CN107630102B - 安白芍pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种安白芍PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为ABS1和ABS2：ABS1：5'‑CGATGAGCTAAATACGCACC‑3'，ABS2：5'‑ACCGAGCACCCAGAGCAAT‑3'；本发明提供了一种快速、准确鉴定安白芍的方法，可以广泛应用于安白芍中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药安白芍PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)背景技术
安白芍(Paeonia lactiflora Pall.)主产于安徽省亳州市，是安徽道地药材以及国家地理标志性产品，以块根入药，主要含有芍药苷、苯甲酰芍药苷及白芍苷等化学物质等有效成分，具有止痛、抗炎、保肝以及多途径抑制自身免疫反应的效用，可用于肝病和心血管疾病的治疗。白芍主产区目前种质资源混乱，大部分都是采用无性繁殖的方式进行白芍的种植，从而导致白芍品种退化，如抗病能力减退，块根性状改变等。白芍种质资源的混乱和退化导致了白芍药用价值和品质的下降。除了安白芍外，白芍主要品种包括浙白芍和川白芍。我国白芍种类植物资源丰富，白芍品种繁多，产地不一，各品种间的药效和价格差别较大，对白芍主流产品安白芍进行鉴定具有重要意义。安白芍与其他白芍品种的外观和性状相似，利用常规的中药鉴定方法较难进行鉴别。利用DNA分子鉴定方法能够解决安白芍鉴别困难的问题，这种基于DNA序列的鉴定方法能够从基因水平上进行品种的甄别，具有准确、高效、重复性好的诸多优点，鉴定的结果不受样品产地、生长环境和来源的影响。
本发明提供的PCR检测法就是一种安白芍的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定安白芍。目前已有的对安白芍做出准确鉴定的方法均为采用传统的中药鉴定手段，利用PCR检测法对安白芍进行鉴定尚未见报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药安白芍的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种安白芍PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为ABS1和ABS2：
ABS1：5'-CGATGAGCTAAATACGCACC-3'，
ABS2：5'-ACCGAGCACCCAGAGCAAT-3'。
进一步，所述的安白芍PCR鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种利用所述安白芍PCR鉴定试剂盒对安白芍进行鉴定的方法，所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用安白芍PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ABS1和ABS2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在1027bp处出现扩增条带的为安白芍，在1027bp处不出现扩增条带的不是安白芍。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在1027bp处有无扩增条带作为鉴定安白芍的依据，可以检测单个或者混合白芍DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好，可以检测0.1ng/μL的样品；(2)利用安白芍PCR鉴定试剂盒中引物ABS1和ABS2以及PCR反应溶液配方可以制造安白芍鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定安白芍的方法，可以广泛应用于安白芍中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为十四种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1～14分别为安白芍、浙白芍、川白芍、山白芍、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道M为marker。
图2为不同浓度的安白芍经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1的安白芍浓度为0.1ng/μL，泳道2的安白芍浓度为1ng/μL，泳道3的安白芍浓度为10ng/μL。
图3为混合样品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1为安白芍、浙白芍、川白芍和山白芍的DNA混合溶液，泳道2为浙白芍、川白芍和山白芍的DNA混合溶液，泳道M为marker。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述原料(安白芍、浙白芍、川白芍、山白芍、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术)均按照《中国药典》2015版采集制备。
实施例1
1、安白芍PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
应用植物DNA快速提取试剂盒从安白芍、浙白芍、川白芍和山白芍中分别提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对四种白芍进行RAPD分析，筛选获得一条安白芍特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在安白芍品种中，在其他白芍品种中没有，此条带中的DNA分子即是安白芍特异性DNA分子标记。将安白芍特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为ABS1089。
根据ABS1089序列，设计一对特异性引物ABS1和ABS2，引物序列为：
ABS1：5'-CGATGAGCTAAATACGCACC-3'，
ABS2：5'-ACCGAGCACCCAGAGCAAT-3'。
上、下游引物选取的位点分别对应于ABS1089序列位点上的43～62和1051～1069。
SEQ ID NO.1为：
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2、安白芍的PCR检测法
(1)采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法(同步骤(3))检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)按照ABS1和ABS2的序列用体外合成仪合成引物ABS1和ABS2。以ABS1和ABS2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：
94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在1027bp处出现扩增条带的样品为安白芍，在1027bp处不出现条带的样品不是安白芍。
实施例2：
1、安白芍PCR检测法的准确性研究
从安白芍、浙白芍、川白芍、山白芍、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术这14种植物中提取基因组DNA。以上述14种品种的基因组DNA为模板，利用特异性引物“ABS1/ABS2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证安白芍PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～14分别为安白芍、浙白芍、川白芍、山白芍、蒜、小葱、洋葱、韭菜、黄精、吊兰、百合、万年青、浙贝母、白术，泳道M为marker。
图1表明，安白芍在1027bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的安白芍PCR检测法经实验证明可以用于安白芍的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、安白芍PCR检测法的灵敏度研究
将原始安白芍模板DNA浓度(100ng/μL)经三个梯度进行稀释，配置三份不同浓度的安白芍基因组DNA溶液：一份浓度为原始安白芍模板DNA浓度的10％，即10ng/μL；一份浓度为原始安白芍模板DNA浓度的1％，即1ng/μL；一份浓度为原始安白芍模板DNA浓度的1‰，即0.1ng/μL。
分别以这三种不同浓度的安白芍基因组DNA作为模板(1.2μL)，以“ABS1/ABS2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证安白芍PCR检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道M为Marker，泳道1为0.1ng/μL，泳道2为1ng/μL，泳道3为10ng/μL。
结果显示当安白芍模板基因组DNA浓度为原始模板标准浓度的1‰，即含量仅为0.1ng时，在1027bp处依然出现安白芍的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的安白芍PCR检测法灵敏度很高，含量极微弱的安白芍也能够鉴定出来。
3、安白芍PCR检测法对混合样品的鉴定效果
配置两份不同的基因组DNA混合溶液：组1为安白芍、浙白芍、川白芍和山白芍的DNA混合溶液，四者等量加入，浓度各为原先浓度(100ng/μL)的四分之一；组2为浙白芍、川白芍和山白芍的基因组DNA混合溶液，三者等量加入，浓度各为原先浓度(100ng/μL)的三分之一。
将这两份不同的DNA混合液分别作为模板，以“ABS1/ABS2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以研究安白芍PCR检测法对混合样品的鉴定效果。实验结果见图3，泳道M为Marker，泳道1为组1，泳道2为组2。
图3表明，组1加入安白芍的混合样品经PCR检测后，结果显示在1027bp处出现了明亮的条带。组2没有加入安白芍的混合样品经PCR检测后，结果显示在1027bp处没有出现扩增条带，安白芍在四种白芍的混合材料中被很好的鉴定了出来。经过多次重复验证，结果保持稳定，这显示出本发明的安白芍PCR检测法具有极高的准确性，能在混合药材样品中鉴定出安白芍。实验证明这种方法不仅可以检测单个安白芍样品，还可以在混合物中检测出安白芍，应用范围较广。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 安白芍PCR鉴定试剂盒及鉴定方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1089
<212> DNA
<213> 安白芍(Paeonia lactiflora Pall)
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
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<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
accgagcacc cagagcaat 19
Claims (3)
1.一种安白芍PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为ABS1和ABS2：
ABS1：5'-CGATGAGCTAAATACGCACC-3'，
ABS2：5'-ACCGAGCACCCAGAGCAAT-3'。
2.如权利要求1所述安白芍PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的安白芍PCR鉴定试剂盒的组成为：
3.一种利用权利要求1所述安白芍PCR鉴定试剂盒对安白芍进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用安白芍PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ABS1和ABS2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性3min，94℃变性15s，60～65℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在1027bp处出现扩增条带的为安白芍。
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| 浙贝母特异性PCR鉴定方法研究;李敏等;《中草药》;20140630;第45卷(第12期);1754-1757 * |
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