CN110331194B - 一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种利用psbA‑trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，包括：预处理待鉴定鼠曲草样品，采用试剂盒提取待鉴定鼠曲草样品的DNA；基于得到的DNA，进行PCR扩增，通过测序仪对PCR产物进行双向测序，得到测序结果，确定psbA‑trnH间隔区的核苷酸序列；获得鼠曲草属植物的同源序列及外缘种序列，并注释对应的psbA‑trnH间隔区序列，计算K2P遗传距离，构建系统发育树，鉴定鼠曲草属植物品种。本发明以psbA基因和trnH基因之间的间隔序列为特征，与经典鉴定方法相比，从中药材中准确快速地检测出鼠曲草及其易混品，提高了检测的准确度，稳定性高、识别能力强，适用于鼠曲草近缘种、易混种样品的鉴定。

Description

一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法
技术领域
本发明属于生物鉴别方法技术领域，具体涉及一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法。
背景技术
鼠曲草(Gnaphalium affine D.Don)为菊科鼠曲草属一年生草本植物。鼠曲草全草入药，其性味甘、微酸，性平，归肺经，无毒，具有止咳平喘、降血压、祛风寒等的功效。在民间，鼠曲草又叫清明菜、佛耳草，近代以来也有不少学者将其作为保健食品进行开发，如鼠曲草清酒，冻干鼠曲草粉，保健饮料等。
我国鼠曲草属植物有20种之多，在形态上很相似，难以区分。例如鼠曲草和丝棉草形态非常相似，最主要区别就在于苞片颜色差异等。而中药传统的鉴定方法，如基原、性状、显微和理化四大鉴定方法均具有的一定局限性，使得部分样品难以准确鉴定，易出现错用混用现象而贻误病情。因此，为了规范鼠曲草药材的基源鉴定，确保药材的质量和临床用药的有效性，迫切需要开发快速准确鉴定鼠曲草属药材的方法。
DNA条形码在中药材的鉴定与传统的四大经典鉴定方法相比，现代分子遗传标记技术凸显出巨大的优势：DNA分子作为遗传信息体，包含大量的信息内容，在同一物种内具有高遗传稳定性，并且不会受外部环境因素的影响，从而揭示出物种的本质。同时，DNA分子化学稳定性高于RNA、蛋白质、同工酶，等等，所以利用DNA分子特征作为遗传标记对中药进行鉴定更加准确可靠，并且非常适用于近缘种、易混种、稀有品种、动物药材、破碎药材、腐烂药材等样品的鉴定。
psbA-trnH序列存在于叶绿体基因组，为psbA基因和trnH基因之间的间隔序列，psbA编码光合作用系统II反应中心的D1蛋白，trnH编码tRNA组氨酸。此段叶绿体间隔序列仅仅起到链接2个基因的的作用，其所受到的选择压力较小，存在可能相对较多的变异位点，进化速率较快，且两端DNA序列高度保守便于设计通用引物，是被普遍看好的DNA条形码序列，对物种有很高的识别能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，解决了现有鼠曲草鉴别方法准确率低的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，包括以下步骤：
步骤1，预处理待鉴定鼠曲草样品，采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定鼠曲草样品的DNA；
步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行psbA-trnH核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；
步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，将测序结果经CondonCode Aligner软件拼接校对，确定psbA基因终止密码子和trnH基因起始密码子之间的序列，即为psbA-trnH间隔区，psbA-trnH间隔区的核苷酸序列如序列1所示；
步骤4，基于步骤3得到的psbA-trnH序列，在NCBI数据库中进行Blast序列比对，获得鼠曲草属植物的同源序列及外缘种序列，并注释同源序列及外缘种序列的psbA-trnH间隔区序列；
步骤5，基于步骤3和步骤4得到的psbA-trnH间隔区序列，计算K2P遗传距离，构建系统发育树，鉴定鼠曲草属植物品种。
本发明的特征还在于，
步骤1具体为：
步骤1.1，预处理待鉴定鼠曲草样品：取经硅胶干燥过的待鉴定鼠曲草样品30g，在液氮环境中充分研磨成粉末状，备用；
步骤1.2，试剂盒试剂预处理：试剂盒为DP305-02型试剂盒；
取13mL的缓冲液GD，以及15mL的漂洗液PW，并分别在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，备用；
取40mL的缓冲液GP1，加入巯基乙醇，使缓冲液GP1的体积浓度为0.1％并预热至65℃，备用；
取缓冲液GP2体积40mL，取洗脱缓冲液TE体积15mL，备用；
步骤1.3，将经步骤1.1处理的待鉴定鼠曲草样品放入体积700uL的经步骤1.2处理的缓冲液GP1中，密封后颠倒混匀，置于水温65℃的条件下水浴20min；随后加入700uL氯仿，混匀，在13000rpm条件下离心5min；静置，取全部上层水层相；
步骤1.4，将步骤1.3的上层水层相放入离心管中，加入700uL缓冲液GP2，混匀后将离心管转入吸附柱CB3中，静置2min，在13000rpm条件下离心30sec，弃掉废液，重复离心2-3次；向吸附柱CB3中继续加入500uL经步骤1.2处理的缓冲液GD，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中继续加入600uL的经步骤1.2处理的漂洗液PW，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
步骤1.5，将经步骤1.4处理后的吸附柱CB3放回收集管中，在13000rpm条件下离心2min，倒掉废液，取出后置于室温6-8min，将吸附柱CB3中的液体转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul的ddH2O，室温放置5min，在13000rpm条件下离心2min，将溶液收集到离心管中，即提取到待鉴定鼠曲草样品DNA。
步骤2中PCR扩增的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物psbA-trnHF和psbA-trnHR均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH2O 9.5ul。
步骤2中PCR扩增的反应条件为：
温度94℃，变性5min；温度94℃变性1min，温度55℃退火1min，温度72℃延伸1.5min，30个循环；温度72℃延伸5min。
步骤2中PCR反应扩增引物为：
psbA-trnH F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，
psbA-trnH R：5’-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3’。
步骤3中的测序仪具体为ABI3730xl DNA Analyzer测序仪。
本发明的有益效果是：本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，以psbA基因和trnH基因之间的间隔序列为特征，与传统的经典鉴定方法相比，可从多种中药材中准确快速地检测出鼠曲草及其易混品，提高了检测的准确度，稳定性高、识别能力强，适用于鼠曲草近缘种、易混种样品的鉴定，有很好的实用价值。
附图说明
图1是本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法中通用引物psbA-trnH F/R的扩增电泳图；
图2是本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法中K2P遗传距离图；
图3是本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法中Neighor JoiningTree图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，具体包括以下步骤：
步骤1，预处理待鉴定鼠曲草样品，采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定鼠曲草样品的DNA，具体为：
步骤1.1，预处理待鉴定鼠曲草样品：取经硅胶干燥过的待鉴定鼠曲草样品30g，在液氮环境中充分研磨成粉末状，备用；
其中待鉴定鼠曲草样品的来源如下表1所示：其中包括不同地区的鼠曲草，序号1-9，火绒草，序号10，细叶鼠曲草，序号11，
表1待鉴定鼠曲草样品来源表
Figure BDA0002111079990000051
/>
Figure BDA0002111079990000061
步骤1.2，试剂盒试剂预处理：本发明选取的试剂盒为DP305-02型试剂盒；
取13mL的缓冲液GD，以及15mL的漂洗液PW，并分别在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，无水乙醇的加入量分别按照DP305-02型试剂盒要求加入，备用；
取40mL的缓冲液GP1，加入巯基乙醇，使缓冲液GP1的体积浓度为0.1％并预热至65℃，备用；
取缓冲液GP2体积40mL，取洗脱缓冲液TE体积15mL，备用；
步骤1.3，将经步骤1.1处理的待鉴定鼠曲草样品放入体积700uL的经步骤1.2处理的缓冲液GP1中，密封后颠倒混匀，置于水温65℃的条件下水浴20min；随后加入700uL氯仿，混匀，在13000rpm条件下离心5min；静置，取全部上层水层相；
步骤1.4，将步骤1.3的上层水层相放入离心管中，加入700uL缓冲液GP2，混匀后将离心管转入吸附柱CB3中，静置2min，在13000rpm条件下离心30sec，弃掉废液，重复离心2-3次；向吸附柱CB3中继续加入500uL经步骤1.2处理的缓冲液GD，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中继续加入600uL的经步骤1.2处理的漂洗液PW，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
步骤1.5，将经步骤1.4处理后的吸附柱CB3放回收集管中，在13000rpm条件下离心2min，倒掉废液，取出后置于室温6-8min，将吸附柱CB3中的液体转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul的ddH2O，室温放置5min，在13000rpm条件下离心2min，将溶液收集到离心管中，即提取到待鉴定鼠曲草样品DNA。
步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行psbA-trnH核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物；
PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物psbA-trnHF和psbA-trnHR均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH2O 9.5ul。
PCR扩增的反应条件为：温度94℃，变性5min；温度94℃变性1min，温度55℃退火1min，温度72℃延伸1.5min，30个循环；温度72℃延伸5min。
PCR反应扩增引物为：
psbA-trnH F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，
psbA-trnH R：5’-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3’。
如图1所示：其中从左到右依次为marker条带、陕西汉中花果山鼠曲草H、陕西太白山火绒草TX、陕西太白山鼠曲草UN、四川鼠曲草SUN、江西上饶鼠曲草J、云南保山鼠曲草Y；DNA marker条带由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；从图1可知DNA扩增成功，可以测序；
步骤3，通过ABI3730xl DNA Analyzer测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，将测序结果经CondonCode Aligner软件拼接校对，确定psbA基因终止密码子和trnH基因起始密码子之间的序列，即为psbA-trnH间隔区，所述psbA-trnH间隔区的核苷酸序列如序列1所示。
步骤4，基于步骤3得到的psbA-trnH序列，在NCBI数据库中进行Blast序列比对，获得鼠曲草属植物的同源序列及外缘种序列，并注释同源序列及外缘种序列的psbA-trnH间隔区序列；如表1中序号12-31，为同源序列及外缘种序列；
步骤5，基于步骤3和步骤4得到的psbA-trnH间隔区序列，计算K2P遗传距离，构建系统发育树，鉴定鼠曲草属植物品种。
如图2所示，鼠曲草属植物的种内遗传距离为0.000-0.005，种间遗传距离范围为0.099-0.253；种间最小遗传距离是鼠曲草与火绒草的遗传距离，为0.099；种内最大遗传距离是细叶鼠曲草，为0.005；种间最小遗传距离大于种内最大遗传距离。如图3所示，由看出鼠曲草及其同属易混品种都分别在不同的支上，可以明显鉴别分开。
本发明一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，以psbA基因和trnH基因之间的间隔序列为特征，与传统的经典鉴定方法相比，可从多种中药材中准确快速地检测出鼠曲草及其易混品，提高了检测的准确度，稳定性高、识别能力强，适用于鼠曲草近缘种、易混种样品的鉴定。
<110> 西安医学院
<120> 一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gactttggtc taattgtata ggagtttttg aactaaaaaa ggagcaatag cttccctctt 60
gataaaacaa gagggcatta ttgctccttt ttttatttac ttacaaaatt tctttcaaaa 120
ttatttggtt ggattcgcgt attttctctt tgtatttttc atttatatat taaattttaa 180
atattaattg aggtttctat tctattttat ctattctata tccttttctt aatcttttaa 240
gaagttttat ttctaattca atttcaatcg aaaatagaga aaaattttaa ttttgcttat 300
ttattacttt tatttatttt tattttataa ttttctttta taatataatt attattatat 360
tattataata tatatattat aattataaat aagaataaga actagaaaat agtagagggg 420
cgg 423

Claims (5)

1.一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，预处理待鉴定鼠曲草样品，采用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取待鉴定鼠曲草样品的DNA；
步骤2，基于步骤1得到的DNA，进行psbA-trnH核苷酸序列的PCR扩增，得到PCR产物，所述PCR反应扩增引物为：
psbA-trnH F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’，
psbA-trnH R：5’-CGCGCATGGTG-GATTCACAATCC-3’；
步骤3，通过测序仪对步骤2得到的PCR产物进行双向测序，得到测序结果，将测序结果经CondonCode Aligner软件拼接校对，确定psbA基因终止密码子和trnH基因起始密码子之间的序列，即为psbA-trnH间隔区，所述psbA-trnH间隔区的核苷酸序列如序列1所示；
步骤4，基于步骤3得到的psbA-trnH序列，在NCBI数据库中进行Blast序列比对，获得鼠曲草属植物的同源序列及外缘种序列，并注释同源序列及外缘种序列的psbA-trnH间隔区序列；
步骤5，基于步骤3和步骤4得到的psbA-trnH间隔区序列，计算K2P遗传距离，构建系统发育树，鉴定鼠曲草属植物品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
步骤1.1，预处理待鉴定鼠曲草样品：取经硅胶干燥过的待鉴定鼠曲草样品30g，在液氮环境中充分研磨成粉末状，备用；
步骤1.2，试剂盒试剂预处理：所述试剂盒为DP305-02型试剂盒；
取13mL的缓冲液GD，以及15mL的漂洗液PW，并分别在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，备用；
取40mL的缓冲液GP1，加入巯基乙醇，使缓冲液GP1的体积浓度为0.1％并预热至65℃，备用；
取缓冲液GP2体积40mL，取洗脱缓冲液TE体积15mL，备用；
步骤1.3，将经步骤1.1处理的待鉴定鼠曲草样品放入体积700uL的经步骤1.2处理的缓冲液GP1中，密封后颠倒混匀，置于水温65℃的条件下水浴20min；随后加入700uL氯仿，混匀，在13000rpm条件下离心5min；静置，取全部上层水层相；
步骤1.4，将步骤1.3的上层水层相放入离心管中，加入700uL缓冲液GP2，混匀后将离心管转入吸附柱CB3中，静置2min，在13000rpm条件下离心30sec，弃掉废液，重复离心2-3次；向吸附柱CB3中继续加入500uL经步骤1.2处理的缓冲液GD，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中继续加入600uL的经步骤1.2处理的漂洗液PW，在13000rpm条件下离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
步骤1.5，将经步骤1.4处理后的吸附柱CB3放回收集管中，在13000rpm条件下离心2min，倒掉废液，取出后置于室温6-8min，将吸附柱CB3中的液体转入离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul的ddH2O，室温放置5min，在13000rpm条件下离心2min，将溶液收集到离心管中，即提取到待鉴定鼠曲草样品DNA。
3.根据权利要求1所述的一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 12.5ul，通用引物psbA-trnHF和psbA-trnHR均选用浓度10umol/L各1ul，步骤1得到的DNA 1ul，ddH2O 9.5ul。
4.根据权利要求3所述的一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，其特征在于，所述步骤2中PCR扩增的反应条件为：
温度94℃，变性5min；温度94℃变性1min，温度55℃退火1min，温度72℃延伸1.5min，30个循环；温度72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的一种利用psbA-trnH序列鉴定鼠曲草品种的方法，其特征在于，所述步骤3中的测序仪具体为ABI3730xl DNA Analyzer测序仪。
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