CN111073994A

CN111073994A - 一种快速鉴别柴胡属种子的as-pcr方法及应用

Info

Publication number: CN111073994A
Application number: CN202010030499.6A
Authority: CN
Inventors: 刘长利; 戚文涛
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明涉及一种快速鉴别柴胡属种子的PCR方法，具体地，涉及到快速鉴别柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡及小叶黑柴胡等五种柴胡属种子的AS‑PCR方法，利用该方法可实现对柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡及小叶黑柴胡的高效、简便且准确的鉴别。

Description

一种快速鉴别柴胡属种子的AS-PCR方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种快速鉴别柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡及小叶黑柴胡等五种柴胡属种子的AS-PCR方法。通过对种子样品进行DNA提取，用特异性PCR鉴别引物BCF/R8、BSF/R11、BMSF/R1、BFF/R7、BSPF/R1进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测，可快速准确鉴定出种子样品基原。并成功应用此方法对市售柴胡属种子进行了鉴定，属于分子鉴定领域。

背景技术：

伞形科柴胡属Bupleurum L.植物主要分布在北半球温带、亚热带地区，约2500种，中国有36种，其中药用的有25种。柴胡作为我国传统大宗药材，味辛、苦，性微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气的功效，用于感冒发热、寒热往来等症。《中国药典》(2015版)规定柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum chinense DC.)和狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根，习称“北柴胡”和“南柴胡”，此外，柴胡品种中，还有窄竹叶柴胡(Bupleurum marginatum Wall.exDC.var.Stenophyl-lum Shanet Y.Li.)、三岛柴胡(Bupleurum falcatum L.)、小叶黑柴胡(Bupleurum smithiivar.parvifolium)。近年来，随着对柴胡药材需求量不断增加，野生柴胡资源逐年减少，发展人工种植柴胡是解决柴胡资源紧缺的有效途径之一。

种子作为药材的源头，优良种子保障优质药材，优质药材保证临床用药的安全有效。由于我国柴胡资源分布广，各地习用品种略有不同；柴胡属种子外观性状相似，缺乏准确高效的种子真伪鉴别方法；没有相关的法定标准约束等因素均造成我国市售柴胡种子的来源混乱、质量不一等问题，严重影响了柴胡种子种苗的规范化生产，也致使市售柴胡药材来源不可控，质量不稳定，难以保证临床柴胡用药的安全。因此，建立一种高效、简便且准确、稳定的柴胡属种子鉴别方法是十分必要的。

位点特异性PCR(AS-PCR)鉴定技术是通过对正品及其混伪品药材或种子的某些DNA片段序列研究，找出正品的特异性鉴别位点，设计出只扩增正品的高度特异性鉴别引物。当有样品需要鉴定时，提取样品基因组DNA，用特异性鉴别引物对DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳检测便可达到准确鉴别样品真伪的目的。该技术对DNA完整性要求不高，序列测定结果直观可靠且效率极高，可以对混合样品进行鉴定，克服了其它方法无法对药品掺假进行鉴定的缺点，能够对复方制剂进行鉴别，是一种快速准确的检测方法。

发明内容：

本发明的目的在于通过使用位点特异性PCR(AS-PCR)鉴定技术，建立一种高效、简便且准确、稳定的柴胡属种子鉴别方法

因此本发明的第一方面，设计了一对专属鉴别样品种子中柴胡种子的特异性引物。

具体地址，本发明涉及一种从样品种子中鉴定柴胡种子真伪的方法，所述方法包括：从样品种子中提取基因组DNA；以提取所得的基因组DNA为模板，并用柴胡特异性性引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测从而鉴定柴胡种子基原。

本发明所述方法中，鉴别柴胡的特异性引物为：

BCF8：CAAGGAAACCGAAACTGAAC(SEQ ID NO：3)，

BCR8：TATGGCAAGAGGTGCGTAACAA(SEQ ID NO：4)。

所述的样品种子，其中应至少含有柴胡种子，除正品柴胡种子外，还可以包含有其它种类柴胡属种子的混品，其它种类柴胡属种子如可以是狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡、小叶黑柴胡等。也可以是正品柴胡种子与其它非柴胡种子的混品。

本发明的第二方面，涉及一种优化的柴胡特异性引物PCR反应体系和程序。

本发明中，所述柴胡特异性引物进行PCR扩增条件为：PCR反应所用的DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为58℃，循环21次，DNA模板量2.0μl。

本发明中，优选的PCR反应体系为：

本发明中，优选的柴胡特异性引物的PCR反应程序为：93℃预变性5min；93℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，共计21循环；72℃延伸5min；4℃维持。

本发明的再一目的在于提供5对特异性引物及相应的PCR体系和程序，并建立一种用于快速准确鉴定柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡及小叶黑柴胡等五种柴胡属种子基原的方法，用于市场上常见柴胡属种子真伪和掺伪的鉴别。

因此，本发明的第三方面，提供了一种鉴定种子样品柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的方法，所述方法包括：从种子样品中提取基因组DNA；以提取所得的基因组DNA为模板，并分别用样品种子柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的特异性性引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，从而鉴定种子样品中柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的基原。

一种更为具体的鉴定柴胡属种子的实施方案，包括：

(1)种子样品基因组DNA提取：

称取混合均匀的净种子样品5g，用混合型球磨仪研磨2min(3600r/min)，称取10mg种子粉末，依据新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书方法提取样品基因组DNA。

(2)特异性引物PCR扩增：

以提取的基因组DNA为模板，用特异性PCR鉴别引物BCF/R8、BSF/R11、BMSF/R1、BFF/R7、BSPF/R1，配制相应的PCR体系，按照既定PCR程序进行扩增。

(3)1％琼脂糖凝胶电泳检测：

将配制好的小胶置于1×TAE缓冲液中，吸取2K DNA marker 5ul点样，吸取PCR产物3ul混合10×loading buffer 2ul点样。在180V的电压下跑胶10min，并在照胶仪下检测条带并鉴定基原。

本发明中，所述的柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡及小叶黑柴胡等五种柴胡属种子的特异性引物序列见表1。

本发明的第四方面，涉及一种设计五种柴胡属种子的特异性引物和优化PCR反应体系和程序，从而建立五种柴胡属种子AS-PCR鉴别的方法。所述方法包括种子样品基因组DNA提取，ITS通用引物PCR扩增，所获得的ITS序列分析，设计并筛选最适特异性引物，通过对特异性引物的PCR反应条件进行考察优化，设计出最适的PCR反应体系和程序，并通过实例考察验证建立五种柴胡属种子的AS-PCR鉴别方法。此方法可以准确鉴定出五种柴胡属种子，并检测出样品是否有掺伪，比传统性状鉴定及理化鉴别更高效准确且更具有广泛适用性。

一个优选地实施方案中，本发明所述各种类柴胡属种子的特异性引物PCR扩增条件分别为：柴胡DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为58℃，循环21次，DNA模板量2.0μl；狭叶柴胡PCR反应所用的DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为50℃，循环22次，DNA模板量1.0μl；窄竹叶柴胡PCR反应所用的DNA聚合酶为KAPA酶，退火温度为55℃，循环25次，DNA模板量1.0μl；三岛柴胡PCR反应所用的DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为50℃，循环21次，DNA模板量1.0μl；小叶黑柴胡PCR反应所用的DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为55℃，循环35次，DNA模板量2.0μl。

可通过如下方式设计特异性引物并进行PCR反应条件优化：

对收集的柴胡属种子样品进行基因组DNA提取，以提取的基因组DNA为模板，用ITS通用引物进行PCR扩增，将PCR产物测序。将测序所得ITS序列和GenBank数据库中下载的柴胡属植物的ITS序列进行多重序列比对和(neighbour-joining，NJ)系统进化树分析，并获得五种柴胡属种子ITS序列SNP位点。基于所获得的SNP位点设计五种柴胡属种子的特异性PCR引物(5对特异性引物如表1中所示)。

对筛选获得的5对最适特异性引物进行PCR条件优化，获得5对特异性引物的最适PCR体系和程序。

具体地，设计特异性引物和PCR条件优化的实施方案，包括：

(1)种子样品基因组DNA提取

(2)ITS片段扩增及测序

(3)SNP位点获取

(4)特异性引物设计

(5)PCR条件优化

更为具体地方案是：

(1)种子样品基因组DNA提取：

取供试种子样品用75％酒精棉擦拭表面，挑选籽粒饱满的种子10粒约10mg，置于2.0mL离心管中，于液氮中冷冻，用混合型球磨仪研磨1min(3600r/min)，依据新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书方法提取样品基因组DNA。

(2)ITS片段扩增及测序：

以提取的基因组DNA为模板，ITS通用引物进行PCR扩增，产物进行双向测序。

所述引物序列为：

ITSF：GCAAGTAAAAGTCGTAACAACG(SEQ ID NO：1)，

ITSR：TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO：2)；

所述PCR反应体系为：

所述PCR反应程序为：95℃预变性3min；98℃变性20s，55℃复性45s，72℃延伸30s，共计35循环；72℃延伸7min；4℃维持。

(3)SNP位点获取：

用SeqMan软件对测序序列进行剪切和拼接，去除引物及低质量区。DNAMAN软件对测序所得的ITS序列和GenBank数据库下载的ITS序列进行多重序列比对获得SNP位点；MEGA7.0软件利用邻接法(neighbour-joining，NJ)构建系统进化树，同时以bootstrap(自展支持率1 000次)重复检验各分支的支持率。

(4)特异性引物设计：

基于获取的SNP位点设计特异性PCR鉴别引物，引物详细序列信息见表1。

(5)PCR条件优化

对5对特异性引物的PCR反应条件进行DNA聚合酶(2×EasyTaq酶，2×KAPA HIFISuper Mix酶，r Taq酶)、退火温度、DNA模板量、循环数及PCR仪(Veriti Dx PCR仪，T100PCR仪，C1000 Touch PCR仪)等五种因素考察，确定最适PCR体系和程序，详细信息见表2。

表1柴胡属种子特异性引物序列信息

表2柴胡特异性引物PCR体系和程序

本发明中，术语“柴胡”是指拉丁名称为Bupleurum chinense DC.的种子纯品，术语“狭叶柴胡”是指拉丁名称为Bupleurum scorzonerifolium Willd.的种子纯品，术语“窄竹叶柴胡”是指拉丁名称为Bupleurum marginatum Wall.exDC.var.Stenophyl-lum Shanet Y.Li.的种子纯品，术语“三岛柴胡”是指拉丁名称为Bupleurum falcatum L.的种子纯品，术语“小叶黑柴胡”是指拉丁名称为Bupleurum smithii var.parvifolium的种子纯品。术语“柴胡属”是指同属于柴胡种属的柴胡种子，如、柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡、小叶黑柴胡或黑柴胡都属于柴胡属。

附图说明：

图1基因组DNA提取凝胶电泳图，其中M为5K DNA marker，图中柴胡(8/11/13/14)，窄竹叶柴胡(19/20)，狭叶柴胡(23/29)，小叶黑柴胡(34)，三岛柴胡(35/36)。

图2ITS序列PCR扩增凝胶电泳图，其中M为2k DNA marker，图中柴胡(8/11/13/14)，窄竹叶柴胡(19/20)，狭叶柴胡(23/29)，小叶黑柴胡(34)，三岛柴胡(35/36)。

图3柴胡特异性引物PCR条件优化图，其中A不同类型酶；B退火温度；C循环数；D模版量；E不同型号PCR仪；M为2K DNA Marker(条带大小从下至上为100,250,500,750,1000,2000bp等)；Bc柴胡；Bm窄竹叶柴胡；Bs狭叶柴胡；Bp小叶黑柴胡；Bf三岛柴胡.

图4狭叶柴胡特异性引物PCR条件优化图(注释同图3)

图5窄竹叶柴胡特异性引物PCR条件优化图(注释同图3)

图6三岛柴胡特异性引物PCR条件优化图(注释同图3)

图7小叶黑柴胡特异性引物PCR条件优化图(注释同图3)

图8特异性引物灵敏度考察，其中A为BCF/R8；B为BSF/R11；C为BMSF/R1；D为BFF/R7；E为BMSF/R1与BFF/R7的0.1％及0.5％检测；图中M为2K DNA Marker，B为空白。

图9柴胡属种子基原验证实验，其中A为BCF/R8；B为BSF/R11；C为BMSF/R1；D为BFF/R7；E为BSPF/R1；M为2K DNA Marker；图中柴胡1-7，狭叶柴胡8-10，窄竹叶柴胡11-12，三岛柴胡13-17，小叶黑柴胡18。

图10市售柴胡属种子基原鉴定实验，其中A为BCF/R8；B为BSF/R11；C为BMSF/R1；D为BFF/R7；E为BSPF/R1；M为2K DNA Marker；44-54为市售种子编号B44-B54。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)，2×EasyTaq酶(TRANSGEN BIOTECH)，2×KAPA HIFI Super Mix酶(KAPA Biosystems)，r Taq酶(Takara公司)，引物合成和测序由北京睿博公司完成。

实施实例1、特异性引物灵敏度实验

一种子混合体系配制

取狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡种子各9g等量混匀成混合种子备用，用柴胡种子与混合种子混匀成5g的体系，使体系中柴胡含量分别为50％、20％、10％、5％、2％、1％。以同样的方法制作其它三类柴胡属种子混合物，以检测狭叶柴胡、窄竹叶柴胡及三岛柴胡种子在混合体系中的检出限。

二种子样品DNA提取

称取混合均匀的种子样品5g，用混合型球磨仪研磨2min(3600r/min)，称取10mg种子粉末，依据新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书方法提取样品基因组DNA。

三特异性引物PCR扩增

以提取的混合种子样品的基因组DNA为模板，用特异性PCR鉴别引物BCF/R8、BSF/R11、BMSF/R1、BFF/R7，配制相应的PCR体系，按照既定PCR程序进行扩增。

四 1％琼脂糖凝胶电泳检测

电泳检测结果如图8示，表明柴胡种子特异性引物BCF/R8在混合物中的最低检测限为5％，狭叶柴胡种子特异性引物BSF/R11在混合物中的最低检测限为5％；窄竹叶柴胡种子特异性引物BMSF/R11在混合物中的最低检测限为0.1％，引物较为灵敏；三岛柴胡种子特异性引物BFF/R7在混合物中的最低检测限为1％。

实施实例2已鉴定基原的18批柴胡属种子验证实验

对实验室已鉴定基原的7批柴胡种子(B1-B7)，3批狭叶柴胡种子(B8-B10)，2批窄竹叶柴胡种子(B11、B12)，5批三岛柴胡种子(B13-B17)，1批小叶黑柴胡种子(B18)共计18批种子样品，运用AS-PCR方法进行验证实验。

一种子样品DNA提取

三特异性引物PCR扩增

以提取的混合种子样品的基因组DNA为模板，用特异性PCR鉴别引物BCF/R8、BSF/R11、BMSF/R1、BFF/R7、BSPF/R1，配制相应的PCR体系，按照既定PCR程序进行扩增。

四 1％琼脂糖凝胶电泳检测：

电泳检测结果如图9示，从图中看出柴胡种子特异性引物可以在1-7号柴胡种子样品中扩增出特异性的429bp大小的条带；狭叶柴胡种子特异性引物可以在8-10号狭叶柴胡种子样品中扩增出特异性的464bp大小的条带；窄竹叶柴胡种子特异性引物可以在11-12号窄竹叶柴胡种子样品中扩增出特异性的344bp大小的条带；三岛柴胡种子特异性引物可以在13-17号三岛柴胡种子样品中扩增出特异性的137bp大小的条带；小叶黑柴胡种子特异性引物可以在18号小叶黑柴胡种子样品中扩增出特异性的390bp大小的条带。实验结果与预期一致，所有样品均能扩增出相应的特异性条带，验证了收集柴胡属种子样品的基原，同时充分说明了五种柴胡属种子特异性引物的准确性是可靠的。

实施实例3市售10批柴胡属种子基原鉴别实验

从市场随机采购的11批柴胡属种子(B44-B54)。根据商家提供信息，其中市售的柴胡种子为B44、B46、B47、B49、B52等五批；狭叶柴胡种子为B51、B54两批；三岛柴胡种子为B45、B50两批，黑柴胡种子为B48、B53两批，采用AS-PCR法鉴别所购种子样品的基原。

一种子样品DNA提取

二特异性引物PCR扩增

三 1％琼脂糖凝胶电泳检测

特异性引物PCR鉴定结果如图10示，市售种子B44、B46、B47、B49、B52在A图柴胡特异性引物中扩增出特异性条带，其他图中均没有条带，说明样品均为柴胡种子与商家提供信息一致；市售种子B51、B54在B图狭叶柴胡特异性引物中没有出现条带，在A图中有柴胡特异性条带，推测B51、B54为柴胡种子或掺有大量柴胡种子；市售种子B45、B50在D图三岛柴胡特异性引物中出现特异性条带，且在其他图中无条带产生，说明B45、B50为三岛柴胡种子与商家信息提供一致；市售种子B48、B53在E图小叶黑柴胡特异性引物中均没有条带，推测小叶黑柴胡特异性引物不适用于黑柴胡，但B53在A图中有柴胡特异性条带，说明B53为柴胡种子或掺有大量柴胡种子。

序列表

<110> 首都医科大学

<120> 一种快速鉴别柴胡属种子的AS-PCR方法及应用

<130> TQZX2020-ZL0047

<141> 2020-01-13

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gcaagtaaaa gtcgtaacaa cg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

caaggaaacc gaaactgaac 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tatggcaaga ggtgcgtaac aa 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cgtcggcctc ggcctgatgt 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgccttcca ccaatgttgc gtttt 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgacatcctt ctgataagtc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cgcaagatgg caagaggaca 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cgtagcgaaa tgcgatactt ggtgt 25

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gctgcggagg ggcaaagtta 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aaggaaaccg aaactgaaca gga 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gatggcaaga ggtgcgtaat ata 23

Claims

1.一种鉴定柴胡种子真伪的方法，所述方法包括：从样品种子中提取基因组DNA；以提取所得的基因组DNA为模板，并用柴胡特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测从而鉴定柴胡种子基原。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述柴胡特异性引物为：

BCF8：CAAGGAAACCGAAACTGAAC

BCR8：TATGGCAAGAGGTGCGTAACAA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品种子是至少含有柴胡种子的样品，比如可以是含有柴胡种子以及其它种类柴胡属种子的混品，其它种类柴胡属种子如可以是狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡、小叶黑柴胡等。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述柴胡特异性引物进行PCR反应条件为：PCR反应所用的DNA聚合酶为EasyTaq酶，退火温度为58℃，循环21次，DNA模板量2.0μl。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述PCR反应体系为：

所述PCR反应程序为：93℃预变性5min；93℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，共计21循环；72℃延伸5min；4℃维持。

6.一种鉴定样品种子中柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的方法，所述方法包括：从样品种子中提取基因组DNA；以提取所得的基因组DNA为模板，并分别用柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的特异性性引物进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，从而鉴定种子样品中柴胡、狭叶柴胡、窄竹叶柴胡、三岛柴胡或小叶黑柴胡的基原。

7.根据权利要求6所述方法，其中各样品种子的特异性引物分别为：所柴胡特异性引物为：

BCF8：CAAGGAAACCGAAACTGAAC

BCR8：TATGGCAAGAGGTGCGTAACAA；

狭叶柴胡特异性引物为：

BSF11：CGTCGGCCTCGGCCTGATGT

BSR11：ATGCCTTCCACCAATGTTGCGTTTT；

窄竹叶柴胡特异性引物为：

BMSF1：CGACATCCTTCTGATAAGTC

BMSR1：CGCAAGATGGCAAGAGGACA；

三岛柴胡特异性引物为：

BFF7：CGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGT

BFR7：GCTGCGGAGGGGCAAAGTTA；