanum medicum)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对前胡及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，前胡在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别前胡与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对前胡与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于前胡与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(1)白花前胡Peucedanumpraeruptorum Dunn或2)紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：068-1F(068-T1F)(AAGGATCATTGTCGAATCCTGC；SEQ ID NO:171；10pmol/μL)1μL、反向引物：068-1R(068-T1R)(GAGATATCCGTTGTCGAGAGTC；SEQ ID NO:172；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：068-2F(068-T2F)(TCTGCCTGGGTGTCACGCATC；SEQ ID NO:401；10pmol/μL)1μL、反向引物：068-2R(068-T2R)(TGGGGTCACAGTCGAAGCGCA；SEQ ID NO:402；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，52℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的前胡和其他近缘种的同源序列进行比对(表19和图17)。
[表19]
使用引物组068-1F&068-1R(SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：172)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
使用引物组068-2F&068-2R(SEQ ID NO：401和SEQ ID NO：402)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图17表示获得的核内核糖体DNA中的ITS1区域，显示出18个位点的鉴别位点。首先，在第27位为T的只有紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)，在第100位为T的只有白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn(伞形科)。样品与白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn(伞形科)一致。在第3位、第32位、第40位、第44位、第52位、第59位、第67位、第77位、第106位、第112位、第123位、第153位、第179位、第187位、第195位、第199位，不能通过各自位点来区别1)白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn或2)紫花前胡Angelica decursivaFranchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn或紫花前胡Angelicadecursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)和其他近缘种，必要条件是评价第100位或第27位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计18个位点。
图35表示获得的核内核糖体DNA中的ITS2区域，显示出14位点的鉴别位点。首先，在第39位为A，在第178位为G的只有紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)；在第48位、第76位、第95位为T，在第149位、第157位为A，在第170位为G，在第184位为T的只有白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn，样品与白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn一致。在第50位、第113位、第156位、第182位、第209位，不能通过各自位点来区别1)白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn或2)紫花前胡Angelica decursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivumMaximowicz)(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn或紫花前胡Angelicadecursiva Franchet et Savatier(Peucedanum decursivum Maximowicz)(伞形科)和其他近缘种，必须评价第39位、第178位、第48位、第76位、第95位、第149位、第157位、第170位、第184位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计14个位点。
<实施例13：知母的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，知母的基原植物为知母Anemarrhenaasphodeloides Bunge(百合科)。但是，市场中虽然没有流通其他近缘种，但有可能会流通外观相似的生药，为了保证药物的质量，关键在于通过确认基原来避免误用和混用类似物。
因此，本发明人对知母和略与其近缘的植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，知母在该区域中具有固定的序列，能够与其他品种区别开。因此，该区域对于区别知母与其他品种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对知母与其他品种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于知母与较为近缘的其他品种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(知母Anemarrhena asphodeloidesBunge(百合科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：071-1F(ITS-Chimo(知母)-f1)(GAACGCAAGTTGCGCCCGAG；SEQ ID NO:186；10pmol/μL)1μL、反向引物：071-1R(ITS-Chimo(知母)-r2)(CTTGGGCCGAGAGCAAGGAC；SEQ ID NO:187；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的知母和其他近缘种的同源序列进行比对(表20和图18)。
[表20]
使用引物组071-1F&071-1R(SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图18表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出10个位点的鉴别位点。首先，在第59位、第62位、第86位、第182位为T，且在第180位发生缺失的只有知母Anemarrhenaasphodeloides Bunge(百合科)，样品与知母Anemarrhena asphodeloides Bunge(百合科)一致。在第41位、第95位、第119位、第133位、第157位，不能通过各自位点来区别知母Anemarrhena asphodeloides Bunge(百合科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别知母Anemarrhena asphodeloides Bunge(百合科)和其他近缘种，必要条件是评价第59位、第62位、第86位、第182位或者第180位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计10个位点。
<实施例14：麦冬的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，麦冬的基原植物为麦冬Ophiopogonjaponicus Ker-Gawler(百合科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种阔叶麦冬(Liriope muscari)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对麦冬及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，麦冬在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别麦冬与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对麦冬与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于麦冬与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(麦冬Ophiopogon japonicus Ker-Gawler(百合科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：075-1F(075-T1F)(TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAG；SEQ ID NO:199；10pmol/μL)1μL、反向引物：075-1R(075-T3R)(AGCAYTGTTCCTTGGCGCCC；SEQ ID NO:200；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的麦冬和其他近缘种的同源序列进行比对(表21和图19)。
[表21]
使用引物组075-1F&075-1R(SEQ ID NO：199和SEQ ID NO：200)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图19表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出13个位点的鉴别位点。首先，在第22位为A，在第29位为T，在第90位为T，在第101位为G，在第132位为T，或者在第169位为A的只有麦冬Ophiopogon japonicus Ker-Gawler(百合科)，样品与麦冬Ophiopogonjaponicus Ker-Gawler(百合科)一致。在第36位、第79位、第92位、第97位、第110位、第116位、第126位，不能通过各自位点来区别麦冬Ophiopogon japonicus Ker-Gawler(百合科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别麦冬Ophiopogon japonicus Ker-Gawler(百合科)和其他近缘种，必要条件是评价第22位、第29位、第90位、第101位、第132位或者第169位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计13个位点。
<实施例15：白芷的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，白芷的基原植物为白芷Angelicadahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier(伞形科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种紫花前胡(Angelica decursiva)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对白芷及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，白芷在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别白芷与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对白芷与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于白芷与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(白芷Angelica dahurica Benthamet Hooker filius ex Franchet et Savatier(伞形科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：076-1F(ITS5-Byakushi(白芷)-2)(GGTGAACCTGCGGAAGGATC；SEQ ID NO:213；10pmol/μL)1μL、反向引物：076-1R(ITS2-Byakushi(白芷)-1)(CCCGCTAACGGGATACGGACG；SEQ ID NO:214；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：076-3F(ITS3-Byakushi(白芷)-1)(GAACGCAAGTTGCGCCCGAAG；SEQ ID NO:416；10pmol/μL)1μL、反向引物：076-3R(ITS4-Byakushi(白芷)-1)(CACCGATGTCGCGACGTCC；SEQ ID NO:417；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的白芷和其他近缘种的同源序列进行比对(表22和图20)。
[表22]
使用引物组076-1F&076-1R(SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：214)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
使用引物组076-3F&076-3R(SEQ ID NO：416和SEQ ID NO：417)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图20表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出12个位点的鉴别位点。首先，在第51位为A的只有白芷Angelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchetet Savatier(伞形科)，样品与白芷Angelica dahurica Bentham et Hooker filius exFranchet et Savatier(伞形科)一致。在第23位、第45位、第65位、第82位、第92位、第117位、第127位、第138位、第147位、第160位、第168位，不能通过各自位点来区别白芷Angelicadahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别白芷Angelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet etSavatier(伞形科)和其他近缘种，必要条件是评价第51位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计12个位点。
图36表示获得的核内核糖体DNA中的ITS2区域，显示出6个位点的鉴别位点。首先，在第6位、第37位、第41位、第59位、第97位、第136位，不能通过各自位点来区别白芷Angelica dahurica Bentham et Hooker filius ex Franchet et Savatier(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例16：威灵仙的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，威灵仙的基原植物为威灵仙Clematischinensis Osbeck、东北铁线莲Clematis mandshurica Ruprecht或棉团铁线莲Clematishexapetala Pallas(毛茛科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种Clematis flammula等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对威灵仙及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，威灵仙在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别威灵仙与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对威灵仙与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于威灵仙与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(威灵仙Clematis chinensisOsbeck、东北铁线莲Clematis mandshurica Ruprecht或棉团铁线莲Clematis hexapetalaPallas(毛茛科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种中的翅果铁线莲(Clematis brachyura)、火焰色铁线莲(Clematis flammula)、芹叶铁线莲(Clematis aethusifolia)、葡萄叶铁线莲(Clematisvitalba)、银叶铁线莲(Clematis delavayi)、毛蕊铁线莲(Clematis lasiandra)、小木通铁线莲(Clematis armandii)、柱果铁线莲(Clematis uncinata)，则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：083-1F(Ireisen(威灵仙)-ITS-f2)(GGTGAACCTGCGGAAGGATC；SEQ ID NO:227；10pmol/μL)1μL、反向引物：083-1R(Ireisen(威灵仙)-ITS-r2)(GCCGAGATATCCGTTGCCGAG；SEQ ID NO:228；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，52℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的威灵仙和其他近缘种的同源序列进行比对(表23和图21)。
[表23]
使用引物组083-1F&083-1R(SEQ ID NO：227和SEQ ID NO：228)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图21表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出13个位点的鉴别位点。在第16位、第57位、第61位、第62位、第63位、第66位、第74位、第95位、第140位、第147位、第156位、第175位、第178位，不能通过各自位点来区别威灵仙Clematis chinensis Osbeck、东北铁线莲Clematis mandshurica Ruprecht或棉团铁线莲Clematis hexapetala Pallas(毛茛科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例17：茵陈蒿的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，茵陈蒿的基原植物为茵陈蒿Artemisiacapillaris Thunberg(菊科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种艾蒿(Artemisiaargyi)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对茵陈蒿及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中petD-rpoA区域的序列中，茵陈蒿在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别茵陈蒿与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对茵陈蒿与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于茵陈蒿与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(茵陈蒿Artemisia capillarisThunberg(菊科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于叶绿体DNA中的petD-rpoA区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：085-3F(petD-rpoA-FN)(GGGTATTGGTGCAACATTAC；引用自Nishizawa&Watano 2000，修改了一个碱基；SEQ ID NO:241；10pmol/μL)1μL、反向引物：085-3R(petD-rpoA-R)(CAGCCAAGAAGATCTTATGA；引用自Nishizawa&Watano 2000；SEQ ID NO:242；10pmol/μL)1μL、模板DNA1μL。
＊Nishizawa&Watano 2000
Nishizawa T.和Watano Y.2000.Primer Pairs Suitable for PCR-SSCPAnalysis of Chloroplast DNA in Angiosperms.Journal of Phytogeography andTaxonomy 48:67-70。
(PCR循环条件1)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×1min，45℃×1min，72℃×2min)×45个循环、72℃×7min。
(PCR反应液2)用于叶绿体DNA中的petD-rpoA区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：085-4F(＝085-3F)(petD-rpoA-FN)(GGGTATTGGTGCAACATTAC；引用自Nishizawa&Watano2000，修改了一个碱基；SEQ ID NO:243；10pmol/μL)1μL、反向引物：085-4R(085-T1R)(GGAATCGGCATAGATTCATAATTTA；SEQ ID NO:244；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
或者，蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：085-4F(＝085-3F)(petD-rpoA-FN)(GGGTATTGGTGCAACATTAC；引用自Nishizawa&Watano 2000，修改了一个碱基；SEQ ID NO:243；10pmol/μL)1μL、反向引物：085-4R(085-T1R)(GGAATCGGCATAGATTCATAATTTA；SEQ ID NO:244；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件2)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×1min，45℃×1min，72℃×2min)×45个循环、72℃×7min。
或者，将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，48℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的茵陈蒿和其他近缘种的同源序列进行比对(表24和表25，以及图22和图23)。
[表24]
使用引物组085-3F&085-3R(SEQ ID NO：241和SEQ ID NO：242)扩增并确定的叶绿体DNA中的DetD-rpoA区域碱基序列
[表25]
使用引物组085-4F&085-4R(SEQ ID NO：243和SEQ ID NO：244)扩增并确定的叶绿体DNA中的petD-rpoA区域碱基序列
3.结果
反应液1和2的区别在于扩增片段长度不同，一般而言，长度越短，扩增成功率越高，但得到的鉴别位点的数量越少，难以用自动测序仪确定序列。本方法是在反应液1中尝试确定序列，当失败时则在反应液2中进行，通过设置这种二阶段的试验，可以降低成本和应对样品的DNA质量的差异。
图22表示通过在反应液1中确定序列而获得的叶绿体DNA中的petD-rpoA区域，显示出4个位点的鉴别位点。首先，在第118位为G的只有茵陈蒿Artemisia capillarisThunberg(菊科)，样品与茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)一致。在第87位、第224位、第230位，不能通过各自位点来区别茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)和其他近缘种，必要条件是评价第118位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计4个位点。
能够利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则根据上述图22的信息，满足用于区别符合的品种与其他近缘种的必要条件。
不能利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则可以通过利用PCR反应液2进行扩增和确定序列，来区别符合的品种与其他近缘种。
图23表示通过在反应液2中确定序列而获得的叶绿体DNA中的petD-rpoA区域，显示出2个位点的鉴别位点。首先，在第118位为G的只有茵陈蒿Artemisia capillarisThunberg(菊科)，样品与茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)一致。只在第87位不能区别茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别茵陈蒿Artemisia capillaris Thunberg(菊科)和其他近缘种，必要条件是评价第118位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计2个位点。
<实施例18：地骨皮的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，地骨皮的基原植物为枸杞Lyciumchinense Miller或宁夏枸杞Lycium barbarum Linne(茄科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种黑果枸杞(Lycium ruthenicum)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对地骨皮及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中trnH-psbA基因间部分区域的序列中，地骨皮在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别地骨皮与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对地骨皮与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于地骨皮与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(枸杞Lycium chinense Miller或宁夏枸杞Lycium barbarum Linne(茄科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)PlantMini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于叶绿体DNA中的trnH-psbA基因间部分区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：092-2F(f)(ACTGCCTTGATCCACTTGGC；引用自Taberlet et al.1991.；SEQ ID NO:261；10pmol/μL)1μL、反向引物：092-2R(092-T2R)(ASAAGGAGAGRGTATTTGCCTGC；SEQ ID NO:262；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
＊trnL intron,trnL-F intergenic(a,b,c,d,e,f)
Taberlet等人1991.
Taberlet P.,Gielly L.,Pautou G.和Bouvet J.1991.Universal Primers ForAmplification Of 3Noncoding Regions Of Chloroplast Dna.Plant Mo.Biol.17:1105-1109。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，52℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的地骨皮和其他近缘种的同源序列进行比对(表26和图24)。
[表26]
使用引物组092-2F&092-2R(SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：262)扩增并确定的叶绿体DNA中的trnH-psbA基因间部分区域碱基序列
3.结果
图24表示获得的叶绿体DNA中的trnH-psbA基因间部分区域，显示出6个位点的鉴别位点。在第25至33位、第45位、第133位、第201位、第206位、第226位，不能通过各自位点来区别枸杞Lycium chinense Miller或宁夏枸杞Lycium barbarum Linne(茄科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例19：砂仁的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，砂仁的基原植物为绿壳砂Amomumxanthioides Wallich(姜科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对砂仁及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，砂仁在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别砂仁与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对砂仁与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于砂仁与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(绿壳砂Amomum xanthioidesWallich(姜科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种中的细砂仁(Amomum microcarpum)、Amomum ghaticum、Amomumschmidtii、方片砂仁(Amomum quadratolaminare)、香豆蔻(Amomum aromaticum)，则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：103-1F(Amomum(绿壳砂)-ITS2-F1)(GCAGAATCTCGTGAACCATTG；SEQ ID NO:275；10pmol/μL)1μL、反向引物：103-1R(Amomum(绿壳砂)-ITS2-R1)(TGACTTGGGGCCACAATCCG；SEQ IDNO:276；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
或者，蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：103-1F(Amomum(绿壳砂)-ITS2-F1)(GCAGAATCTCGTGAACCATTG；SEQ ID NO:275；10pmol/μL)1μL、反向引物：103-1R(Amomum(绿壳砂)-ITS2-R1)(TGACTTGGGGCCACAATCCG；SEQ ID NO:276；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，52℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的砂仁和其他近缘种的同源序列进行比对(表27和图25)。
[表27]
使用引物组103-1F&103-1R(SEQ ID NO：275和SEQ ID NO：276)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图25表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出6个位点的鉴别位点。首先，在第236位为T(胸腺嘧啶)的只有绿壳砂(Amomum xanthioides Wallich)，样品与其一致。在第92位、第104位、第154位、第242位、第262位，不能通过各自位点来区别绿壳砂(Amomumxanthioides Wallich)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别绿壳砂(Amomum xanthioides Wallich)和其他近缘种，必要条件是评价第236位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
<实施例20：忍冬藤的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，忍冬藤的基原植物为忍冬Lonicerajaponica Thunberg(忍冬科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种毛花柱忍冬(Lonicera dasystyla)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对忍冬藤及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中psbA-trnH区域的序列中，忍冬藤在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别忍冬藤与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对忍冬藤与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于忍冬藤与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(忍冬Lonicera japonicaThunberg(忍冬科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于叶绿体DNA中的psbA-trnH区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：127-1F(Nindou(忍冬藤)-psbA-trnH-f2)(CAAGAGGGCACCATTGCTTC；SEQ ID NO:284；10pmol/μL)1μL、反向引物：127-1R(Nindou(忍冬藤)-psbA-trnH-r2)(GTACAATTATAGATAAGTCAGC；SEQ ID NO:285；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的忍冬藤和其他近缘种的同源序列进行比对(表28和图26)。
[表28]
使用引物组127-1F&127-1R(SEQ ID NO：284和SEQ ID NO：285)扩增并确定的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域碱基序列
3.结果
图26表示获得的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域，显示出12个位点的鉴别位点。首先，在第90位为A，在第109位为G的只有忍冬Lonicera japonica Thunberg(忍冬科)，样品与忍冬Lonicera japonica Thunberg(忍冬科)一致。在第34位、第55位、第71位、第76位、第82位、第94位、第118位、第130位、第138位、第165位，不能通过各自位点来区别忍冬Lonicera japonica Thunberg(忍冬科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别忍冬Lonicera japonica Thunberg(忍冬科)和其他近缘种，必要条件是评价第90位或者第109位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计12个位点。
<实施例21：川骨的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，川骨的基原植物为日本萍蓬草Nupharjaponicum De Candolle(睡莲科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种台湾萍蓬草(Nuphar shimadai)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对川骨及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，川骨在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别川骨与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对川骨与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于川骨与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(日本萍蓬草Nuphar japonicum DeCandolle(睡莲科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：131-1F(131-T2F)(CCCTTCACTTGTGTTGGAGAATG；SEQ ID NO:298；10pmol/μL)1μL、反向引物：131-1R(131-T1R)(AGTTCCTTGACGCATGCAGCGCC；SEQ ID NO:299；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的川骨和其他近缘种的同源序列进行比对(表29和图27)。
[表29]
使用引物组131-1F&131-1R(SEQ ID NO：298和SEQ ID NO：299)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图27表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出12个位点的鉴别位点。首先，在第34位为C的只有日本萍蓬草Nuphar japonicum De Candolle(睡莲科)，样品与日本萍蓬草Nuphar japonicum De Candolle(睡莲科)一致。在第3位、第8位、第30位、第40位、第48位、第75位、第101位、第102位、第107位、第113位、第116位，不能通过各自位点来区别日本萍蓬草Nuphar japonicum De Candolle(睡莲科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别日本萍蓬草Nuphar japonicum De Candolle(睡莲科)和其他近缘种，必要条件是评价第34位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计12个位点。
<实施例22：桑白皮的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，桑白皮的基原植物为桑Morus alba Linne(桑科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种川桑(Morus notabilis)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对桑白皮及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，桑白皮在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别桑白皮与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对桑白皮与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于桑白皮与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(桑Morus alba Linne(桑科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：132-1F(132-T1F)(TGAACCTGCGGAAGGATCATTGTC；SEQ ID NO:312；10pmol/μL)1μL、反向引物：132-1R(132-T1R)(GTTATGATTCCTTGACGCGTTCCG；SEQ ID NO:313；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
或者，蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：132-1F(132-T1F)(TGAACCTGCGGAAGGATCATTGTC；SEQ ID NO:312；10pmol/μL)1μL、反向引物：132-1R(132-T1R)(GTTATGATTCCTTGACGCGTTCCG；SEQ ID NO:313；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
或者，将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，55℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的桑白皮和其他近缘种的同源序列进行比对(表30和图28)。
[表30]
使用引物组132-1F&132-1R(SEQ ID NO：312和SEQ ID NO：313)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图28表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出22个位点的鉴别位点。在第25位、第46位、第51位、第55位至第67位、第79位、第85位、第96位、第102位、第116位、第132位，不能通过各自位点来区别桑Morus alba Linne(桑科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。样品与桑Morus alba Linne(桑科)一致。
<实施例23：羌活的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，羌活的基原植物为羌活Notopterygiumincisum Ting ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium forbesii Boissieu(伞形科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种少裂凹乳芹(Vicatia bipinnata)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对羌活及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，羌活在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别羌活与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对羌活与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于羌活与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium forbesii Boissieu(伞形科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：136-1F(Kyoukatsu(羌活)-ITS1-f2)(GCRATAGCAGAATGACCCGC；SEQ ID NO:324；10pmol/μL)1μL、反向引物：136-1R(Kyoukatsu(羌活)-ITS1-r1)(GATATCCGTTGCCGAGAGTCG；SEQ ID NO:325；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，50℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的羌活和其他近缘种的同源序列进行比对(表31和图29)。
[表31]
使用引物组136-1F&136-1R(SEQ ID NO：324和SEQ ID NO：325)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图29表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出20个位点的鉴别位点。在第6位、第17位、第25位、第34位、第38位、第45位、第50位、第53位、第59位、第64位、第68位、第71位、第87位、第90位、第95位、第125位、第151位、第156位、第175位、第179位，不能通过各自位点来区别羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygiumforbesii Boissieu(即Hansenia forbesii)(伞形科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
<实施例24：枇杷叶的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，枇杷叶的基原植物为枇杷Eriobotryajaponica Lindley(蔷薇科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种栎叶枇杷(Eriobotryaprinoides)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对枇杷叶及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，枇杷叶在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别枇杷叶与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对枇杷叶与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于枇杷叶与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(枇杷Eriobotrya japonicaLindley(蔷薇科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液1)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：142-1F(Biwayo(枇杷叶)-ITS2-f1)(CTTTGAACGCAAGTTGCGCCC；SEQ ID NO:332；10pmol/μL)1μL、反向引物：142-1R(ITS2)＊(GCTGCGTTCTTCATCGATGC；SEQ ID NO:333；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
＊ITS2
White等人1990.
White T.J.,Bruns T.,Lee S.和Taylor J.1990.Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:Innis M.A.,Gelfand D.H.,Sninsky J.J.and White T.J.(编),PCR Protocols:a Guide to Methodsand Applications.pp.315-322.Academic Press,New York。
(PCR反应液2)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)17.02μL、10×gene Taq Buffer(NIPPON GENE公司)2.80μL、dNTPMix(NIPPON GENE公司)2.24μL、DMSO 2.80μL、gene Taq(NIPPON GENE公司)0.14μL、正向引物：142-2F(Biwayo(枇杷叶)-ITS2-f1)(CTTTGAACGCAAGTTGCGCCC；SEQ ID NO:334；10pmol/μL)1μL、反向引物：142-2R(Biwayo(枇杷叶)-ITS2-r)(CTCGGCATTTGGGCCAACCG；SEQ ID NO:335；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，在步降法(Stepdown法)※的条件下，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪进行反应。
※步降法与实施例1的PCR循环条件2相同。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液1和PCR反应液2的每一种中的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的枇杷叶和其他近缘种的同源序列进行比对(表32和表33，以及图30和图31)。
[表32]
使用引物组142-1F&142-1R(SEQ ID NO：332和SEQ ID NO：333)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
[表33]
使用引物组142-2F&142-2R(SEQ ID NO：334和SEQ ID NO：335)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
反应液1和2的区别在于扩增片段长度不同，一般而言，长度越短，扩增成功率越高，但得到的鉴别位点的数量越少，难以用自动测序仪确定序列。本方法是在反应液1中尝试确定序列，当失败时则在反应液2中进行，通过设置这种二阶段的试验，可以降低成本和应对样品的DNA质量的差异。
图30表示通过在反应液1中确定序列而获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出20个位点的鉴别位点。首先，在第9位为T，在第47位为C，在第51位为A，在第108位为C，在第111位为T，在第199位为A，或者在第200位为G的只有枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)，样品与枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)一致。在第38位、第43位、第60位、第61位、第73位、第117位、第136位、第161位、第175位、第186位、第218位、第233位、第241位，不能通过各自位点来区别枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)和其他近缘种，必要条件是评价第9位、第47位、第51位、第108位、第111位、第199位或者第200位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计20个位点。
能够利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则根据上述图30的信息，满足用于区别符合的品种与其他近缘种的必要条件。
不能利用PCR反应液1进行扩增和确定序列时，则可以通过利用PCR反应液2进行扩增和确定序列，来区别符合的品种与其他近缘种。
图31表示通过在反应液2中确定序列而获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出10个位点的鉴别位点。首先，在第9位为T，在第47位为C，在第51位为A，在第108位为C，或者在第111位为T的只有枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)，样品与枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)一致。在第38位、第43位、第60位、第61位、第73位，不能通过各自位点来区别枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别枇杷Eriobotrya japonica Lindley(蔷薇科)和其他近缘种，必要条件是评价第9位、第47位、第51位、第108位或者第111位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计10个位点。
<实施例25：硬紫草的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，硬紫草的基原植物为紫草Lithospermumerythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科)。但是，市场中有可能会流通其他近缘种小花紫草(Lithospermum officinale)等，为了保证药物的质量，关键在于避免误用和混用它们。
因此，本发明人对硬紫草及其近缘植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在核内核糖体DNA中ITS区域的序列中，硬紫草在该区域中具有固定的序列，能够与其他近缘种区别开。因此，该区域对于区别硬紫草与其他近缘种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对硬紫草与其他近缘种的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于硬紫草与其他近缘种，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(紫草Lithospermumerythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于核内核糖体DNA中的ITS区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：144-1F(Shikon(硬紫草)-ITS1-f2)(CCTGCATAGCAGAACCACTC；SEQ ID NO:360；10pmol/μL)1μL、反向引物：144-1R(Shikon(硬紫草)-ITS1-r1)(CATCTCCAAGCCTCTGTGCC；SEQ ID NO:361；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，50℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的硬紫草和其他近缘种的同源序列进行比对(表34和图32)。
[表34]
使用引物组144-1F&144-1R(SEQ ID NO：360和SEQ ID NO：361)扩增并确定的核内核糖体DNA中的ITS区域碱基序列
3.结果
图32表示获得的核内核糖体DNA中的ITS区域，显示出10个位点的鉴别位点。首先，在第2位为C，在第49位为G，在第98位为A，在第148位为C的只有紫草Lithospermumerythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科)，样品与紫草Lithospermumerythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科)一致。在第8位、第15位、第31位、第61位、第84位、第116位，不能通过各自位点来区别紫草Lithospermum erythrorhizon Sieboldet Zuccarini(紫草科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别紫草Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini(紫草科)和其他近缘种，必要条件是评价第2位、第49位、第98位、第148位中的任一位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计10个位点。
<实施例26：杜仲的鉴别方法>
1.绪论
在第十七修订版的日本药局方中规定，杜仲的基原植物为杜仲Eucommiaulmoides Oliver(杜仲科)。但是，市场中虽然没有流通其他近缘种，但有可能会流通外观相似的生药等，为了保证药物的质量，关键在于通过确认基原来避免误用和混用类似物。
因此，本发明人对杜仲与较为近缘的其他品种植物的基因组DNA或叶绿体DNA进行了全面研究。结果表明，在叶绿体DNA中psbA-trnH区域的序列中，杜仲在该区域中具有固定的序列，能够与其他品种区别开。因此，该区域对于区别杜仲与其他品种是有用的DNA标记。
但是，由于以下原因，往往难以从生药中确定序列：1)随时间变化和加工等导致DNA受损和片段化；2)混入有来自菌类的DNA。
因此，比对杜仲与较为近缘的其他品种植物的序列信息，设计引物以能够对该序列信息进行PCR扩增且包含鉴别位点，并设定最佳扩增条件，由此能够稳定地从以往难以确定序列的样品中获取序列信息。
本实施例中对于杜仲与较为近缘的其他品种植物，以能够对由各种样品中对可以区别种间的DNA区域进行PCR扩增并确定序列的引物组为中心，示出得到的序列中的鉴别位点。
2.方法
2-1.核酸提取方法
模板DNA是采集生药或生药加工前的基原植物(杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科))的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
关于其他近缘种则从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)获得同源序列。
2-2.核酸扩增方法
使用提取的模板DNA，通过PCR对特定核酸区域进行扩增。核酸扩增反应条件如下所示。
(PCR反应液)用于叶绿体DNA中的psbA-trnH区域扩增
蒸馏水(D.W.)19.02μL、10×EX Taq Buffer(Takara Bio Inc.)2.80μL、dNTP Mix(Takara Bio Inc.)2.24μL、EX Taq(Takara Bio Inc.)0.14μL、正向引物：147-1F(Tochuu(杜仲)-psbA-trnH-f3N)(CTCAAGAGGTGGGTATTGCTCC；SEQ ID NO:374；10pmol/μL)1μL、反向引物：147-1R(Tochuu(杜仲)-psbA-trnH-r2N)(GATCCACTTGGCTACATCCGCC；SEQ ID NO:375；10pmol/μL)1μL、模板DNA 1μL。
(PCR循环条件)
将反应液放入0.2ml微管中，利用GeneAmp9700(赛默飞世尔科技公司)等热循环仪并按照以下条件进行反应：95℃×5min、(95℃×30sec，50℃×30sec，72℃×1min)×35个循环、72℃×7min。
2-3.通过凝胶电泳确认扩增产物与提取凝胶
与实施例1同样地通过凝胶电泳确认扩增产物和提取凝胶。
2-4.确定扩增产物的碱基序列
与实施例1同样地确定扩增产物的碱基序列。
之后，将PCR反应液的各扩增产物的正向序列和反向序列进行比对，确定可靠性高的序列。
利用BioEdit v7.2.5for Windows(Tom Hall 2013)，将获得的序列与作为标准的杜仲和其他近缘种的同源序列进行比对(表35和图33)。
[表35]
使用引物组147-1F&147-1R(SEQ ID NO：374和SEQ ID NO：375)扩增并确定的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域碱基序列
3.结果
图33表示获得的叶绿体DNA中的psbA-trnH区域，显示出6个位点的鉴别位点。首先，在第91位为T，在第95位为G，在第98位为A，或者在第100位发生缺失的只有杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科)，样品与杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科)一致。在第105位、第109位，不能通过各自位点来区别杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科)和其他近缘种，但可以通过多于一个位点的组合来区别。
为了区别杜仲Eucommia ulmoides Oliver(杜仲科)和其他近缘种，必要条件是评价第91位、第95位、第98位或者第100位，而如果要进行更高精度的鉴别，则要求评价上述共计6个位点。
<实施例27：用于鉴别生药的引物组的质量特异性的确认>
1.目的
确认使用用于鉴别生药的引物组，只有生药和近缘植物来源的生药得到扩增，而远缘植物来源的生药不被扩增。
2.材料
将本实施例中的生药(正品)、近缘种和远缘种示于以下的表36。
[表36]
3.方法
3-1.DNA提取
采集对象生药(正品)、近缘种和远缘种的一部分，使用市售的DNeasy(注册商标)Plant Mini Kit(QIAGEN公司)，按照附带的操作流程进行提取。
3-2.PCR扩增
将PCR扩增中使用的用于鉴别生药的引物组、反应液组成、PCR循环条件以及热循环仪示于以下的表37。另外，表37中表示扩增产物的相关凝胶电泳条件，以及凝胶成像条件。
[表37]
4.结果
作为PCR扩增的结果，将扩增产物的相关凝胶电泳照片示于图37。图37也示出了与样品同时进行电泳的100bp Ladder。当Ladder与样品之间有不需要的泳道时，将该泳道删除，这种情况下，在Ladder与样品之间加入边界线。
5.结论
关于本实施例所实施的28个品种的生药，通过各种用于鉴别的引物组，确认到只有生药和近缘植物来源的生药得到扩增，而远缘植物来源的生药不被扩增。
序列表
<110> 株式会社津村
<120> 用于鉴别生药的引物组以及使用该引物组的生药鉴别方法
<130> P19-0820
<150> JP 2018-244601
<151> 2018-12-27
<160> 429
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
gagcgtcgcg gaaccctcaa c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
caatccggtc cgggctaatg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctcaactccg tccgcctttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
caatccggtc cgggctaatg 20
<210> 5
<211> 112
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 5
tccgtccgcc tttgttgggg cgggctcgga gcttggaatt ggaggccctt tgccgcgcct 60
ttcccttcta cgatccgtag accgggggtg gccgcgcggc tcctcccaaa cg 112
<210> 6
<211> 112
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 6
tccgtccgcc tttgttgggg cgggctcgga gcttggaatt ggaggccctt tgccgcgcct 60
ttcccttcta cgatccgtag accgggggtg gccgcgcggc tcctcccaaa cg 112
<210> 7
<211> 112
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 7
tccgtccgcc tttgttgggg cgggcttgga gattggaatt ggaggccctt tgccgcgcct 60
ttcccttcta cgatccgtag acggggggcg gccgcgcggc tcctcccaaa cg 112
<210> 8
<211> 111
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 8
tccgtccgcc tttgttgggg cgggcttgga gattggaatt ggaggccctt tgccgcgcct 60
ttcccttcta cgatccgtag acgggggcgg ccgcgcggct cctcccaaac g 111
<210> 9
<211> 108
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 9
tccgtccgcc tttgttggcc gggcttggag attggaattg gaggcccttt gccgtgcttt 60
tcccttctac gatccgtaga tgggcggccg cgcggctcct cccaaacg 108
<210> 10
<211> 108
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 10
tccgtccgcc tttgttggcc gggcttggag attggaattg gaggcccttt gccgtgcttt 60
tcccttctac gatccgtaga tgggcggccg cgcggctcct cccaaacg 108
<210> 11
<211> 98
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 11
ttggggcggg ctcggagctt ggaattggag gccctttgcc gcgcctttcc cttctacgat 60
ccgtagaccg ggggtggccg cgcggctcct cccaaacg 98
<210> 12
<211> 98
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 12
ttggggcggg ctcggagctt ggaattggag gccctttgcc gcgcctttcc cttctacgat 60
ccgtagaccg ggggtggccg cgcggctcct cccaaacg 98
<210> 13
<211> 98
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 13
ttggggcggg cttggagatt ggaattggag gccctttgcc gcgcctttcc cttctacgat 60
ccgtagacgg ggggcggccg cgcggctcct cccaaacg 98
<210> 14
<211> 97
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 14
ttggggcggg cttggagatt ggaattggag gccctttgcc gcgcctttcc cttctacgat 60
ccgtagacgg gggcggccgc gcggctcctc ccaaacg 97
<210> 15
<211> 94
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 15
ttggccgggc ttggagattg gaattggagg ccctttgccg tgcttttccc ttctacgatc 60
cgtagatggg cggccgcgcg gctcctccca aacg 94
<210> 16
<211> 94
<212> DNA
<213> 茯苓(Wolfiporia cocos)
<400> 16
ttggccgggc ttggagattg gaattggagg ccctttgccg tgcttttccc ttctacgatc 60
cgtagatggg cggccgcgcg gctcctccca aacg 94
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
caacctctcg ccgcgttccc 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cgagagacat cctttccccc c 21
<210> 19
<211> 117
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)
<400> 19
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactcaaaga agcatccgcc ttccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 20
<211> 117
<212> DNA
<213> 赤野地黄(Rehmannia glutinosa var. purpurea)
<400> 20
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactcaaaga agcatccgcc ttccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 21
<211> 117
<212> DNA
<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)或赤野地黄(Rehmannia glutinosa var.purpurea)
<400> 21
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactcaaaga agcatccgcc ttccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 22
<211> 117
<212> DNA
<213> 天目地黄(Rehmannia chingii)
<400> 22
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactcaaaga agcatccgcc tcccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 23
<211> 117
<212> DNA
<213> 茄叶地黄(Rehmannia solanifolia)
<400> 23
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactaaaaga agcatccgcc ttccattgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 24
<211> 117
<212> DNA
<213> 裂叶地黄(Rehmannia piasezkii)
<400> 24
ttcctgccgg cgtgcatgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aactcaaaga agcatccgcc ttccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 25
<211> 117
<212> DNA
<213> 湖北地黄(Rehmannia henryii)
<400> 25
ttcctgctgg cgtgcacgtg agtgctcgtc gtgcgggcta acgaaccccg gcgcggcatg 60
cgccaaggaa aacttaaaga agcatccgcc tcccatcgcc ccgtccgcgg tgcgcga 117
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
acasaggccc cgggaggccg rcg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
ttcagcgggt ggtcccgcct gac 23
<210> 28
<211> 131
<212> DNA
<213> 延胡索(Corydalis yanhusuo)
<400> 28
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg ccctcgaaac cggatcccgt gcacgccgcg 60
ccgcgaaacc cggagggcca cagcgacccc ccagggctgt ccttgcaccg caaggacggc 120
gcccactctg c 131
<210> 29
<211> 139
<212> DNA
<213> 延胡索(Corydalis yanhusuo)
<400> 29
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg ccctcgaaac cggatcccgt gcacgccgcg 60
ccgcgaaacc cggagggcca cagcgacccc ccagggctgt ccttgcaccg caaggacggc 120
gcccactctg cgaccccag 139
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 金球黄堇(Corydalis boweri)
<400> 30
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg cacgtcggat cgagtgcacg ccgcgcccca 60
cccagggcca ctgcgacccc caagggccgt ccccggacgg cgcccactct gcgaccccag 120
<210> 31
<211> 94
<212> DNA
<213> 石生黄堇(Corydalis saxicola)
<400> 31
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg ccctagaaac cggatcacgt gcacgccgcg 60
ccgctccccg ggaggccaca gcgaccccca aggg 94
<210> 32
<211> 118
<212> DNA
<213> 川鄂黄堇(Corydalis wilsonii)
<400> 32
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacgcg ccctaaaaac cggatcacgt gcatgtcgcg 60
ccgctccccg ggaggccaca gcgaccccca agggccgtcc caggacggca cccactct 118
<210> 33
<211> 110
<212> DNA
<213> 灰绿黄堇(Corydalis adunca)
<400> 33
tcacgatccg tggtggctgt aaaggacaaa ccggatcacg tgcacgccgc gctgaatccc 60
cagggccaca gcgaccccaa cagggccgtc ccccggacgg cgcccactct 110
<210> 34
<211> 127
<212> DNA
<213> 东北延胡索(Corydalis ambigua)
<400> 34
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg ccctcgaaac cggatcccgt gcacgccgcg 60
catctcccag ggtccacagc gaccccccta gggccgtcct cggacggcgc ccactctgcg 120
accccag 127
<210> 35
<211> 115
<212> DNA
<213> 阿山黄堇(Corydalis nobilis)
<400> 35
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg ccctagaaac cggatcccgt gcacgccgcg 60
ccgcaccccg ggccacagcg acccccgagg gccgtccccg gacggtaccc actct 115
<210> 36
<211> 106
<212> DNA
<213> 钩距黄堇(Corydalis hamata)
<400> 36
tcacgatccg tggtggttgt aaaagacacg catgtcggat cacgtggacg ccgcacaccg 60
ggccaccgcg accccccgag ggccgtcccc ggacggcacc cactct 106
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
cggaaggatc attgtcgatg c 21
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
gtgtttgttg gggaaggagg 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
gaacgcaagt tgcgcccgaa g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
cgaactcgat tttcaaccaa c 21
<210> 41
<211> 158
<212> DNA
<213> 野葛(Pueraria montana var. lobata)
<400> 41
ctcacaatca gaccgaccgg cgaattcgtt tttccatcta ccagcaggca ggcaggggac 60
gggcctcttc cgtcctcccc ctgctctgcc tgttgcgttg ggtcgggggg gagggagggg 120
ggacgcaaag cactgttgtt ctgcgcccga cctctcct 158
<210> 42
<211> 158
<212> DNA
<213> 野葛(Pueraria montana var. lobata)
<400> 42
ctcacaatca gaccgaccgg cgaattcgtt tttccatcta ccagcaggca ggcaggggac 60
gggcctcttc cgtcctcccc ctgctctgcc tgttgcgttg ggtcgggggg gagggagggg 120
ggacgcaaag cactgttgtt ctgcgcccga cctctcct 158
<210> 43
<211> 158
<212> DNA
<213> 粉葛(Pueraria montana var. thomsonii)
<400> 43
ctcacaatca gaccgaccgg cgaattcgtt tttccatcta ccagcaggca ggcaggggac 60
gggcttcttc cgtcctcccc ctgctctgcc tgttgcgttg ggtcgggggg gagggagggg 120
ggacgcaaag cattgttgtt ctgcgcccaa cctctcct 158
<210> 44
<211> 158
<212> DNA
<213> 泰国野葛(Pueraria candollei var. mirifica)
<400> 44
ctcacaatca gattgacccg cgaattcgtt tttccatcta ccagcaggca agcaggggtc 60
gggccgggct tcttccgtcc gtcctcccct tgctttgcct gttgcgttgg ggcggggggg 120
tggacacaaa gcaagcatcg tcttgcctgg cctcctct 158
<210> 45
<211> 157
<212> DNA
<213> 块茎葛(Pueraria tuberosa)
<400> 45
ctcacatcag attgacccgc gaattcgttt ttccatctac cagcaggcaa gcagggatcg 60
ggccgggctt cttccgcccg tcctcccctt gctttgcctg ttgcgttggg gcgggggggt 120
ggacacaagg caagcgttgt cttgcctggc ctcctct 157
<210> 46
<211> 125
<212> DNA
<213> 野葛(Pueraria montana var. lobata)
<400> 46
ccatttaggc agagggcacg cctgcctggg tgtcacacat cgttacccca acgcaaacag 60
acgtcccaca cgacggccgt tgcgtggtag ggtgcacgct gacctcccgc gagcggcgtc 120
tcgcg 125
<210> 47
<211> 125
<212> DNA
<213> 野葛(Pueraria montana var. lobata)
<400> 47
ccatttaggc agagggcacg cctgcctggg tgtcacacat cgttacccca acgcaaacag 60
acgtcccaca cgacggccgt tgcgtggtag ggtgcacgct gacctcccgc gagcggcgtc 120
tcgcg 125
<210> 48
<211> 126
<212> DNA
<213> 粉葛(Pueraria montana var. thomsonii)
<400> 48
ccatttaggc agagggcacg cctgcctggg tgtcacacat cgttacccca acgcaaacaa 60
acgttcccac acgacggccg ttgcgtagta gggtgcacgc tgacctcccg cgagcggcgt 120
ctcgcg 126
<210> 49
<211> 126
<212> DNA
<213> 泰国野葛(Pueraria candollei var. mirifica)
<400> 49
ccattaggtg gagggcacgc ctgcctgggt gtcacacatc gttaccccca cgcaaacaaa 60
tgtctcacac gacaaacgtt ctgcgtagta gggtgcacgc tgacctcccg cgagcaccgt 120
ctcgcg 126
<210> 50
<211> 126
<212> DNA
<213> 块茎葛(Pueraria tuberosa)
<400> 50
ccattaggtg gagggcacgc ctgcctgggt gtcacacatc gttaccccca cgcaaacaaa 60
tgtctcacac gacagacgtt ctgcgtagta gggtgcacgc tgacctcccg cgagcaccgt 120
ctcgtg 126
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
gtgaacctgc ggaaggatca ttg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
gagatatccg ttgtcgagag tcg 23
<210> 53
<211> 219
<212> DNA
<213> 防风(Saposhnikovia divaricata)
<400> 53
tcgaatcctg caacagcaga atgacccgct aacacgtcaa caatttgggc aagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaacccttg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120
cttcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaaactgaat tgtacgtccg 180
tatcccgtta gcgggcagcg gcgtcattct aaaacacaa 219
<210> 54
<211> 219
<212> DNA
<213> 防风(Saposhnikovia divaricata)
<400> 54
tcgaatcctg caacagcaga atgacccgct aacacgtcaa caatttgggc aagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaacccttg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120
cttcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaaactgaat tgtacgtccg 180
tatcccgtta gcgggcagcg gcgtcattct aaaacacaa 219
<210> 55
<211> 218
<212> DNA
<213> 东当归(Angelica acutiloba)
<400> 55
tcgaatcctg caatagcaaa atgacccgct aacacgttaa caatttgggc gagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actctcgggt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaatacaa 218
<210> 56
<211> 218
<212> DNA
<213> 日本当归(Angelica japonica)
<400> 56
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caatttgggc gagcatcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actcctgggt ggccacaggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccattag tgggcaccgg cgtcattcca aaacataa 218
<210> 57
<211> 218
<212> DNA
<213> Angelica capitellata
<400> 57
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caatttgggc gagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggtcctta aaactgaatt gtacgtctgt 180
atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaa 218
<210> 58
<211> 218
<212> DNA
<213> Lomatium serpentinum
<400> 58
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caatttgggc aagcgtcggg 60
gggcttcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc gctcccgggc ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaa 218
<210> 59
<211> 218
<212> DNA
<213> Cymopterus planosus
<400> 59
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgtcaa caatttgggc aagcgtcggg 60
gggcttcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtgacc actcccgggt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcatcgg cgtctttcca aaacacaa 218
<210> 60
<211> 218
<212> DNA
<213> 珊瑚菜(Glehnia littoralis)
<400> 60
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caattagggc gagcatcggg 60
ggaccttggt ctcctgtttg cgaatccctg gtaggtggcc actcccgtgt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggatctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttaa cgggctccgg cgtctttcca aaacacaa 218
<210> 61
<211> 218
<212> DNA
<213> 朝鲜山芹(Ostericum koreanum)
<400> 61
tcgaaacctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caatttgggc gagcatcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actccagggt ggctactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcatcgg tgtcattcca aaacacaa 218
<210> 62
<211> 218
<212> DNA
<213> Orogenia fusiformis
<400> 62
tcgaatcctg caatagcaga atgacccgct aacacgttaa caatttgggc aagcgtcggg 60
gggcttcggt ctcctgtatg cgaatccatg gtaggtggcc gctcccgggt ggccactggc 120
ctgcgaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaa 218
<210> 63
<211> 218
<212> DNA
<213> Musineon lineare
<400> 63
tcgaaccctg caatagcaga atgacccgct aacacgtcaa caattcgggc aagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggtggcc actcccgggt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtctgt 180
atcccgttag cgggcaccga cgtcattcca aaacacaa 218
<210> 64
<211> 218
<212> DNA
<213> Pteryxia petraea
<400> 64
tcgaaccctg caatagcaga atgacccgct aacacgtcaa caattcgggc aagcgtcggg 60
gggcctcggt ctcctgtctg cgaatccctg gtaggttgcc actcccgggt ggccactggc 120
ctgcaaaatc attcgggcgc ggaatgcgcc aaggacctta aaactgaatt gtacgtccgt 180
atcccgttag cgggcaccgg cgtcattcca aaacacaa 218
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
cctagctgtt gtagaagctc 20
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
ccaattcttt tttattatga g 21
<210> 67
<211> 203
<212> DNA
<213> 远志(Polygala tenuifolia)
<400> 67
ctataaatgg ataagatttt tatcttagtg tatacgagtt cttgaaaata aaggggcaat 60
aaaagatctc ttgttttatc tgtttcatca aatcaagagt tttctattgc tcctttatct 120
ttcctttcta ttctatatta gaattaaaaa agggtccttc ttttttcttt ttattttaga 180
atctaagaag aataacttag att 203
<210> 68
<211> 206
<212> DNA
<213> 远志(Polygala tenuifolia)
<400> 68
catctataaa tggataagat ttttatctta gtgtatacga gttcttgaaa ataaaggggc 60
aataaaagat ctcttgtttt atctgtttca tcaaatcaag agttttctat tgctccttta 120
tctttccttt ctattctata ttagaattaa aaaagggtcc ttcttttttc tttttatttt 180
agaatctaag aagaataact tagatt 206
<210> 69
<211> 225
<212> DNA
<213> 西伯利亚远志(Polygala sibirica)
<400> 69
catctataaa tggataagat ttatatctta gtgtatacga gttcttgaaa ataaaggggc 60
aataaaagat ctcttgtttt atttgtttca tcaaatcaag agttttctat tgctccttta 120
tctttccttt ctattctata ttagaattaa aaaaggggtc cttctttttt ctttttattt 180
tagaatcgaa ttttatttga gaatctatga agaataactt agatt 225
<210> 70
<211> 225
<212> DNA
<213> 瓜子金(Polygala japonica)
<400> 70
catctataaa tggataagat ttttatctta gtgtatacga gttcttgaaa ataaaggggc 60
aataaaagat ctcttgtttt atctgtttca tcaaatcaag agttttctat tgctccttta 120
tctttccttt ctattctata tttgaattaa aaaaggggtc cttctttttt ctttttattt 180
tagaatcgaa ttttatttta gaatctatga agaataactt agatt 225
<210> 71
<211> 209
<212> DNA
<213> Polygala sphenoptera
<400> 71
catctataaa tggataagat tttggtctta gtgtatacga gtttttgaaa atgaaggggc 60
aataaaaaat ctcttgtttt atctgtttca tcaaatcaag agttttctat tgctcctttt 120
tttttacttt ctattctata ttataataaa aaaaggggtc cttctttttt tatttttttt 180
ttcttagaat ctaagaagaa taacttaga 209
<210> 72
<211> 210
<212> DNA
<213> 远志属(Polygala sp.)
<400> 72
catctataaa tggataagat tttggtctta gtgtatacga gtttttgaaa atgaaggggc 60
aataaaaaat ctcttgtttt atctgtttca tcaaatcaag agttttctat tgctcctttt 120
ttttttactt tctattctat attataataa aaaaaggggt ccttcttttt ttattttttt 180
tttcttagaa tctaagaaga ataacttaga 210
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
gcatcgatga agaacgcagc 20
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gattgagatg ttcaaccacc ac 22
<210> 75
<211> 231
<212> DNA
<213> 薄荷(Mentha arvensis var. piperascens)
<400> 75
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccaytag gccgagggca cgyctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccayccc cgcgcgcaym gccgggcrgt tgggggcgga saytggcctc ccgtgcgcct 180
cggygygcgg ccggcccaaa tgmgatcccc gggcgactgg cgtcrcgaca a 231
<210> 76
<211> 231
<212> DNA
<213> 薄荷(Mentha arvensis var. piperascens)
<400> 76
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccaytag gccgagggca cgyctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccayccc cgcgcgcaym gccgggcrgt tgggggcgga saytggcctc ccgtgcgcct 180
cggygygcgg ccggcccaaa tgmgatcccc gggcgactgg cgtcrcgaca a 231
<210> 77
<211> 231
<212> DNA
<213> 水薄荷(Mentha aquatica)
<400> 77
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gccgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcgcaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcctc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcgactgg cgtcacgaca a 231
<210> 78
<211> 231
<212> DNA
<213> 留兰香(Mentha spicata)
<400> 78
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcacaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcctc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcgactgg cgtcacgaca a 231
<210> 79
<211> 231
<212> DNA
<213> Mentha spicata subsp. condensata
<400> 79
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcacaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcctc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcgactgg cgtcacgaca a 231
<210> 80
<211> 231
<212> DNA
<213> 加拿大薄荷(Mentha canadensis)
<400> 80
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcacaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcctc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcgactgg cgtcacgaca a 231
<210> 81
<211> 230
<212> DNA
<213> 苹果薄荷(Mentha suaveolenss)
<400> 81
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcacaca gccgggcggt tgggggcgag attggcctcc cgtgcgcctc 180
ggtgcgcggc cggcccaaat gcgatccccg ggcgactggc gtcacgacaa 230
<210> 82
<211> 231
<212> DNA
<213> 荷兰薄荷(Mentha x villosa)
<400> 82
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccactag gctgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcacaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcctc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcgactgg cgtcacgaca a 231
<210> 83
<211> 231
<212> DNA
<213> 胡椒薄荷(Mentha x piperita)
<400> 83
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccattag gccgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
cccccatccc cgcgcgcaca gccgggcggt tgggggcgga gattggcccc ccgtgcgcct 180
cggtgcgcgg ccggcccaaa tgcgatcccc gggcggctgg cgtcacgaca a 231
<210> 84
<211> 230
<212> DNA
<213> 欧薄荷(Mentha longifolia)
<400> 84
gaaatgcgat acttggtgtg aattgcagaa tcccgtgaac catcgagtct ttgaacgcaa 60
gttgcgcccg aagccattag gccgagggca cgcctgcctg ggcgtcacgc atcgcgtcgc 120
ccccatcccc gcgcgcacag ccgggcggtt gggggcggag attggccccc cgtgcgcctc 180
ggtgcgcggc cggcccaaat gcgatccccg ggcggctggc gtcacgacaa 230
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
gcgtaggatt taaagctggt g 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
attgtcttct cccggaacag g 21
<210> 87
<211> 215
<212> DNA
<213> 草麻黄(Ephedra sinica)
<400> 87
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaagaac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccggc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 88
<211> 215
<212> DNA
<213> 中麻黄(Ephedra intermedia)
<400> 88
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaagaac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 89
<211> 215
<212> DNA
<213> 木贼麻黄(Ephedra equisetina)
<400> 89
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaagaac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacctg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 90
<211> 215
<212> DNA
<213> 草麻黄(Ephedra sinica)或中麻黄(Ephedra intermedia)或木贼麻黄(Ephedra equisetina)
<400> 90
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaagaac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccggc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 91
<211> 215
<212> DNA
<213> Ephedra frustillata
<400> 91
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 92
<211> 215
<212> DNA
<213> Ephedra breana
<400> 92
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgctatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 93
<211> 215
<212> DNA
<213> 岩生麻黄（Ephedra rupestris）
<400> 93
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 94
<211> 215
<212> DNA
<213> 内华达麻黄（Ephedra nevadensis）
<400> 94
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 95
<211> 215
<212> DNA
<213> 三叉麻黄（Ephedra trifurca）
<400> 95
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 96
<211> 215
<212> DNA
<213> 藤麻黄(Ephedra antisyphilitica)
<400> 96
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 97
<211> 215
<212> DNA
<213> 智利麻黄（Ephedra chilensis）
<400> 97
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 98
<211> 215
<212> DNA
<213> Ephedra andina
<400> 98
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 99
<211> 215
<212> DNA
<213> Ephedra frustillata
<400> 99
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaaggac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaagca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 100
<211> 215
<212> DNA
<213> 山岭麻黄(Ephedra gerardiana)
<400> 100
ttaaagatta tagattaact tattatactc cagagtatca gactaagaac actgatatct 60
tggcagcatt ccgagtaact cctcaacccg gagtaccgcc cgaggaaaca ggcgcagcgg 120
tagctgctga atcttctaca ggtacatgga ccacagtttg gactgatggt cttactagtc 180
ttgatcgtta caaaggacga tgctatgata tcgaa 215
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
gatgcgcggt tgcagccttc 20
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
gatatccgtt gccgagagtc g 21
<210> 103
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
cttcccggcc gcacaaacg 19
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
gagagccgag atatccgttg c 21
<210> 105
<211> 127
<212> DNA
<213> 枣(Ziziphus jujuba)
<400> 105
ccggccgcac aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccccg ccccggagac ggtgtgcggt cggggtgtgc gtcgtattct ctattgtaat 120
gtcaaaa 127
<210> 106
<211> 127
<212> DNA
<213> 枣(Ziziphus jujuba)
<400> 106
ccggccgcac aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccccg ccccggagac ggtgtgcggt cggggtgtgc gtcgtattct ctattgtaat 120
gtcaaaa 127
<210> 107
<211> 126
<212> DNA
<213> Ziziphus calophylla
<400> 107
tcggccgctc aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccctg ccccggagac ggtgcgcggt cggggtgtgc gtcgcattct gtattgtatg 120
tcaaaa 126
<210> 108
<211> 126
<212> DNA
<213> 凸枣(Ziziphus mucronata)
<400> 108
tcggccgccc aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccccg ccccagagat ggtgtgcggt cggggcgtgc gtcgtattct ctattatatg 120
tcaaaa 126
<210> 109
<211> 126
<212> DNA
<213> Ziziphus horsfieldii
<400> 109
tcggccgctc aaacgaaccc cggcgcaaat cgcgccaagg aacacccaac gaattggcat 60
tcaccccctg ccccagagat ggtgtgcggt cggggtgtgc gtcgtattct atactgtatg 120
tcaaaa 126
<210> 110
<211> 126
<212> DNA
<213> 叙利亚枣(Ziziphus spina-christi)
<400> 110
tcggccgcac aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccctg ccccagagat ggtgtgcggt cggggtgtgc gtcgtattct gtcttatatg 120
tcaaaa 126
<210> 111
<211> 126
<212> DNA
<213> Ziziphus glabrata
<400> 111
tcggcmgcac aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccccg ccccagagat ggtgtgcggt cggggtgcgc gtcgtattct gtcttatatg 120
tcaaaa 126
<210> 112
<211> 126
<212> DNA
<213> Ziziphus brunoniana
<400> 112
ccggccgcac aaacgaaccc cggcgcaaac cgcgccaagg aacacctaac gaattggcat 60
tcaccccccg ccccagagat ggagtgcggt cggggtgtgc ttcgtattct gtattatatg 120
tcaaaa 126
<210> 113
<211> 128
<212> DNA
<213> 大果枣(Ziziphus mairei)
<400> 113
ccggccacac aaacgaaacc ccggcgcaaa ccgcgccaag gaacacctaa cgaattggca 60
tccacccccc gccccagaga tggtgtgcgg ttcggggtgt gcgtcgtatt cttattatat 120
tgtcaaaa 128
<210> 114
<211> 127
<212> DNA
<213> 蜀枣(Ziziphus xiangchengensis)
<400> 114
ccggccacac aaacgaaacc ccggcgcaaa ccgcgccaag gaacacctaa cgaattggca 60
tccacccccc gccccagaga tggtgtgcgg ttcggggtgt gcgtcgtatt ctaattatat 120
gtcaaaa 127
<210> 115
<211> 121
<212> DNA
<213> 枣(Ziziphus jujuba)
<400> 115
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgccccg 60
gagacggtgt gcggtcgggg tgtgcgtcgt attctctatt gtaatgtcaa aacgactctc 120
g 121
<210> 116
<211> 121
<212> DNA
<213> 枣(Ziziphus jujuba)
<400> 116
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgccccg 60
gagacggtgt gcggtcgggg tgtgcgtcgt attctctatt gtaatgtcaa aacgactctc 120
g 121
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> Ziziphus calophylla
<400> 117
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccctgccccg 60
gagacggtgc gcggtcgggg tgtgcgtcgc attctgtatt gtatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 118
<211> 120
<212> DNA
<213> 凸枣(Ziziphus mucronata)
<400> 118
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg cgtgcgtcgt attctgtatt atatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 119
<211> 120
<212> DNA
<213> Ziziphus horsfieldii
<400> 119
aaccccggcg caaatcgcgc caaggaacac ccaacgaatt ggcattcacc ccctgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg tgtgcgtcgt attctatact gtatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 120
<211> 120
<212> DNA
<213> 叙利亚枣(Ziziphus spina-christi)
<400> 120
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccctgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg tgtgcgtcgt attctgtctt atatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 121
<211> 120
<212> DNA
<213> 滇刺枣(Ziziphus mauritiana)
<400> 121
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg tgtgcgtcgt attctgtctt atatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 122
<211> 120
<212> DNA
<213> Ziziphus glabrata
<400> 122
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg tgcgcgtcgt attctgtctt atatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 123
<211> 120
<212> DNA
<213> Ziziphus brunoniana
<400> 123
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ctaacgaatt ggcattcacc ccccgcccca 60
gagatggagt gcggtcgggg tgtgcttcgt attctgtatt atatgtcaaa acgactctcg 120
<210> 124
<211> 122
<212> DNA
<213> 小果枣(Ziziphus oenoplia)
<400> 124
aaccccggcg caaaccgcgc caaggaacac ccaacgaatt ggcgttcacc cctcgcccca 60
gagatggtgt gcggtcgggg tgcgcgtcgc attctgtatt ttgtatgtca aaacgactct 120
cg 122
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 125
gtttcttctc atccagctcc 20
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
ctataaagag tttagttttc tatc 24
<210> 127
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
gatagaaaac taaactcttt atag 24
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
gaaagagtca atattcgccc 20
<210> 129
<211> 125
<212> DNA
<213> 栝楼(Trichosanthes kirilowii)
<400> 129
tcgcgaatga aacgattcaa aaaaatatac atgtatttac tgaataatag attgaatcat 60
gggattcttt gagatttcat ttaatcaatc tattagaaat tttagaaatt tgtatatctt 120
ctttt 125
<210> 130
<211> 116
<212> DNA
<213> 日本栝楼(Trichosanthes kirilowii var japonica)
<400> 130
tcgcgaatga aacgattcaa aaaaatatac atgtatttac tgaataatag attgaatcat 60
gggattcttt gagatttcat ttaatcaatc tattagaaat ttgtatatct tctttt 116
<210> 131
<211> 125
<212> DNA
<213> 大苞栝楼(Trichosanthes bracteata)
<400> 131
tcgcgaatga aacgattcaa aaaaatatac atgtatttac tgaataatag attgaatcgg 60
gggattcttt gagatttcat ttaatcaatt tattagaaat tttcgaaatt tgtatatctt 120
ctttt 125
<210> 132
<211> 125
<212> DNA
<213> 栝楼((Trichosanthes kirilowii)或日本栝楼(Trichosanthes kirilowiivar japonica)或大苞栝楼(Trichosanthes bracteata)
<400> 132
tcgcgaatga aacgattcaa aaaaatatac atgtatttac tgaataatag attgaatcat 60
gggattcttt gagatttcat ttaatcaatc tattagaaat tttagaaatt tgtatatctt 120
ctttt 125
<210> 133
<211> 125
<212> DNA
<213> Trichosanthes cucmeroides
<400> 133
tcgcgaatga aacgattcaa aaaaatatac atgtatttac tgaataatag attgaattgt 60
gggattcttt gagatttcat ttaatcaatc tattagaaat tttagaaatt tgtatatctt 120
ctttt 125
<210> 134
<211> 102
<212> DNA
<213> 双边栝楼(Trichosanthes rosthornii)
<400> 134
aatatacatg tatttactga ataatagatt gaatcatggg attctttgag atttcattta 60
atcaatctat tagaaatttt agaaatttgt atatcttctt tt 102
<210> 135
<211> 215
<212> DNA
<213> 栝楼(Trichosanthes kirilowii)
<400> 135
attctagaat aatagaataa tttttttttt ttattttttt ttattataat tatagttttc 60
taaaaaatta tagataatat aatctcgttt tgttattttt tcttttatta tttattataa 120
ggttataaca aatctttatt ttgttttgcc ttttcttttt ttatctatta ttatacgacc 180
caaatttaga aatctaataa aatggaaacg ttcgc 215
<210> 136
<211> 207
<212> DNA
<213> 日本栝楼(Trichosanthes kirilowii var. japonica)
<400> 136
attctagaat aatagaataa tttttttttt ttttattttt tattataatt atagttttct 60
aaaaaattat agataatata atctcgtttt gttatttttt cttttattat aaggttataa 120
caaatcttta ttttgttttg ccttttcttt ttttatctat tattatacga cccaaattta 180
gaaatctaat aaaatggaaa cgttcgc 207
<210> 137
<211> 133
<212> DNA
<213> 大苞栝楼(Trichosanthes bracteata)
<400> 137
attctagaat aatagaataa ttttttcttt tattataagg ttataacaaa tctttatttt 60
gttttgcctt ttcttttttt atctattatt atacgaccca aatttagaaa tctaataaaa 120
tggaaacgtt cgc 133
<210> 138
<211> 215
<212> DNA
<213> 栝楼(Trichosanthes kirilowii)或日本栝楼(Trichosanthes kirilowiivar. japonica)或大苞栝楼(Trichosanthes bracteata)
<400> 138
attctagaat aatagaataa tttttttttt ttattttttt ttattataat tatagttttc 60
taaaaaatta tagataatat aatctcgttt tgttattttt tcttttatta tttattataa 120
ggttataaca aatctttatt ttgttttgcc ttttcttttt ttatctatta ttatacgacc 180
caaatttaga aatctaataa aatggaaacg ttcgc 215
<210> 139
<211> 200
<212> DNA
<213> Trichosanthes cucmeroides
<400> 139
attctagaat aatagaataa ttttttttta ttataattat ggttttctaa aaaattatag 60
ataatataat ctcgttttgt tattttttct tttattttat tataaggtta taacaaatct 120
ttattttgtt ttgccttttc tttttttatc tcttattaga cgacccaaat ttagaaatct 180
aataaaatgg aaacgttcgc 200
<210> 140
<211> 168
<212> DNA
<213> 双边栝楼(Trichosanthes rosthornii)
<400> 140
attctagaat aatagaataa tttttttttt ttattataat tatagttttc taaaaaatta 60
tagataatat aatctcgttt tgttattttt tcttttatta taaggttata acaaatcttt 120
attttgtttt gccttttatt tttttatcta ttattatacg acccaaat 168
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 141
cctgcggaag gatcattgtc g 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 142
gtgaaagaag gcgccgcatc c 21
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 143
cctgcggaag gatcattgtc g 21
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 144
gggagcgtgc tctctcgtta g 21
<210> 145
<211> 200
<212> DNA
<213> 吴茱萸(Tetradium ruticarpum)
<400> 145
aaacctctgc agagcagaat gacccgcgaa ctagtgaaaa caccggtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgtgggtgcg ggactcgtcc tgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccagggc 180
accggacatg gtgatcccca 200
<210> 146
<211> 200
<212> DNA
<213> 疏毛吴茱萸(Evodia bodinieri)
<400> 146
aaacctctgc agagcagaat gacccgcgaa ctagtgaaaa caccggtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgtgggtgcg ggactcgtcc tgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccagggc 180
accggacatg gtgatcccca 200
<210> 147
<211> 201
<212> DNA
<213> 石虎(Evodia officinalis)
<400> 147
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa aaactgtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccaggtg 180
caccagacat ggtgatcccc a 201
<210> 148
<211> 201
<212> DNA
<213> 吴茱萸(Tetradium ruticarpum)或疏毛吴茱萸(Evodia bodinieri)或石虎(Evodia officinalis)
<400> 148
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa aaactgtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccaggtg 180
caccagacat ggtgatcccc a 201
<210> 149
<211> 200
<212> DNA
<213> 楝叶吴萸(Tetradium glabrifolium)
<400> 149
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgccac cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccctc gggggcgacc 120
aacgaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccagggc 180
accggacacg gtgagcccca 200
<210> 150
<211> 200
<212> DNA
<213> 牛枓吴萸(Tetradium trichotomum)
<400> 150
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg ggcgtgcttc 60
gcggccgttc cccctgccac cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccctc gggggcgacc 120
aacgaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaatctaacg agagagcacg ctcccagggc 180
accggacacg gtgagcccca 200
<210> 151
<211> 202
<212> DNA
<213> 华南吴萸(Tetradium austrosinense)
<400> 151
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgcc cccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc tcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaatctaa cgagagagca cgctcccagg 180
gccccggaca cggtgagccc ca 202
<210> 152
<211> 202
<212> DNA
<213> 臭檀吴萸(Tetradium daniellii)
<400> 152
aaacctctgc aaagcagaac gacccgagaa ctcgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgtc gccgcgggtg caggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaatctaa cgagagagca cgctcccggg 180
gccccggaca cggtgatccc cg 202
<210> 153
<211> 202
<212> DNA
<213> 川黄檗(Phellodendron chinense)
<400> 153
aaacctctgc acagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct ccccctgccg ccgcgggtgc gggactcgtc ccgttccccg cgggggcgac 120
caacgaaccc ccggcgcgga ctgcgccaag gaaatctaac gagagagcac gcccccgggg 180
cccccggaca cggcgagccc cg 202
<210> 154
<211> 203
<212> DNA
<213> 拉伐氏黄檗(Phellodendron lavallei)
<400> 154
aaacctctgc acagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg ggggcgtgct 60
tcgcggccgc tccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaatctaa cgagagagca cgcccccggg 180
gcccccggac acggcgagcc ccg 203
<210> 155
<211> 203
<212> DNA
<213> 黄檗(Phellodendron amurense)
<400> 155
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg ggggcgtgct 60
tcgcggccgc tccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaatctaa cgagagagca cgcccccggg 180
gcccccggac acggcgagcc ccg 203
<210> 156
<211> 202
<212> DNA
<213> 安哥拉类崖椒木(Fagaropsis angolensis)
<400> 156
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggtggg gggcgtgctt 60
tacggccgct cccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgctcccc gcgggggcga 120
acaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaaactaa cgagagagca cgctcccggg 180
gccccggaaa cggtgtgccc ag 202
<210> 157
<211> 202
<212> DNA
<213> 光滑类崖椒木(Fagaropsis glabra)
<400> 157
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa cttgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgctcccc gcgggggcga 120
acaacgaacc cccggcgcgg accgcgccaa ggaaaactaa cgagagagca cgctcccggg 180
gccccggaga cggtgtgccc tg 202
<210> 158
<211> 154
<212> DNA
<213> 吴茱萸(Tetradium ruticarpum)
<400> 158
aaacctctgc agagcagaat gacccgcgaa ctagtgaaaa caccggtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgtgggtgcg ggactcgtcc tgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 159
<211> 154
<212> DNA
<213> 疏毛吴茱萸(Evodia bodinieri)
<400> 159
aaacctctgc agagcagaat gacccgcgaa ctagtgaaaa caccggtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgtgggtgcg ggactcgtcc tgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 160
<211> 154
<212> DNA
<213> 石虎(Evodia officinalis)
<400> 160
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa aaactgtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 161
<211> 154
<212> DNA
<213> 吴茱萸(Tetradium ruticarpum)或疏毛吴茱萸(Evodia bodinieri)或石虎(Evodia officinalis)
<400> 161
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa aaactgtggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgcccc cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccccc gggggcgacc 120
aactaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 162
<211> 154
<212> DNA
<213> 楝叶吴萸(Tetradium glabrifolium)
<400> 162
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg ggcgtgcttc 60
gcggccgctc cccctgccac cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccctc gggggcgacc 120
aacgaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 163
<211> 154
<212> DNA
<213> 牛枓吴萸(Tetradium trichotomum)
<400> 163
aaacctctgc agagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg ggcgtgcttc 60
gcggccgttc cccctgccac cgcgggtgcg ggactcgtcc cgttcccctc gggggcgacc 120
aacgaacccc cggcgcggac tgcgccaagg aaat 154
<210> 164
<211> 156
<212> DNA
<213> 华南吴萸(Tetradium austrosinense)
<400> 164
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgcc cccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc tcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaat 156
<210> 165
<211> 156
<212> DNA
<213> 臭檀吴萸(Tetradium daniellii)
<400> 165
aaacctctgc aaagcagaac gacccgagaa ctcgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgtc gccgcgggtg caggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaat 156
<210> 166
<211> 155
<212> DNA
<213> 川黄檗(Phellodendron chinense)
<400> 166
aaacctctgc acagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct ccccctgccg ccgcgggtgc gggactcgtc ccgttccccg cgggggcgac 120
caacgaaccc ccggcgcgga ctgcgccaag gaaat 155
<210> 167
<211> 156
<212> DNA
<213> 拉伐氏黄檗(Phellodendron lavallei)
<400> 167
aaacctctgc acagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg ggggcgtgct 60
tcgcggccgc tccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaat 156
<210> 168
<211> 156
<212> DNA
<213> 黄檗(Phellodendron amurense)
<400> 168
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccagcggg ggggcgtgct 60
tcgcggccgc tccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgttcccc gcgggggcga 120
ccaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaat 156
<210> 169
<211> 156
<212> DNA
<213> 安哥拉类崖椒木(Fagaropsis angolensis)
<400> 169
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa ctcgtgaaaa caccggtggg gggcgtgctt 60
tacggccgct cccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgctcccc gcgggggcga 120
acaacgaacc cccggcgcgg actgcgccaa ggaaaa 156
<210> 170
<211> 156
<212> DNA
<213> 光滑类崖椒木(Fagaropsis glabra)
<400> 170
aaacctctgc aaagcagaac gacccgcgaa cttgtgaaaa caccggcggg gggcgtgctt 60
cgcggccgct cccccctgcc gccgcgggtg cgggactcgt cccgctcccc gcgggggcga 120
acaacgaacc cccggcgcgg accgcgccaa ggaaaa 156
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 171
aaggatcatt gtcgaatcct gc 22
<210> 172
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 172
gagatatccg ttgtcgagag tc 22
<210> 173
<211> 209
<212> DNA
<213> 白花前胡(Peucedanum praeruptorum)
<400> 173
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtt gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag 180
cgggcagcgg cgtcgttcta aaacacaac 209
<210> 174
<211> 208
<212> DNA
<213> 紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 174
aacagcagaa tgacccgcta acacgttaac aatttgggcg agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc tgcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcaccggc gtcattccaa aacacaac 208
<210> 175
<211> 209
<212> DNA
<213> 白花前胡(Peucedanum praeruptorum)或紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 175
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtt gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag 180
cgggcagcgg cgtcgttcta aaacacaac 209
<210> 176
<211> 208
<212> DNA
<213> 华中前胡(Peucedanum medicum)
<400> 176
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcagcggc gtcattctaa aacacaac 208
<210> 177
<211> 208
<212> DNA
<213> 岩前胡(Peucedanum medicum var. gracile)
<400> 177
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcagcggc gtcattctaa aacacaac 208
<210> 178
<211> 209
<212> DNA
<213> 滨海前胡(Peucedanum japonicum)
<400> 178
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggcc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag 180
cgggcagcgg cgtcgttcta aaacacaac 209
<210> 179
<211> 208
<212> DNA
<213> 南川前胡(Peucedanum dissolutum)
<400> 179
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcagcggc gtcattctaa aacacaac 208
<210> 180
<211> 208
<212> DNA
<213> 石防风(Peucedanum terebinthaceum)
<400> 180
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcatcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtttgc gaatccctgg taggtggcca ctcccgggtg gccaccggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcagcggc gtcattctaa aacacaac 208
<210> 181
<211> 208
<212> DNA
<213> 欧洲前胡(Peucedanum officinale)
<400> 181
aatagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccctgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc tgcaaaatca 120
tttgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgtttgc 180
gggcagcggc gtcattccaa aacacaac 208
<210> 182
<211> 208
<212> DNA
<213> 欧前胡(Peucedanum ostruthium)
<400> 182
aatagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcatcgggg gacctcggtc 60
tcctgtccgc gaatccctgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc tgcaaaatca 120
tttgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcagcggc gtcattccaa aacacaac 208
<210> 183
<211> 209
<212> DNA
<213> 滨当归(Angelica hirsutiflora)
<400> 183
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag 180
cgggcagcgg cgtcgttcta aaacacaac 209
<210> 184
<211> 208
<212> DNA
<213> 东当归(Angelica acutiloba)
<400> 184
aatagcagaa tgacccgcta acacgtcaac attttgggcg agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaatccctgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc tgcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aactgaattg tacgtccgta tcccgttagc 180
gggcaccggc gtcattccaa aacacaac 208
<210> 185
<211> 209
<212> DNA
<213> 防风(Saposhnikovia divaricata)
<400> 185
aacagcagaa tgacccgcta acacgtcaac aatttgggca agcgtcgggg ggcctcggtc 60
tcctgtctgc gaacccttgg taggtggcca ctcccgggtg gccactggcc ttcaaaatca 120
ttcgggcgcg gaatgcgcca aggaccttaa aaactgaatt gtacgtccgt atcccgttag 180
cgggcagcgg cgtcattcta aaacacaac 209
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 186
gaacgcaagt tgcgcccgag 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 187
cttgggccga gagcaaggac 20
<210> 188
<211> 168
<212> DNA
<213> 知母(Anemarrhena asphodeloides)
<400> 188
cgcctcgcgt cgctccgcgc acctcgtccc cgcaccccgc gggcgtcggg tggcgcggat 60
gcggagattg gccccccgtg cctcgcggcg cggcgggtcg aagtgcgggc cgccggccgg 120
gtcggacgcg gcgagtggtg gacgatacgc acggcgctgt gcgccgcg 168
<210> 189
<211> 203
<212> DNA
<213> 知母(Anemarrhena asphodeloides)
<400> 189
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct cgcgtcgctc cgcgcacctc 60
gtccccgcac cccgcgggcg tcgggtggcg cggatgcgga gattggcccc ccgtgcctcg 120
cggcgcggcg ggtcgaagtg cgggccgccg gccgggtcgg acgcggcgag tggtggacga 180
tacgcacggc gctgtgcgcc gcg 203
<210> 190
<211> 204
<212> DNA
<213> 小花肥皂草(Chlorogalum parviflorum)
<400> 190
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct agcgtcgctc cgcgcaccct 60
gcccccacac agtgcgggcg catgtgggcg tggacgcgga tattggcccc ccgtgccttg 120
cggtgcggcg ggtcgaagtg cgggccgccg gccgggtcgg acgcggcgag tggtggacgg 180
acacgcacga cgctgtgcgc cgcg 204
<210> 191
<211> 204
<212> DNA
<213> 紫色肥皂草(Chlorogalum purpureum)
<400> 191
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct agcgtcgctc cgcgcaccct 60
gcccccacac agtgcgggcg catgtgggcg tggacgcgga tattggcccc ccgtgccttg 120
cggtgcggcg ggtcgaagtg cgggccgccg gccgggtcgg acgcggcgag tggtggacgg 180
acacgcacga cgctgtgcgc cgcg 204
<210> 192
<211> 203
<212> DNA
<213> 星萼舞鹤草(Maianthemum stellatum)
<400> 192
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct cgcgtcgctc cgcgcaccct 60
gccatccccg aaccggggag gcggcgggcg cggatgcgga gattggcccc ccgtgcctcg 120
cggcgcggcg ggtcgaagtg cgggccgccg gccgggacgg acgcggcgag tggtggacgg 180
acacgtacgg cgctgaacgc cgc 203
<210> 193
<211> 202
<212> DNA
<213> 加拿大舞鹤草(Maianthemum canadense)
<400> 193
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct cgcgtcgctc cgcgcacccc 60
gcccccccag aatggggagg cggcgggcgc ggatgcggag attggccccc cgtgccttgc 120
ggcgcggcgg gtcgaagtgc gggccgccgg ccgggacgga cgcggcgagt ggtggacgga 180
cacgtacggc gctgaacgcc gc 202
<210> 194
<211> 201
<212> DNA
<213> 圆锥舞鹤草(Maianthemum paniculatum)
<400> 194
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct cgcgtcgctc cgcgcaccct 60
gcaccccgaa ccggggaggc ggcgggcgcg gatgcggaga ttggcccccc gtgcctcgcg 120
gcgcggcggg tcgaagtgcg ggccgccggc cgggacggac gcggcgagtg gtggacggac 180
acgtacggcg ctgaacgccg c 201
<210> 195
<211> 201
<212> DNA
<213> 巨舞鹤草(Maianthemum gigas)
<400> 195
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg cgtcacgcct agcgtcgctc cgcgcaccct 60
gcaccccgaa ccggggaggc ggcgggcgcg gatgcggaga ttggcccccc gtgcctcgcg 120
gcgcggcggg tcgaagtgcg ggccgccggc cgggacggac gcggcgagtg gtggacggac 180
acgtacggcg ctgaacgccg c 201
<210> 196
<211> 202
<212> DNA
<213> 滇黄精(Polygonatum yunnanense)
<400> 196
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg catcacgcct cgcgtcgctc cgcgcacccc 60
gccccccggc cccggggagg cggcgggcgc ggacgcggag attggccccc cgtgcctcgc 120
ggcgcggcgg gccgaagtgc gggccgccgg ccgggacgga cgcggcgagt ggtggacgga 180
cacgtacggc gctttacgcc gc 202
<210> 197
<211> 202
<212> DNA
<213> Polygonatum govanianum
<400> 197
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg catcacgcct cgcgtcgctc cgcgcacccc 60
gccccccggc cccggggagg cggcgggcgc ggacgcggag attggccccc cgtgcctcgc 120
ggcgcggcgg gccgaagtgc gggccgccgg ccgggacgga cgcggcgagt ggtggacgga 180
cacgtacggc gctttacgcc gc 202
<210> 198
<211> 193
<212> DNA
<213> 黄精(Polygonatum sibiricum)
<400> 198
gctatccggc cgagggcacg cctgcctggg catcacgcct cgcgtcgctc cgcgcacccc 60
gccccccggc cccggggagt cggcgggcgc ggacgcggag attggccccc cgtgcctcgc 120
ggcgcggcgg gccgaagtgc gggccgccgg ccgggacgga cgcggcgagt ggtggacgga 180
cacgtacggc gct 193
<210> 199
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 199
tccgtaggtg aacctgcgga ag 22
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 200
agcaytgttc cttggcgccc 20
<210> 201
<211> 169
<212> DNA
<213> 麦冬(Ophiopogon japonicus)
<400> 201
gatcattgtc gagacccgaa cagacgattg cgaactcgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgc ggatattccg accgcccgat ctcggtaccg cggggcacca tggccgcccc 120
cgccccgcat tgctgcggga cgggcggcgg gaacaacacc cggcgcgat 169
<210> 202
<211> 169
<212> DNA
<213> 麦冬(Ophiopogon japonicus)
<400> 202
gatcattgtc gagacccgaa cagacgattg cgaactcgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgc ggatattccg accgcccgat ctcggtaccg cggggcacca tggccgcccc 120
cgccccgcat tgctgcggga cgggcggcgg gaacaacacc cggcgcgat 169
<210> 203
<211> 166
<212> DNA
<213> 阔叶麦冬(Liriope muscari)
<400> 203
gatcattgtc gagacccgaa cggacgaccg cgaacccgta aacgctcccg caggggcgga 60
gggagggcgg atattccggc cgcccgaccc cgcacctcgg ggcacaacgg ccgcccccgc 120
cccgcatcgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 204
<211> 166
<212> DNA
<213> 湖北麦冬(Liriope spicata var. prolifera)
<400> 204
gatcattgtc gagacccgaa cggacgaccg cgaacccgta aacgctcccg caggggcgga 60
gggagggcgg atattccgac cgcccgaccc cgcacctcgg ggcacaatgg ccgcccccgc 120
cccgcgtcgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 205
<211> 166
<212> DNA
<213> 澜沧沿阶草(Ophiopogon lancangensis)
<400> 205
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacggccctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattccgac cgctcgacct cgtacctcgg ggcaccatgg ccgcccccgc 120
cccgcaccgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 206
<211> 166
<212> DNA
<213> 连药沿阶草(Ophiopogon bockianus)
<400> 206
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacggtcctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattccgac cgctcgacct cgtacctcgg ggcaccacgg ccgcccccgc 120
cccgcaccgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 207
<211> 166
<212> DNA
<213> 沿阶草(Ophiopogon bodinieri)
<400> 207
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattcagac cgtccgacca cgcacctcgg ggcaccatgg ccgccctcgc 120
ctcgcatcgc tgcgtgacgg acggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 208
<211> 166
<212> DNA
<213> 大沿阶草(Ophiopogon grandis)
<400> 208
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattcagac cgtccgacca cgcacctcgg ggcaccatgt ccgcccccgc 120
cccgcatcgc tgcgtgacgg acggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 209
<211> 166
<212> DNA
<213> 钝叶沿阶草(Ophiopogon amblyphyllus)
<400> 209
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaactcgta aacgctcctg cagtggcgga 60
gggagggcgg atattctgac cgcctgacct cgctcctcgg ggcaccatgg ctgcccccga 120
ctcgcatggc tgcgggacgg gcggcgggaa caaaacccgg cgcggt 166
<210> 210
<211> 166
<212> DNA
<213> 林生沿阶草(Ophiopogon sylvicola)
<400> 210
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattctgac cgcctgacct cgcccctcgg ggcaccatgg ctgcccccgc 120
ctcgcatcgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 211
<211> 166
<212> DNA
<213> 厚叶沿阶草(Ophiopogon corifolius)
<400> 211
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacgctcctg caggggcggc 60
gggagggcgg atattctgac cgcctgacct cgcccctcgg ggcaccatgg ctgccctcgc 120
ctcgcatcgc tgcgggacgg gcggcgggaa caacacccgg cgcggt 166
<210> 212
<211> 167
<212> DNA
<213> 间型沿阶草(Ophiopogon intermedius)
<400> 212
gatcattgtc gagacccgaa cggacgatcg cgaacccgta aacgctcctg caggggcgga 60
gggagggcgg atattctgac cgcctgacct tcgcccctcg gggcaccatg gctgcccccg 120
cctcgcatcg ctgcgggacg ggcggcggga acaacacccg gcgcggt 167
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 213
ggtgaacctg cggaaggatc 20
<210> 214
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 214
cccgctaacg ggatacggac g 21
<210> 215
<211> 177
<212> DNA
<213> 白芷(Angelica dahurica)
<400> 215
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaaaaattt aggcgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcctg tttgcgaatc catggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctacaa aatcattcgg gcgcggtatg cgccaaggac cttaaaatcg aattgta 177
<210> 216
<211> 177
<212> DNA
<213> 白芷(Angelica dahurica)
<400> 216
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaaaaattt aggcgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcctg tttgcgaatc catggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctacaa aatcattcgg gcgcggtatg cgccaaggac cttaaaatcg aattgta 177
<210> 217
<211> 177
<212> DNA
<213> 东当归(Angelica acutiloba)
<400> 217
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg tcaacatttt gggcgagcgt 60
cggggggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctgcaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggac cttaaaactg aattgta 177
<210> 218
<211> 177
<212> DNA
<213> 法落海(Angelica apaensis)
<400> 218
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttacaaattt gggtgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcttg tctccgaatc catggtaggt ggccactccc gggtggtcac 120
tggccttcaa aatcatttgg gcgcggtatg cgccaaggac cttaaaatcg aattgta 177
<210> 219
<211> 177
<212> DNA
<213> Angelica capitellata
<400> 219
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaacaattt gggcgagcgt 60
cggggggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctgcaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggtc cttaaaactg aattgta 177
<210> 220
<211> 177
<212> DNA
<213> 紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 220
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaacaattt gggcgagcgt 60
cggggggcct cggtctcctg tcttcgaatc cctggtaggt ggccactccc gggtggtcac 120
tggcctgcaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggac cttaaaactg aattgta 177
<210> 221
<211> 177
<212> DNA
<213> 朝鲜当归(Angelica gigas)
<400> 221
attgtcgaat cctgcaatag caaaatgacc cgctaacacg ttaacaattt gggcgagcgt 60
cggggggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactctc gggtggccac 120
tggcctgcaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggac cttaaaactg aattgta 177
<210> 222
<211> 177
<212> DNA
<213> 康定当归(Angelica kangdingensis)
<400> 222
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaaaaattt gggcgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctacaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggaa cttaaaactg aattgta 177
<210> 223
<211> 177
<212> DNA
<213> 疏叶当归(Angelica laxifoliata)
<400> 223
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaaaaattt gggcgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctacaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggaa cttaaaactg aattgta 177
<210> 224
<211> 177
<212> DNA
<213> 大叶当归(Angelica megaphylla)
<400> 224
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttacaaattt gggtgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcatg tttgcgaatc catggtaggt ggccactccc gggtggccac 120
tggcctacaa aatcatttgg gcgcggtatg cgccaaggac cttaaaaccg aattgta 177
<210> 225
<211> 177
<212> DNA
<213> 青海当归(Angelica nitida)
<400> 225
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttacaaattt gggtgagcgt 60
cgggaggcct cggtctcttg tctccgaatc catggtaggt ggccactccc gggtggtcac 120
tggccttcaa aatcatttgg gcgcggtatg cgccaaggac cttaaaatcg aattgta 177
<210> 226
<211> 177
<212> DNA
<213> 拐芹(Angelica polymorpha)
<400> 226
attgtcgaat cctgcaatag cagaatgacc cgctaacacg ttaacaattt ggacgagcgt 60
cggggggcct cggtctcctg tctgcgaatc cctggtaggt ggccactcct gggtggccac 120
tggcctgcaa aatcattcgg gcgcggaatg cgccaaggac cttaaaactg aattgta 177
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 227
ggtgaacctg cggaaggatc 20
<210> 228
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 228
gccgagatat ccgttgccga g 21
<210> 229
<211> 183
<212> DNA
<213> 东北铁线莲(Clematis mandshurica)
<400> 229
attgtcgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
accttaacgg gtccccgcct gctaatcaaa acccggcgcg acaagcgtca aggaaaactt 120
agcggaaaca aggggaaggc ccgccacagg gacgacccca agaatccgaa cacccaaacg 180
act 183
<210> 230
<211> 183
<212> DNA
<213> 棉团铁线莲(Clematis hexapetala)
<400> 230
attgtcgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
accttagcgg ggacctgcct gctaatcaaa acccggcgcg acaagcgtca aggaaaactt 120
agcggaaaca agggggaggc ccgtcacagg ggcgacccca agaatccgaa cacccaaacg 180
act 183
<210> 231
<211> 179
<212> DNA
<213> 威灵仙(Clematis chinensis)
<400> 231
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
acccccgtcc ccgcctgcta atcaaaaccc ggcgcgacaa gcgtcaagga aaacttagcg 120
gaaacaaggg gaaggcccgt cacagggacg accccaagaa tccgaacacc caaacgact 179
<210> 232
<211> 183
<212> DNA
<213> 东北铁线莲(Clematis mandshurica)或棉团铁线莲(Clematis hexapetala)或威灵仙(Clematis chinensis)
<400> 232
attgtcgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
accttaacgg gtccccgcct gctaatcaaa acccggcgcg acaagcgtca aggaaaactt 120
agcggaaaca aggggaaggc ccgccacagg gacgacccca agaatccgaa cacccaaacg 180
act 183
<210> 233
<211> 179
<212> DNA
<213> 翅果铁线莲(Clematis brachyura)
<400> 233
attgtcgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
gccctggtcc ctgcctgcta atcaaaaccc ggcgcgacaa gcgtcaagga aaacttagcg 120
gaaacaaggg gaaggcccgc cacagggacg accccaagaa tccgaacacc caaacgact 179
<210> 234
<211> 183
<212> DNA
<213> 火焰色铁线莲(Clematis flammula)
<400> 234
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
accctagcgg ggacctgcct gctaatcaaa atccggcgcg acaagcgtca aggaaaactt 120
agcggaaaca aggggaaggc ccgtcacagg gacgacccca agaatccgaa cacccaaacg 180
act 183
<210> 235
<211> 186
<212> DNA
<213> 芹叶铁线莲(Clematis aethusifolia)
<400> 235
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcgggg 60
acgcgctcgc gcgcctcccg cctgctaatc aaaatccggc gcgacaagcg tcaaggaaaa 120
cttagcggaa acaaggggcc ggcccgtcac agggacgacc ccaagaatcc gaatactcaa 180
acgact 186
<210> 236
<211> 184
<212> DNA
<213> 葡萄叶铁线莲(Clematis vitalba)
<400> 236
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcgggg 60
acgcgctcgc gctccccgtc tgctaatcaa aacccggcgc gacaagcgtc aaggaaaact 120
tagcggaaac aaggggacgg cccgtcacag ggacgccccc aagaatccga atactcaaac 180
gact 184
<210> 237
<211> 185
<212> DNA
<213> 银叶铁线莲(Clematis delavayi)
<400> 237
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcgggg 60
acgcgctcgc gctccccgtc tgctaatcaa aacccggcgc gacaagcgtc aaggaaaact 120
tagcggaaac aaggggacgg cccgtcacag ggatcgcccc caagaatccg aatactcaaa 180
cgact 185
<210> 238
<211> 186
<212> DNA
<213> 毛蕊铁线莲(Clematis lasiandra)
<400> 238
attgtcgata cctgctcagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcgggg 60
acgcgctcgc gcgcctcccg cctgctaatc aaaacccggc gcgacaagcg tcaaggaaaa 120
cttagcggaa acaaggggac gtcccgtcac agggacggcc ccaagaatcc gaatactcaa 180
acgact 186
<210> 239
<211> 178
<212> DNA
<213> 小木通铁线莲(Clematis armandii)
<400> 239
attgccgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
acgcgctccc cgcctgctaa tcaaaatccg gcgcgacaag cgtcaaggaa aacttagcgg 120
aaacaggggg acggcccgtc acagggacgg ccccaagaat ccgaacaccc aaacgact 178
<210> 240
<211> 178
<212> DNA
<213> 柱果铁线莲(Clematis uncinata)
<400> 240
attgtcgata cctgcccagc agaacgaccc gcgaacacgt gaaaacaacc acacgcaggg 60
acgcgctccc cgcctgctaa tcaaaatccg gcgcgacaag cgtcaaggaa aacatagcgg 120
aaacaagggg acggcccgtc acagggacga acccaagaat ccgaacactc aaacgact 178
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 241
gggtattggt gcaacattac 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 242
cagccaagaa gatcttatga 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 243
gggtattggt gcaacattac 20
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 244
ggaatcggca tagattcata attta 25
<210> 245
<211> 336
<212> DNA
<213> 菌陈蒿(Artemisia capillaris)
<400> 245
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatgta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 246
<211> 336
<212> DNA
<213> 菌陈蒿(Artemisia capillaris)
<400> 246
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatgta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 247
<211> 336
<212> DNA
<213> 艾蒿(Artemisia argyi)
<400> 247
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 248
<211> 336
<212> DNA
<213> 冷蒿(Artemisia frigida)
<400> 248
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 249
<211> 335
<212> DNA
<213> 铁杆蒿(Artemisia gmelinii)
<400> 249
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaagatgaaa aaatccaatg 240
gatttaaaac ttatttttcg gtaaatcaat tacgaaattt ttttctagaa ttcctaaaat 300
ttgtttgaca tcttctatgt gaaaatgctc cattt 335
<210> 250
<211> 336
<212> DNA
<213> 山地蒿(Artemisia montana)
<400> 250
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 251
<211> 336
<212> DNA
<213> 滨艾(Artemisia fukudo)
<400> 251
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagccac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgaa aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 252
<211> 336
<212> DNA
<213> 黄花蒿(Artemisia annua)
<400> 252
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagccac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat taaattatga atctatgccg attccaaata tataaattgt 180
cctaaagatt caaaacttat gttttggcct ttttctaaaa aaaagatgac aaaatccaat 240
ggatttaaaa cttatttttc ggtaaatcaa ttacgaaatt tttttctaga attcctaaaa 300
tttgtttgac atcttctatg tgaaaatgct ccattt 336
<210> 253
<211> 140
<212> DNA
<213> 菌陈蒿(Artemisia capillaris)
<400> 253
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatgta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 254
<211> 140
<212> DNA
<213> 菌陈蒿(Artemisia capillaris)
<400> 254
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatgta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 255
<211> 140
<212> DNA
<213> 艾蒿(Artemisia argyi)
<400> 255
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 256
<211> 140
<212> DNA
<213> 冷蒿(Artemisia frigida)
<400> 256
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 257
<211> 140
<212> DNA
<213> 铁杆蒿(Artemisia gmelinii)
<400> 257
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 258
<211> 140
<212> DNA
<213> 山地蒿(Artemisia montana)
<400> 258
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagtcac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 259
<211> 140
<212> DNA
<213> 滨艾(Artemisia fukudo)
<400> 259
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagccac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 260
<211> 140
<212> DNA
<213> 黄花蒿(Artemisia annua)
<400> 260
ctattgataa atccctaact ttagggcttt tttaaattga ttcaattgtg aaataaaata 60
tcatgacgta tgtatctagg gagcagccac ttcaaagtga attctcccta gatacatcta 120
ttcaattaaa ttatgtcaat 140
<210> 261
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 261
actgccttga tccacttggc 20
<210> 262
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 262
asaaggagag rgtatttgcc tgc 23
<210> 263
<211> 245
<212> DNA
<213> 枸杞(Lycium chinense)
<400> 263
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tatacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 264
<211> 245
<212> DNA
<213> 宁夏枸杞(Lycium barbarum)
<400> 264
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tatacagttt aaaataaata caaaataaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 265
<211> 245
<212> DNA
<213> 枸杞(Lycium chinense)或宁夏枸杞(Lycium barbarum)
<400> 265
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tatacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 266
<211> 245
<212> DNA
<213> Lycium bosciifolium
<400> 266
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 267
<211> 245
<212> DNA
<213> Lycium arenicola
<400> 267
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 268
<211> 245
<212> DNA
<213> Lycium pumilum
<400> 268
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 269
<211> 245
<212> DNA
<213> 欧洲枸杞(Lycium europaeum)
<400> 269
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacagttt aaaataaata aaaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 270
<211> 245
<212> DNA
<213> Lycium hirsutum
<400> 270
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attttgacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacagttt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 271
<211> 221
<212> DNA
<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum)
<400> 271
cattccattt tgacattatt taaattcgaa aacaaaagat taaagttcga aaatatctct 60
tctttcttat ttcaaagata agaatatgaa gtcaaaattc gatttttttt agaaatgaaa 120
taaaaaagat atagtaacat tagcaacaag aggaacaagt tatatttata cagtttaaaa 180
taaatacaaa atcaaaatag aatactcaat catgaataaa t 221
<210> 272
<211> 254
<212> DNA
<213> 新疆枸杞(Lycium dasystemum)
<400> 272
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attcattcca ttttgacatt atttaaattc 60
gaaaacaaaa gattaaagtt cgaaaatatc tcttctttct tatttcaaag ataagaatat 120
gaagtcaaaa ttcgattttt tttagaaatg aaataaaaaa gatatagtaa cattagcaac 180
aagaggaaca agttatattt atacagttta aaataaatac aaaatcaaaa tagaatactc 240
aatcatgaat aaat 254
<210> 273
<211> 254
<212> DNA
<213> 黑果枸杞(Lycium ruthenicum)
<400> 273
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc attcattcca ttttgacatt atttaaattc 60
gaaaacaaaa gattaaagtt cgaaaatatc tcttctttct tatttcaaag ataagaatat 120
gaagtcaaaa ttcgattttt tttagaaatg aaataaaaaa gatatagtaa cattagcaac 180
aagaggaaca agttatattt atacagttta aaataaatac aaaatcaaaa tagaatactc 240
aatcatgaat aaat 254
<210> 274
<211> 245
<212> DNA
<213> 美洲枸杞(Lycium americanum)
<400> 274
tacatccgcc ccctcgcgta cttacattcc atttttacat tatttaaatt cgaaaacaaa 60
agattaaagt tcgaaaatat ctcttctttc ttatttcaaa gataagaata tgaagtcaaa 120
attagatttt ttttagaaat gaaataaaaa agatatagta acattagcaa caagaggaac 180
aagttatatt tctacaattt aaaataaata caaaatcaaa atagaatact caatcatgaa 240
taaat 245
<210> 275
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 275
gcagaatctc gtgaaccatt g 21
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 276
tgacttgggg ccacaatccg 20
<210> 277
<211> 284
<212> DNA
<213> 绿壳砂(Amomum villosum var. xanthioides)
<400> 277
agtctttgaa cgcaagttgt gcccaaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gstggtgcga agagcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggtagtcggc agtcgtcggg cgcgatgggt 180
gctggtcacc ctgcgcgtga atagaacgtc gccccgacgt gttgggatgt ttcctcaaag 240
agaccctgtg cgattgcggc atcatgtcaa agtgacgtgc ccat 284
<210> 278
<211> 284
<212> DNA
<213> 绿壳砂(Amomum villosum var. xanthioides)
<400> 278
agtctttgaa cgcaagttgt gcccaaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gstggtgcga agagcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggtagtcggc agtcgtcggg cgcgatgggt 180
gctggtcacc ctgcgcgtga atagaacgtc gccccgacgt gttgggatgt ttcctcaaag 240
agaccctgtg cgattgcggc atcatgtcaa agtgacgtgc ccat 284
<210> 279
<211> 284
<212> DNA
<213> Amomum ghaticum
<400> 279
agtctttgaa cgcaagttgt gcccaaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gctggtgcga agagcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggaagtcggc agtcgtcggg cgcgatgggt 180
gctggtcacc ctgcgcgtga atagaacgtc gccccgacgt gtcgggatgt gtcctaaaag 240
agaccctgtg cgattgcggc atcatgtcaa agcgacgtgc ccat 284
<210> 280
<211> 263
<212> DNA
<213> Amomum schmidtii
<400> 280
agtctttgaa cgcaagttgt gcccgaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gctggcgcga agggcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggcagtcggc agtcgtcggg cgcgatgggt 180
gctggtcacc ctgcacgtga atagaacgtc gcccccgacg tgttgggatg tgtcctcgag 240
agaccctgtg cgattgcggc acc 263
<210> 281
<211> 285
<212> DNA
<213> 细砂仁(Amomum microcarpum)
<400> 281
agtctttgaa cgcaagttgt gcccaaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc cccttgcttt gctggtgcga agagcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggcagtcggc agtcgtcggg gcgcgatggg 180
tgctggtcac cctgcgcgtg aatagaacgt cgcccccgac gtgttgggat gtgtcctcga 240
gagaccctgt gcgattgggg catcgtgtga aagtgccgtg cccgt 285
<210> 282
<211> 284
<212> DNA
<213> 方片砂仁(Amomum quadratolaminare)
<400> 282
agtctttgaa cgcaagttgt gcccgaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttggccgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gctggtgcga agtgcggaaa ttggcctcgt 120
gtgccctcgg gcacagtcgg tcgaagagcg ggtagtcggc agtcgtcggg cgcgatgggt 180
gctggtcacc ctgtgcgtga atagaacgtc gcccccgacg tgttgggatg tgccctcaag 240
agaccctgtg cgattgtggc atcgtgtgaa agtgtcgtgc ccgt 284
<210> 283
<211> 287
<212> DNA
<213> 香豆蔻(Amomum aromaticum)
<400> 283
agtctttgaa cgcaagttgt gcccgaggct ttgtggccga gggcacgcct gcttgggcgt 60
catggcaaca tcgcctttgc tccttgcttt gttgggtgcg aagtgcggaa attggcctcg 120
tgtgtcctcg ggcacagtcg gtcgaagagc gggtagtcgg cagtcgtcgg gcgcgatggg 180
tgctggtcac cctgtgcgtg tggatagaac gtcgcgcccg acgtgttggg atgcgtcctc 240
gagagaccct gtgcgattgc ggcatcgtgc ggaagtgccg tgcccgt 287
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 284
caagagggca ccattgcttc 20
<210> 285
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 285
gtacaattat agataagtca gc 22
<210> 286
<211> 180
<212> DNA
<213> 忍冬(Lonicera japonica)
<400> 286
tttttttatt taacttaact taacagttac ctattttctt tcaagaaaaa tagtaaatct 60
tcttattttt aggggcgggt cctgattgta ttttgggctt tcatttttga ttctgtatga 120
aaaatcttta tatcctctaa aataaaagta aaataaaaga aaaactgttg gaattttttt 180
<210> 287
<211> 180
<212> DNA
<213> 忍冬(Lonicera japonica)
<400> 287
tttttttatt taacttaact taacagttac ctattttctt tcaagaaaaa tagtaaatct 60
tcttattttt aggggcgggt cctgattgta ttttgggctt tcatttttga ttctgtatga 120
aaaatcttta tatcctctaa aataaaagta aaataaaaga aaaactgttg gaattttttt 180
<210> 288
<211> 175
<212> DNA
<213> 毛花柱忍冬(Lonicera dasystyla)
<400> 288
tttttttatt taacttaaca gttacctatt ttctttcaag aaaaatagta aatcttctta 60
tttttagggg cgggtcctga ttgtgttttg ggctttcatt ttttattctg tatgaaaaat 120
ctttatatcc tctaaaataa aagtaaaata aaagaaaaac tgttggaatt ttttt 175
<210> 289
<211> 175
<212> DNA
<213> 锈毛忍冬(Lonicera ferruginea)
<400> 289
tttttttatt taacttaaca gttacctatt ttctttcaag aaaaatagtc aatcttctta 60
tttttagggg cgggtcctga ttgtgtttgg ggctttcatt tttttttctg tatgaaaaat 120
ctttatatcc tctaaaagaa aagtaaaata aaagaaaaac tgttggaatt ttttt 175
<210> 290
<211> 164
<212> DNA
<213> 金花忍冬（Lonicera chrysantha）
<400> 290
ttttttattt aacagttacc tactttcttt caagaaaaat agtcaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatctttct 120
atcctctaaa ataaaaataa aagaaaaact gttggaattt tttt 164
<210> 291
<211> 169
<212> DNA
<213> 蓝靛果忍冬(Lonicera caerulea)
<400> 291
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agtcaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtaggaa aaatctttat 120
atcctctaaa ataaaagtaa aataaaagaa aaactgttgg aattttttt 169
<210> 292
<211> 164
<212> DNA
<213> 东方忍冬(Lonicera orientalis)
<400> 292
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agccaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatcttttt 120
atcctctaaa agtaaaataa aagaaaaaat cttggaattt tttt 164
<210> 293
<211> 169
<212> DNA
<213> 加拿大忍冬(Lonicera canadensis)
<400> 293
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agtcaacctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatctttat 120
atcctcaaaa ataaaagtaa aataaaagaa aaactgttgg aattttttt 169
<210> 294
<211> 164
<212> DNA
<213> 鞑靼忍冬(Lonicera tatarica)
<400> 294
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agccaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatcttttt 120
atcctctaaa agtaaaataa aagaaaaaat cttggaattt tttt 164
<210> 295
<211> 169
<212> DNA
<213> 高山忍冬(Lonicera alpigena)
<400> 295
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat aggcaatctt cttatttttg 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatctttat 120
atcctctaaa ataaaagtaa aataaaagaa aaactgttgg aattttttt 169
<210> 296
<211> 164
<212> DNA
<213> 欧洲忍冬(Lonicera xylosteum)
<400> 296
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agtcaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtatgaa aaatctttat 120
atcctctaaa ataaaaataa aagaaaaact gttggaattt tttt 164
<210> 297
<211> 169
<212> DNA
<213> 密脉忍冬(Lonicera venulosa)
<400> 297
ttttttattt aacagttacc tattttcttt caagaaaaat agtcaatctt cttattttta 60
ggggtgggtc atgattgtgt tttgggcttt cattttttat tctgtaggaa aaatctttat 120
atcctctaaa ataaaagtaa aataaaagaa aaactgttgg aattttttt 169
<210> 298
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 298
cccttcactt gtgttggaga atg 23
<210> 299
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 299
agttccttga cgcatgcagc gcc 23
<210> 300
<211> 119
<212> DNA
<213> 日本萍蓬草(Nuphar japonica)
<400> 300
tctggtctgc gcatcggcat ctctccacag gcccgccgcc ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca gccgaagcaa acacaaaac 119
<210> 301
<211> 119
<212> DNA
<213> 日本萍蓬草(Nuphar japonica)
<400> 301
tctggtctgc gcatcggcat ctctccacag gcccgccgcc ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca gccgaagcaa acacaaaac 119
<210> 302
<211> 119
<212> DNA
<213> 台湾萍蓬草(Nuphar shimadai)
<400> 302
tctggtctgc gcatcggcat ctctccacag gcctgccgcc ttgcgcactg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca gccgaagcaa acgcaaaac 119
<210> 303
<211> 119
<212> DNA
<213> 萍蓬草(Nuphar pumilai)
<400> 303
tctggtctgc gcatcggcat ctctccacag gcctgccgcc ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctacaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca gccgaagcaa acacaaaac 119
<210> 304
<211> 119
<212> DNA
<213> 小叶萍蓬草(Nuphar microphyllai)
<400> 304
tctggtctgc gcatcggcat ctctccacag gcctgccgcc ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaagcaa acacaaaac 119
<210> 305
<211> 119
<212> DNA
<213> 肋果萍蓬草(Nuphar advena)
<400> 305
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacaaaac 119
<210> 306
<211> 119
<212> DNA
<213> 欧亚萍蓬草(Nuphar lutea)
<400> 306
tctggtccgc gcatcggcat ctctccacag gcctgccgcc ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca gccgaagcaa acacaaaac 119
<210> 307
<211> 119
<212> DNA
<213> 紫果萍蓬草(Nuphar variegata)
<400> 307
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacaaaac 119
<210> 308
<211> 119
<212> DNA
<213> 紫心萍蓬草(Nuphar ozarkana)
<400> 308
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacaaaac 119
<210> 309
<211> 119
<212> DNA
<213> 长叶萍蓬草(Nuphar ulvacea)
<400> 309
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacaaaac 119
<210> 310
<211> 119
<212> DNA
<213> 箭叶萍蓬草(Nuphar sagittifolia)
<400> 310
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacagaac 119
<210> 311
<211> 119
<212> DNA
<213> 多萼萍蓬草(Nuphar polysepala)
<400> 311
tccggtccgc gcatcggcat ctctccacaa gcctgccgct ttgcgcattg ccttgttgtg 60
ggttcttttc atctgcaccg ggtgaagcgg aaggcgcgca cgcgaaacaa acacaaaac 119
<210> 312
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 312
tgaacctgcg gaaggatcat tgtc 24
<210> 313
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 313
gttatgattc cttgacgcgt tccg 24
<210> 314
<211> 119
<212> DNA
<213> 桑(Morus alba)
<400> 314
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggt gaccccaacc 60
cctgacgctg agtgtgtgca gccctgcctt gcgccctcag cataaaacga acccaggcg 119
<210> 315
<211> 119
<212> DNA
<213> 桑(Morus alba)
<400> 315
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggt gaccccaacc 60
cctgacgctg agtgtgtgca gccctgcctt gcgccctcag cataaaacga acccaggcg 119
<210> 316
<211> 119
<212> DNA
<213> 蒙桑(Morus mongolica)
<400> 316
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggt gattccaacc 60
cctgacgctg agtgtgtgcg gccctgcctt gcgccctcag cataaaacga acccaggcg 119
<210> 317
<211> 124
<212> DNA
<213> 暹罗桑(Morus rotundiloba)
<400> 317
gaaacctgca aagcagaaag accaagcgga cccattacaa caccaggggt tgaccccaac 60
cccttgacgc ttgagtgtgt gcagcccttg ccttgcgccc tcagcataaa acgaacccca 120
ggcg 124
<210> 318
<211> 131
<212> DNA
<213> 朴桑(Morus celtidifolia)
<400> 318
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggc gacgtgcgca 60
atgcgcccca acccctgact ccgagtgtgt gcagccctgc cttgcgccct cggaataaac 120
gaacccaggc g 131
<210> 319
<211> 131
<212> DNA
<213> 黑桑(Morus nigra)
<400> 319
gaaacctgca aagcagaaag accggcgacc cattacaaca ctgaggggcg acgtgcgcaa 60
tgcgccccaa cccctgacgc cgagtgtgtg cagccctgcc ttgcgccctc agcataaaac 120
gaacccaggc g 131
<210> 320
<211> 132
<212> DNA
<213> 默里桑(Morus murrayana)
<400> 320
gaaacctgca gagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggc gacgtgcgca 60
atgcgcccca acccctgacg ccgagtgtgt gcagccctgc cttgcgccct cagcataaaa 120
cgaacccagg cg 132
<210> 321
<211> 132
<212> DNA
<213> 红桑(Morus rubra)
<400> 321
gaaacctgca gagcagaaag accagcggac ccattacaac acccaggggc gacgtgcgca 60
atgcgcccca acccctgacg tcgagtgtgt gcagccctgc cttgcgccct cggcattaaa 120
cgaacccagg cg 132
<210> 322
<211> 132
<212> DNA
<213> 川桑(Morus notabilis)
<400> 322
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ctattacaac acctggggac gacgtacaca 60
atgcgcccca acccctgacg ccgagtgtgt gcagccctgc cttgcgccct cggcataaaa 120
caaacccagt cg 132
<210> 323
<211> 132
<212> DNA
<213> 滇桑(Morus yunnanensis)
<400> 323
gaaacctgca aagcagaaag accagcggac ctattacaac acctggggac gacgtacaca 60
atgcgcccca acccctgacg ccgagtgtgt gcagccctgc cttgcgccct cggcataaaa 120
caaacccagt cg 132
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 324
gcratagcag aatgacccgc 20
<210> 325
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 325
gatatccgtt gccgagagtc g 21
<210> 326
<211> 190
<212> DNA
<213> 羌活(Notopterygium incisum)
<400> 326
taacacgtaa acacaccggg ccagcgtcgg ggggcttgag tcccccgttt gcgaacccca 60
ggaaggtggg tgctctcggg tgcccatcga ccgacgaaac caaccgggcg cggtatgcgc 120
caaggaaatc aaaactgaat tgtacgtctg cttcccgtcc gtgggaagag gcgtctttcc 180
gaaacacaaa 190
<210> 327
<211> 190
<212> DNA
<213> 宽叶羌活(Hansenia forbesii)
<400> 327
taacatgtaa acacaccggg ccagtgtcgg ggggcttcag tccctcgttt gcgaacccca 60
ggacggtagg cgctctcggg tgcccaccgg ccgatgaaac caaccgggcg cggtatgcgc 120
caagcaaatc aaaactgaat tgtacgtctg cttcctgtcc gtgggaagag gcgtattttc 180
gaaacacaaa 190
<210> 328
<211> 190
<212> DNA
<213> 羌活(Notopterygium incisum)或宽叶羌活(Hansenia forbesii)
<400> 328
taacatgtaa acacaccggg ccagtgtcgg ggggcttcag tccctcgttt gcgaacccca 60
ggacggtagg cgctctcggg tgcccaccgg ccgatgaaac caaccgggcg cggtatgcgc 120
caagcaaatc aaaactgaat tgtacgtctg cttcctgtcc gtgggaagag gcgtattttc 180
gaaacacaaa 190
<210> 329
<211> 179
<212> DNA
<213> 卵叶羌活(Hansenia oviformis)
<400> 329
cacactgggc cagcgtcggg ggtcttgagt cccccgttcg caaaccccag gaaggtgggc 60
gctctcgggt gcccatcggc cgacgaaacc aaccgggcgc ggtatgcgcc aaggaaatca 120
aaactgaatt gtacgtctgt ttcccgtccg tgggaagagg cgtcttttcg aaacacaaa 179
<210> 330
<211> 190
<212> DNA
<213> 少裂凹乳芹(Vicatia bipinnata)
<400> 330
taacatgtaa acacatcggg cgagcgtcgg ggggcttgag tcccctgttt gcgaacccta 60
ggaaggtggg cgctctcggg tgcccaccga ccgacgaaac caaccgggcg cggtatgcgc 120
caaggaaatc aaaactgaat tgtacgtctg cttcccgttc gtgggaagag gcgtctttcc 180
gaaacacaaa 190
<210> 331
<211> 190
<212> DNA
<213> 单球芹(Haplosphaera phaea)
<400> 331
taacatgtaa acacatcggg cgagcgtcgg ggggcttgag tcccctgttt gcgaacccta 60
ggaaggtggg cgctctcggg tgcccaccgg ccgacgaaac caaccgggcg cggtatgcgc 120
caaggaaatc aaaactgaat tgtacgtctg cttctcgtcc gtgggaagag gcgtctttcc 180
gaaacacaaa 190
<210> 332
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 332
ctttgaacgc aagttgcgcc c 21
<210> 333
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 333
gctgcgttct tcatcgatgc 20
<210> 334
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 334
ctttgaacgc aagttgcgcc c 21
<210> 335
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 335
ctcggcattt gggccaaccg 20
<210> 336
<211> 294
<212> DNA
<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)
<400> 336
raagccgtta ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgtcgcc atccccgcgc 60
ctycctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgccccaty ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgagtcctc ggcgacraac gccacgacgg tcggtggttg tcaaacctcg 180
gttgcctgty gtgcgcagtc gtcgcgctcc gagcgtctcg cgacgatcgc tgctctgcay 240
cgrcggagct ttcaacgcga ccccaggtca ggcggggtta cccgctgaat ttaa 294
<210> 337
<211> 294
<212> DNA
<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)
<400> 337
raagccgtta ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgtcgcc atccccgcgc 60
ctycctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgccccaty ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgagtcctc ggcgacraac gccacgacgg tcggtggttg tcaaacctcg 180
gttgcctgty gtgcgcagtc gtcgcgctcc gagcgtctcg cgacgatcgc tgctctgcay 240
cgrcggagct ttcaacgcga ccccaggtca ggcggggtta cccgctgaat ttaa 294
<210> 338
<211> 257
<212> DNA
<213> 麻栗坡枇杷(Eriobotrya malipoensis)
<400> 338
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc tcccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcgtcgcc ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgggtcctc ggcgacgaac gccacgacgg tcggtggttg tccaacctcg 180
gttccctgtt gtgcgctttc gtcgcgctcc gagcggctcg cgaccctcga cgctccgctc 240
cggcggagct ttcaacg 257
<210> 339
<211> 257
<212> DNA
<213> 小叶枇杷(Eriobotrya seguinii)
<400> 339
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc tcccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcgtcgcc ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgggtcctc ggcgacgaac gccacgacgg tcggtggttg tccaacctcg 180
gttccctgtt gtgcgctttc gtcgcgctcc gagcggctcg cgaccctcga cgctccgctc 240
cggcggggct ttcaacg 257
<210> 340
<211> 246
<212> DNA
<213> 香花枇杷(Eriobotrya fragrans)
<400> 340
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcctcacc ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgagtcctc ggcgacgaac gccacgacag tcggtggttg tcaaacctcg 180
gttgcctgtt gtgcgcgttc gtcgcgctcc gagcggctcg cgacgatcgt cgctctgcat 240
cgacgg 246
<210> 341
<211> 280
<212> DNA
<213> 大花枇杷(Eriobotrya cavaleriei)
<400> 341
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcctcacc ccgcgcggtt 120
ggcccaaatg ccgagtcctc ggcgacgaac gccacgacag tcggtggttg tcaaacctcg 180
gttgcctgtt gtgcgcgttc gtcgcgctcc gagcggctcg cgacgatcgt cgctctgcat 240
cgacggagct ttcaacgcga ccccaggtca ggcggggtca 280
<210> 342
<211> 261
<212> DNA
<213> 南亚枇杷(Eriobotrya bengalensis)
<400> 342
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcgtca ccccgcgcgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg ttgtgcgcgt tcgtcgcgct ccgagcggct cgcgacgatc gctgctctgc 240
atcggcggag ctttcaacgc g 261
<210> 343
<211> 260
<212> DNA
<213> 腾越枇杷（Eriobotrya tengyuehensis）
<400> 343
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcgtca ccccgcacgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg ttgtgcgcgt tcgtcgcgct ccgagcggct cgcgacgatc gctgctctgc 240
atcggcggag cttcaacgcg 260
<210> 344
<211> 259
<212> DNA
<213> 栎叶枇杷（Eriobotrya prinoides）
<400> 344
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtccca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggggcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcgcgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg ttgtgcgcgt tcgtcgcgct ccgagcggct cgcgacgatc gctgctctgc 240
atcggcggag ctttcaacg 259
<210> 345
<211> 259
<212> DNA
<213> 南亚枇杷(Eriobotrya bengalensis)
<400> 345
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtccca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggggcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcgcgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg ttgtgcgcgt tcgtcgcgct ccgagcggct cgcgacgatc gctgctctgc 240
atcggcggag ctttcaacg 259
<210> 346
<211> 259
<212> DNA
<213> 大瑶山枇杷（Eriobotrya dayaoshanensis）
<400> 346
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg agagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcgcgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg ttgtgcgcgt tcgtcgcgct ccgagcgtct cgcgacgatc gctgctctgc 240
atcggcggag ctttcaacg 259
<210> 347
<211> 282
<212> DNA
<213> 倒卵叶枇杷（Eriobotrya obovata）
<400> 347
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgtcgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccttcg agagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcgcgg 120
ttggcccaaa tgccgagtcc tcggcgacga acgccacgac agtcggtggt tgtcaaacct 180
cggttgcctg tcgtgcgcgt tcgtcgcttt ccgagcggct cgcgacgatc gctgccctgc 240
atcggcggag ctttcaacgc gaccccaggt caggcggggt ta 282
<210> 348
<211> 115
<212> DNA
<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)
<400> 348
raagccgtta ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgtcgcc atccccgcgc 60
ctycctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgccccaty ccgcg 115
<210> 349
<211> 115
<212> DNA
<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)
<400> 349
raagccgtta ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgtcgcc atccccgcgc 60
ctycctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgccccaty ccgcg 115
<210> 350
<211> 115
<212> DNA
<213> 麻栗坡枇杷(Eriobotrya malipoensis)
<400> 350
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc tcccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcgtcgcc ccgcg 115
<210> 351
<211> 115
<212> DNA
<213> 小叶枇杷(Eriobotrya seguinii)
<400> 351
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc tcccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcgtcgcc ccgcg 115
<210> 352
<211> 115
<212> DNA
<213> 香花枇杷(Eriobotrya fragrans)
<400> 352
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcctcacc ccgcg 115
<210> 353
<211> 115
<212> DNA
<213> 大花枇杷(Eriobotrya cavaleriei)
<400> 353
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
ctccctcggg agcgtcgggg agggcggacg atggcctccc gtgcctcacc ccgcg 115
<210> 354
<211> 117
<212> DNA
<213> 南亚枇杷(Eriobotrya bengalensis)
<400> 354
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcgtca ccccgcg 117
<210> 355
<211> 117
<212> DNA
<213> 腾越枇杷(Eriobotrya tengyuehensis)
<400> 355
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcgtca ccccgca 117
<210> 356
<211> 117
<212> DNA
<213> 栎叶枇杷（Eriobotrya prinoides）
<400> 356
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtccca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggggcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcg 117
<210> 357
<211> 117
<212> DNA
<213> 南亚枇杷(Eriobotrya bengalensis)
<400> 357
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtccca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg ggggcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcg 117
<210> 358
<211> 117
<212> DNA
<213> 大瑶山枇杷(Eriobotrya dayaoshanensis)
<400> 358
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgccgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccctcg agagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcg 117
<210> 359
<211> 117
<212> DNA
<213> 倒卵叶枇杷(Eriobotrya obovata)
<400> 359
gaagccgtca ggccgagggc acgcctgcct gggcgtcaca cgtcgttgcc ttccccgcgc 60
gcctccttcg agagcgtcgg ggagggcgga cgatggcctc ccgtgcctca ccccgcg 117
<210> 360
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 360
cctgcatagc agaaccactc 20
<210> 361
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 361
catctccaag cctctgtgcc 20
<210> 362
<211> 172
<212> DNA
<213> 紫草(Lithospermum erythrorhizon)
<400> 362
gcgaacaagt tttttaactc gggcatcggt taatacggga tactcccggc tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgctaaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcctg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 363
<211> 172
<212> DNA
<213> 紫草(Lithospermum erythrorhizon)
<400> 363
gcgaacaagt tttttaactc gggcatcggt taatacggga tactcccggc tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgctaaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcctg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 364
<211> 172
<212> DNA
<213> 白果紫草(Lithospermum officinale)
<400> 364
gtgaacacgt tttttaactc gggcatcggt taatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttga caagggcttg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 365
<211> 171
<212> DNA
<213> Lithospermum afromontanum
<400> 365
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcggt caatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccgaca tctagccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttga caagggcttg aaccacctct cccgctcgcg g 171
<210> 366
<211> 172
<212> DNA
<213> 加州紫草(Lithospermum californicum)
<400> 366
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcggt taatacggga tattcccgac tattgatcgt 60
tgcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggtgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcttg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 367
<211> 172
<212> DNA
<213> 北美紫草(Lithospermum carolinense)
<400> 367
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcgat taatacggga tattcccgac tattgatcgg 60
tgcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgtgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caatggcttg aaccatcctc tcccgcttgc gg 172
<210> 368
<211> 172
<212> DNA
<213> 灰毛紫草(Lithospermum canescens)
<400> 368
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcgat taatacggga tattcccgac tattgatcgg 60
tgcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgtgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcttg aaccatcctc tcccgcttgc gg 172
<210> 369
<211> 171
<212> DNA
<213> 钝叶紫草(Lithospermum cinereum)
<400> 369
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcggt caatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccggca tctagccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttga caagggcttg aaccacctct cccgctcgcg g 171
<210> 370
<211> 172
<212> DNA
<213> Lithospermum distichum
<400> 370
gtgaacaagt ttttgaactc gggcatcggt caatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
agcctaatgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggctca aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 371
<211> 172
<212> DNA
<213> Lithospermum gayanum
<400> 371
gtgaacaagt ttttgaactc gggcatcggt caatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
agcctaatgg tgccccggca tctcgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggctca aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 372
<211> 172
<212> DNA
<213> 绿紫草(Lithospermum viride)
<400> 372
gtgaacaagt tttttaactc gggcatcggt taatacggga tactcccgac tattgatcgg 60
tgcctaacgg tgccccggca tctagccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgcgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcttg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 373
<211> 172
<212> DNA
<213> Lithospermum incisum
<400> 373
gtgaacaagt tttataactc gggcatcggt taatacggga tattcccgac tattgatcgg 60
agcctaacgg tgccccggca tcttgccgtg tggtgcttaa caacaacccc cggcgtgaga 120
agcgccaagg aatactttaa caagggcttg aaccatcctc tcccgctcgc gg 172
<210> 374
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 374
ctcaagaggt gggtattgct cc 22
<210> 375
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 375
gatccacttg gctacatccg cc 22
<210> 376
<211> 117
<212> DNA
<213> 杜仲(Eucommia ulmoides)
<400> 376
ttttttacat taacagaaaa ttttattggt ggttttttct cattaagata ataaagaagg 60
ttaaaagttg tattttaatc ttttgtaatt taaagtaatt caaataatag atagagg 117
<210> 377
<211> 117
<212> DNA
<213> 杜仲(Eucommia ulmoides)
<400> 377
ttttttacat taacagaaaa ttttattggt ggttttttct cattaagata ataaagaagg 60
ttaaaagttg tattttaatc ttttgtaatt taaagtaatt caaataatag atagagg 117
<210> 378
<211> 54
<212> DNA
<213> 秀丽火把花(Colquhounia elegans)
<400> 378
aagttgaatt ttattttgaa tttaaaagtc aattcattat agtaatagta gagg 54
<210> 379
<211> 59
<212> DNA
<213> Colquhounia compt
<400> 379
tttaaagatt gaattttatt ttgaatttaa aagtaaattc attatagtaa tagtagagg 59
<210> 380
<211> 41
<212> DNA
<213> 小叶铃子香(Chelonopsis giraldii)
<400> 380
ttttgaattt aaaagtaaat tcattaaagt aatagtagag g 41
<210> 381
<211> 41
<212> DNA
<213> 木锥花(Gomphostemma arbusculum)
<400> 381
ttttgaattt aaaagtaaat tcattatagt aatagtagag g 41
<210> 382
<211> 27
<212> DNA
<213> 孔雀草(Tagetes patula)
<400> 382
taaagtaata ctagataata gtagagg 27
<210> 383
<211> 27
<212> DNA
<213> Pentalepis trichodesmoides
<400> 383
tatagtaata ctaaataata gtagagg 27
<210> 384
<211> 48
<212> DNA
<213> 柔毛蓝花楹（Jacaranda puberula）
<400> 384
taatttacta ttttaaagtt aaagtaatta aaaagtaaat agtagagg 48
<210> 385
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 385
ctggtgttaa agattataga 20
<210> 386
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 386
aagaccatca gtccaaactg 20
<210> 387
<211> 139
<212> DNA
<213> 草麻黄(Ephedra sinica)
<400> 387
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aagaacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accggccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 388
<211> 139
<212> DNA
<213> 中麻黄(Ephedra intermedia)
<400> 388
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aagaacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 389
<211> 139
<212> DNA
<213> 木贼麻黄(Ephedra equisetina)
<400> 389
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aagaacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacctggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 390
<211> 139
<212> DNA
<213> 草麻黄(Ephedra sinica)或中麻黄(Ephedra intermedia)或木贼麻黄(Ephedra equisetina)
<400> 390
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aagaacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accggccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 391
<211> 139
<212> DNA
<213> Ephedra frustillata
<400> 391
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 392
<211> 139
<212> DNA
<213> Ephedra breana
<400> 392
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg ctatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 393
<211> 139
<212> DNA
<213> 岩生麻黄(Ephedra rupestris)
<400> 393
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 394
<211> 139
<212> DNA
<213> 内华达麻黄(Ephedra nevadensis)
<400> 394
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 395
<211> 139
<212> DNA
<213> 三叉麻黄(Ephedra trifurca)
<400> 395
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 396
<211> 139
<212> DNA
<213> 藤麻黄(Ephedra antisyphilitica)
<400> 396
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 397
<211> 139
<212> DNA
<213> 智利麻黄(Ephedra chilensis)
<400> 397
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 398
<211> 139
<212> DNA
<213> Ephedra andina
<400> 398
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 399
<211> 139
<212> DNA
<213> Ephedra frustillata
<400> 399
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aaggacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaagcaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 400
<211> 139
<212> DNA
<213> 山岭麻黄(Ephedra gerardiana)
<400> 400
ttaacttatt atactccaga gtatcagact aagaacactg atatcttggc agcattccga 60
gtaactcctc aacccggagt accgcccgag gaaacaggcg cagcggtagc tgctgaatct 120
tctacaggta catggacca 139
<210> 401
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 401
tctgcctggg tgtcacgcat c 21
<210> 402
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 402
tggggtcaca gtcgaagcgc a 21
<210> 403
<211> 211
<212> DNA
<213> 白花前胡(Peucedanum praeruptorum)
<400> 403
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttggtgg cggaaactgg 60
cctcccgtac cttgttgtgc ggttggcgga aaaatgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtat tgtcgtacga atcctcgtcg tcttaagaga 180
gattcaggac ccttaggcag cacacactct g 211
<210> 404
<211> 209
<212> DNA
<213> 紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 404
gtattgcctg cagaccactc acacctgaga agttgtgacg gtttggggcg caaattggcc 60
tcccgtacct tgtcgtgcgg ttggcggaaa aacgagtctc cggcgacgga tgtcgcgaca 120
tcggtggttg tgaaagaccc tcttgtcttg tcgcgcgaat cctcgtcatc ttagagaggc 180
tccaggaccc ataggtagca cacactctg 209
<210> 405
<211> 211
<212> DNA
<213> 白花前胡(Peucedanum praeruptorum)或紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 405
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttggtgg cggaaactgg 60
cctcccgtac cttgttgtgc ggttggcgga aaaatgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtat tgtcgtacga atcctcgtcg tcttaagaga 180
gattcaggac ccttaggcag cacacactct g 211
<210> 406
<211> 210
<212> DNA
<213> 华中前胡(Peucedanum medicum)
<400> 406
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttggggg cggaaactgg 60
cctcccgtac gttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtct tgtcgcgcga atccacgtca tcttagagag 180
atccgggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 407
<211> 210
<212> DNA
<213> 岩前胡(Peucedanum medicum var. gracile)
<400> 407
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttggggg cggaaactgg 60
cctcccgtac gttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtct tgtcgcgcga atccacgtca tcttagagag 180
atccgggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 408
<211> 210
<212> DNA
<213> 滨海前胡(Peucedanum japonicum)
<400> 408
gtctttgccc acaaaccact ctcacctgag aagttgtgtc ggtttgggga cggaaactgg 60
cctcccgtac cttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gatgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtct tgtcgcgcga atcctcgtca tcttagagag 180
atccaggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 409
<211> 210
<212> DNA
<213> 南川前胡(Peucedanum dissolutum)
<400> 409
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttggggg cggaaactgg 60
cctcccgtac cttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtct tgtcgcgcga atccacgtca tcttagagag 180
atccaggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 410
<211> 209
<212> DNA
<213> 石防风(Peucedanum terebinthaceum)
<400> 410
gtcttgccca caaaccactc acacctgaga agttgtgccg gtttgggggc ggaaactggc 60
ctcccgtacc ttgtcgtgcg gttggcggaa aaacgagtct ccggcgacgg acgtcgcgac 120
atcggtggtt gtaaaagacc ctcttgtctt gtcgcgcgaa tcctcgtcat cttagagagc 180
tccaggaccc ttaggcagca cacactatg 209
<210> 411
<211> 208
<212> DNA
<213> 欧洲前胡(Peucedanum officinale)
<400> 411
gtcttgcccc caaaccactc acacctgaga agttgtgctg gtttggggcg gaaactggcc 60
tcccgtacct tgtcgtgcgg ttggcggaaa aacgagtctc cggcgacgga cgtcgcgaca 120
tcggtggttg taaaagaccc tcttgtcttg tcgtgcgaat cctcgtcatc ttagcgagct 180
ccaggaccct taggcagcac acactttg 208
<210> 412
<211> 207
<212> DNA
<213> 欧前胡(Peucedanum ostruthium)
<400> 412
gtcttgcccc aaaccactca cacctgagaa gttgtgccgg tttggggcgg aaactggcct 60
cccgtacctt gtcgtgcggt tggcgtaaaa acgagtctcc ggcgacggac gtcgcgacat 120
cggtggttgt aaaagaccct cttgtcttgt cgtgcgaatc ctcgtcatct tagcgagctc 180
caggaccctt aggcagcaca cactctg 207
<210> 413
<211> 210
<212> DNA
<213> 滨当归(Angelica hirsutiflora)
<400> 413
gtctttgccc acaaaccact cacacctgag aagttgtgtc ggtttgggga cggaaactgg 60
cctcccgtac cttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gacgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttgtct tgtcgcgcga atcctcgtca tcttagagag 180
atccaggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 414
<211> 208
<212> DNA
<213> 东当归(Angelica acutiloba)
<400> 414
gtcttgccca caaaccactc acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg gaaactggcc 60
tcccgtacct tgtcgtgcgg ttggcggaaa aacgagtctc cggcgacgga cgtcgcgaca 120
tcggtggttg taaaagaccc tcttgtcttg tcgtgcgaat cctcgtcatc ttagcgagct 180
ccaggaccct taggcagcac acactctg 208
<210> 415
<211> 210
<212> DNA
<213> 防风(Saposhnikovia divaricata)
<400> 415
gtctttgccc acagaccact cacacctgag aagttgtgta ggtttggggg cggaaactag 60
cctcccgtac cttgtcgtgc ggttggcgga aaaacgagtc tccggcgacg gatgtcgcga 120
catcggtggt tgtaaaagac cctcttctct tgtcgcgcga atcctcgtca tcttagagag 180
atccaggacc cttaggcagc acacactctg 210
<210> 416
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 416
gaacgcaagt tgcgcccgaa g 21
<210> 417
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 417
caccgatgtc gcgacgtcc 19
<210> 418
<211> 147
<212> DNA
<213> 白芷(Angelica dahurica)
<400> 418
ccacttggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatt gtattgccca caaaccagtc 60
acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
<210> 419
<211> 147
<212> DNA
<213> 白芷(Angelica dahurica)
<400> 419
ccacttggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatt gtattgccca caaaccagtc 60
acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
<210> 420
<211> 147
<212> DNA
<213> 东当归(Angelica acutiloba)
<400> 420
ccactaggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtcttgccca caaaccactc 60
acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg gaaactggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aacgagtctc cggcgac 147
<210> 421
<211> 147
<212> DNA
<213> 法落海(Angelica apaensis)
<400> 421
ccactcagct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca caaaccagtc 60
atacctgaga agttgtgtcg gtttggggcg gaaattggcc tcctgtacct tgttgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
<210> 422
<211> 147
<212> DNA
<213> Angelica capitellata
<400> 422
ccactaggct gagggcacgc ctgtctgggt gtcacgcatc gtcttgccca caaaccactc 60
acacctgaga agttgtgacg gtttggggcg gaaactggcc tcccgtacct tgttatgcgg 120
ttggcggaaa aacgagtctc cggcgac 147
<210> 423
<211> 150
<212> DNA
<213> 紫花前胡(Angelica decursiva)
<400> 423
ccactaggct gagggcacgc ctggcctggg tgtcacgcat cgtattgcct gcagaccact 60
cacacctgag aagtttgtga cggtttgggg cgcaaattgg cctcccgtac cttggccgtg 120
cggttggcgg aaaaacgagt ctccggcgac 150
<210> 424
<211> 147
<212> DNA
<213> 朝鲜当归(Angelica gigas)
<400> 424
ccactaggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca cagaccactc 60
acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg caaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aacgagtctc cggcgac 147
<210> 425
<211> 147
<212> DNA
<213> 康定当归(Angelica kangdingensis)
<400> 425
ccacttggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca caaaccactc 60
acacctgaga aggtgtgccg gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aacgagtctc cggcgat 147
<210> 426
<211> 147
<212> DNA
<213> 疏叶当归(Angelica laxifoliata)
<400> 426
ccacttggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca caaaccactc 60
acacctgaga aggtgtgccg gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aacgagtctc cggcgat 147
<210> 427
<211> 147
<212> DNA
<213> 大叶当归(Angelica megaphylla)
<400> 427
ccactcggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacacatt gtattgccca caaaccagtc 60
acacctgaga agttgtgccg gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
<210> 428
<211> 147
<212> DNA
<213> 青海当归(Angelica nitida)
<400> 428
ccactcagct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca caaaccagtc 60
atacctgaga agttgtgtcg gtttggggcg gaaattggcc tcctgtacct tgttgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
<210> 429
<211> 147
<212> DNA
<213> 拐芹(Angelica polymorpha)
<400> 429
ccactaggct gagggcacgc ctgcctgggt gtcacgcatc gtattgccca caaaccactc 60
acacctgaga agttgtgcca gtttggggcg gaaattggcc tcccgtacct tgtcgtgcgg 120
ttggcggaaa aatgagtctc cggcgat 147
Claims (29)
1.一种用于鉴别生药的引物组，其中，
所述生药选自于由以下生药组成的组：茯苓、地黄、延胡索、葛根、防风、远志、薄荷、麻黄、大枣/酸枣仁、栝楼根/栝楼仁、吴茱萸、前胡、知母、麦冬、白芷、威灵仙、茵陈蒿、地骨皮、砂仁、忍冬藤、川骨、桑白皮、羌活、枇杷叶、紫根、杜仲，
所述引物组是由以下所示碱基序列组成的多核苷酸：
茯苓时，为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
地黄时，为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；
延胡索时，为SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；
葛根时，为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40；
防风时，为SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52；
远志时，为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66；
薄荷时，为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74；
麻黄时，为SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86，或者SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386；
大枣/酸枣仁时，为SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ ID NO:103和SEQ IDNO:104；
栝楼根/栝楼仁时，为SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ IDNO:128；
吴茱萸时，为SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144；
前胡时，为SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402；
知母时，为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187；
麦冬时，为SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200；
白芷时，为SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214，或者SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417；
威灵仙时，为SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228；
茵陈蒿时，为SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244；
地骨皮时，为SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262；
砂仁时，为SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:276；
忍冬藤时，为SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285；
川骨时，为SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299；
桑白皮时，为SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313；
羌活时，为SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325；
枇杷叶时，为SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335；
紫根时，为SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361；以及
杜仲时，为SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375。
2.一种生药鉴别套装，其包含选自于由权利要求1所述的用于鉴别生药的引物组组成的组中一个以上的引物组。
3.根据权利要求2所述的生药鉴别套装，其包含记载有扩增产物的碱基序列信息的碱基序列表，所述扩增产物通过以从生药的基原植物中制备的核酸为模板，使用用于鉴别该生药的引物进行核酸扩增反应而得到。
4.一种茯苓的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选茯苓的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或者SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:1所示的碱基序列和与SEQ ID NO:2所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:5所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:3所示的碱基序列和与SEQID NO:4所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:11所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茯苓的基原植物，所述候选茯苓被鉴别为茯苓。
5.一种地黄的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选地黄的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:17所示的碱基序列和与SEQ ID NO:18所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地黄的基原植物，所述候选地黄被鉴别为地黄。
6.一种延胡索的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选延胡索的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:26所示的碱基序列和与SEQ ID NO:27所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:28所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为延胡索的基原植物，所述候选延胡索被鉴别为延胡索。
7.一种葛根的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选葛根的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，或者SEQ ID NO:39和SEQID NO:40所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:37所示的碱基序列和与SEQ ID NO:38所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:41所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:39所示的碱基序列和与SEQ ID NO:40所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ IDNO:46所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为葛根的基原植物，所述候选葛根被鉴别为葛根。
8.一种防风的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选防风的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:51所示的碱基序列和与SEQ ID NO:52所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:53所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为防风的基原植物，所述候选防风被鉴别为防风。
9.一种远志的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选远志的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:65所示的碱基序列和与SEQ ID NO:66所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:67所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为远志的基原植物，所述候选远志被鉴别为远志。
10.一种薄荷的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选薄荷的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:73所示的碱基序列和与SEQ ID NO:74所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:75所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为薄荷的基原植物，所述候选薄荷被鉴别为薄荷。
11.一种麻黄的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选麻黄的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86，或者SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rbcL区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:85所示的碱基序列和与SEQ ID NO:86所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:87～SEQ ID NO:89中任一个所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:385和SEQ ID NO:386所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:385所示的碱基序列和与SEQ ID NO:386所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:387～SEQ ID NO:389中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麻黄的基原植物，所述候选麻黄被鉴别为麻黄。
12.一种大枣/酸枣仁的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选大枣/酸枣仁的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，或者SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:101所示的碱基序列和与SEQ ID NO:102所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:105所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ IDNO:103和SEQ ID NO:104所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:103所示的碱基序列和与SEQ ID NO:104所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:115所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为大枣/酸枣仁的基原植物，所述候选大枣/酸枣仁被鉴别为大枣/酸枣仁。
13.一种栝楼根/栝楼仁的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选栝楼根/栝楼仁的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126，或者SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的rpl16内含子区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:125所示的碱基序列和与SEQ ID NO:126所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:129～SEQ ID NO:131中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:127所示的碱基序列和与SEQ ID NO:128所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:135～SEQ ID NO:137中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为栝楼根/栝楼仁的基原植物，所述候选栝楼根/栝楼仁被鉴别为栝楼根/栝楼仁。
14.一种吴茱萸的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选吴茱萸的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142，或者SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:142所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:141所示的碱基序列和与SEQ ID NO:142所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:145～SEQ ID NO:147中任一个所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:143所示的碱基序列和与SEQ ID NO:144所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:158～SEQ ID NO:160中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为吴茱萸的基原植物，所述候选吴茱萸被鉴别为吴茱萸。
15.一种前胡的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选前胡的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172，或者由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:171和SEQ ID NO:172所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:171所示的碱基序列和与SEQ ID NO:172所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:173或SEQ ID NO:174所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ ID NO:401和SEQ ID NO:402所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:401所示的碱基序列和与SEQ ID NO:402所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:403或SEQ ID NO:404所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为前胡的基原植物，所述候选前胡被鉴别为前胡。
16.一种知母的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选知母的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:186所示的碱基序列和与SEQ ID NO:187所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:188所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为知母的基原植物，所述候选知母被鉴别为知母。
17.一种麦冬的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选麦冬的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:200所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:199所示的碱基序列和与SEQ ID NO:200所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:201所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为麦冬的基原植物，所述候选麦冬被鉴别为麦冬。
18.一种白芷的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选白芷的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214，或者SEQ ID NO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:213所示的碱基序列和与SEQ ID NO:214所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:215所示的碱基序列进行比对，或者将使用由SEQ IDNO:416和SEQ ID NO:417所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:416所示的碱基序列和与SEQ ID NO:417所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:418所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为白芷的基原植物，所述候选白芷被鉴别为白芷。
19.一种威灵仙的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选威灵仙的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:227和SEQ ID NO:228所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:227所示的碱基序列和与SEQ ID NO:228所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:229～SEQ ID NO:231中任一个所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为威灵仙的基原植物，所述候选威灵仙被鉴别为威灵仙。
20.一种茵陈蒿的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选茵陈蒿的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242，或者SEQ ID NO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的petD-rpoA区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:242所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:241所示的碱基序列和与SEQ ID NO:242所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:245所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ IDNO:243和SEQ ID NO:244所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:243所示的碱基序列和与SEQ ID NO:244所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:253所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为茵陈蒿的基原植物，所述候选茵陈蒿被鉴别为茵陈蒿。
21.一种地骨皮的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选地骨皮的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:261和SEQ ID NO:262所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的trnH-psbA区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:261所示的碱基序列和与SEQ ID NO:262所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:263或SEQ ID NO:264所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为地骨皮的基原植物，所述候选地骨皮被鉴别为地骨皮。
22.一种砂仁的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选砂仁的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:275和SEQ ID NO:276所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:275所示的碱基序列和与SEQ ID NO:276所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:277所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为砂仁的基原植物，所述候选砂仁被鉴别为砂仁。
23.一种忍冬藤的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选忍冬藤的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:284和SEQ ID NO:285所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:284所示的碱基序列和与SEQ ID NO:285所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:286所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为忍冬藤的基原植物，所述候选忍冬藤被鉴别为忍冬藤。
24.一种川骨的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选川骨的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:298和SEQ ID NO:299所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:298所示的碱基序列和与SEQ ID NO:299所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:300所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为川骨的基原植物，所述候选川骨被鉴别为川骨。
25.一种桑白皮的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选桑白皮的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:312和SEQ ID NO:313所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:312所示的碱基序列和与SEQ ID NO:313所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:314所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为桑白皮的基原植物，所述候选桑白皮被鉴别为桑白皮。
26.一种羌活的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选羌活的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:324和SEQ ID NO:325所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:324所示的碱基序列和与SEQ ID NO:325所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:326或SEQ ID NO:327所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为羌活的基原植物，所述候选羌活被鉴别为羌活。
27.一种枇杷叶的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选枇杷叶的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333，或者SEQ ID NO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将使用由SEQ ID NO:332和SEQ ID NO:333所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:332所示的碱基序列和与SEQ ID NO:333所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:336所示的碱基序列进行比对，或将使用由SEQ IDNO:334和SEQ ID NO:335所示碱基序列组成的引物组时的扩增产物中在SEQ ID NO:334所示的碱基序列和与SEQ ID NO:335所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:348所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为枇杷叶的基原植物，所述候选枇杷叶被鉴别为枇杷叶。
28.一种紫根的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选紫根的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:360和SEQ ID NO:361所示碱基序列组成的引物组，对核糖体DNA的ITS区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:360所示的碱基序列和与SEQ ID NO:361所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:362所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为紫根的基原植物，所述候选紫根被鉴别为紫根。
29.一种杜仲的鉴别方法，包括以下步骤：
从候选杜仲的待测植物中提取核酸；
以提取的核酸为模板，使用由SEQ ID NO:374和SEQ ID NO:375所示碱基序列组成的引物组，对叶绿体DNA的psbA-trnH区域进行扩增；
确定扩增产物的碱基序列；以及
将扩增产物中在SEQ ID NO:374所示的碱基序列和与SEQ ID NO:375所示的碱基序列互补的碱基序列之间所夹持的碱基序列与SEQ ID NO:376所示的碱基序列进行比对，当二者的碱基序列一致时，则所述待测植物被鉴别为杜仲的基原植物，所述候选杜仲被鉴别为杜仲。
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