CN102899409A - 浙贝母pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浙贝母PCR鉴定鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为ZB1和ZB2，ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'；本发明根据凝胶电泳在719bp处有无扩增条带作为鉴定浙贝母的依据，可以检测单个或者混合贝母DNA样品，本发明提供了一种快速、准确鉴定浙贝母的方法，可以广泛应用于浙贝母中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种中药材浙贝母的DNA分子鉴定方法，特别涉及中药浙贝母PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
（二）背景技术
浙贝母是一种常用中药，具有止咳化痰的疗效，是道地药材“浙八味”之一。除了浙贝母外，药典记载的贝母品种包括川贝、湖北贝母、平贝母和伊贝母，另外流通领域还存在浙贝母的伪品草贝母和土贝母。贝母因为品种的不同，药效差别较大，伪品具有毒性，而且各品种之间价格差异非常大，对浙贝母进行鉴定具有重要意义。浙贝母与其他品种外观非常相似，利用常规的中药鉴定方法很难将它们进行区分鉴别。当药材加工成粉末后就更加难以鉴定。利用DNA分子鉴定方法能够解决浙贝母鉴别困难的问题，因为这种方法能够从基因水平上进行品种的甄别，具有准确、高效、重复性好，不受样品产地、生长环境和来源的影响。
本发明提供的PCR检测法就是一种浙贝母的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定浙贝母。目前此种方法在浙贝母鉴定中的应用在专利号03113004.6公开说明书中有所描述，但是使用的引物序列是利用GeneBank数据库下载的贝母植物RNA分子的序列随机设计的。本发明提供的引物是根据浙贝母基因组中的特异性DNA分子标记的序列设计的，所获引物的获取途径和序列与专利号03113004.6公开说明书中所述完全不同。由于本发明提供的引物序列是建立于浙贝母区别于其他品种的特异性DNA分子标记的筛选、克隆和测序工作上的成果，因此，应用该引物的PCR检测法准确性和灵敏度更高，能用于检测混合DNA样品。并且，本发明提供的PCR检测法在检测步骤和检测结果判断依据上也与专利号03113004.6公开说明书中的所述内容不同。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药浙贝母的PCR鉴定试剂盒及检测法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种浙贝母PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为ZB1和ZB2：
ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，
ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'。
进一步，所述浙贝母PCR鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种适于本发明浙贝母PCR鉴定试剂盒的浙贝母基因，所述浙贝母基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1序列：
5’-CGGACAGTACTGGGGGAGAAGTCAAATACTGTTTTATCTGCCTGAAGGCTGCTTCGCACTCTTCCGTCCATTCAAACTCTCTGCTTCCTCATAGCATCGCTGTAAAAGTTTTTATCTTGTCCGATGATCTTGATATGAAGCGGTAAAGGGCTGCTATTCTTCCACTCAGTACCTGTATGTCTTTCACTGTTTTGGGGCTTTCCATCCCCAGTATCGATTTTGTTTGCGCTGGATCTGCGCTGATTCTCTTCTTGTGCACTATGTGCCCTAAGAACTTACCTAAAGCTACTCCAAATATGCATTTTTTTGGATTCAATTTCAGGGAGAAGATGCGTAATCGGTCGAAGGCCTCCTCTAGGTTCTGGATATGATCCTCCTTTTTAGAACTTTTTACCAGTAAATCATCAATTTATGTGCCTACTGTTTTCCCTAGTAGCCCTTGAAAGATTCTGGTAATCAACCGTTGAAAAGTTGCTCCTGCATTCTTAAGTCCAAAGGGCATCACCGTGTAGCAATATAACCCTAAGGGAGTAGTGAAACTGGTGTGTTCCTCATCTTGCAGATTTAACTTGATTTGATTATAGCCTGAACAGGCATCCAAAAAAGATATCCTCTCGTGACCCACCAGTGAGTCCACCAACTGGCATATCCGTGGTAGCGGGAAACTGTCCTTGGGACAGGCTTTATTTAGATCTGTGTAGTCGACACATACCCTCCATTTGCCG
-3’
框内序列为RAPD引物序列。
本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的基因是根据常规提取法（CTAB法）从浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母中提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对五种贝母进行RAPD分析，筛选获得一条浙贝母特异性扩增条带，这条扩增条带只出现在浙贝母品种中，在其他贝母品种中没有，此条带中的DNA分子即是浙贝母特异性DNA分子标记。将浙贝母特异性DNA分子标记从胶中回收，克隆，测序后获得。
本发明涉及一种利用所述浙贝母PCR鉴定试剂盒对浙贝母进行鉴定的方法，所述方法为：
（1）模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量（检测方法同步骤（3）），条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
（2）PCR鉴定：利用浙贝母PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZB1和ZB2进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52～60℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸5min；
（3）PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物（即扩增反应后的反应液）5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳（含0.5%溴化乙锭）检测扩增结果，在719bp处出现扩增条带的为浙贝母，在719bp处不出现扩增条带的不是浙贝母。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明根据凝胶电泳在719bp处有无扩增条带作为鉴定浙贝母的依据，可以检测单个或者混合贝母DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；（2）利用浙贝母PCR鉴定试剂盒中引物ZB1和ZB2以及PCR反应溶液配方可以制造浙贝母鉴定试剂盒；（3）本发明提供了一种快速、准确鉴定浙贝母的方法，可以广泛应用于浙贝母中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
（四）附图说明
图1十三种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1~13分别为为蒜、葱、黄精、玉竹、郁金香、百合、湖北贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、土贝母、草贝母、浙贝母，泳道M为marker。
图2为不同浓度的浙贝母经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL，泳道2为0.5ng/μL，泳道3为5ng/μL。
图3为混合样品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道2为平贝母、川贝母、湖北贝母和伊贝母的基因组DNA混合溶液，泳道1为浙贝母、平贝母、川贝母、湖北贝母和伊贝母的DNA混合溶液，泳道M为marker。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、浙贝母PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
应用CTAB提取法从浙贝母、川贝母、湖北贝母、平贝母、伊贝母中分别提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对五种贝母进行RAPD分析，筛选获得一条浙贝母特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在浙贝母品种中，在其他贝母品种中没有，此条带中的DNA分子即是浙贝母特异性DNA分子标记。将浙贝母特异性DNA分子标记从胶中回收，克隆，测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示。
根据SEQ ID NO.1序列，设计一对特异性引物ZB1和ZB2，引物序列为
ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，
ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'。
分别位于SEQ ID NO.1序列位点上的14~33和713~732。
2、浙贝母的PCR检测法
（1）提取供试品DNA（即浙贝母DNA），采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法（同步骤（3））检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
（2）按照ZB1和ZB2的序列用体外合成仪合成引物ZB1和ZB2。以ZB1和ZB2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：
95℃预变性5min，95℃变性30s，52～60℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸5min。
（3）PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳（含0.5%溴化乙锭）检测扩增结果，在719 bp处出现扩增条带的样品为浙贝母，在719 bp处不出现条带的样品不是浙贝母。
实施例2：
1、浙贝母PCR检测法的准确性研究
从蒜、葱、黄精、玉竹、郁金香、百合、湖北贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、土贝母、草贝母、浙贝母中提取基因组DNA。以13种品种的基因组DNA为模板，利用特异性引物“ZB1/ZB2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证浙贝母PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1~13分别为蒜、葱、黄精、玉竹、郁金香、百合、湖北贝母、川贝母、平贝母、伊贝母、土贝母、草贝母、浙贝母，泳道M为marker。
图2表明，浙贝母在719bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的浙贝母PCR检测法经实验证明可以用于浙贝母的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、浙贝母PCR检测法的灵敏度研究
将原始浙贝母模板DNA浓度（50ng/μL）经三个梯度进行稀释，配置三份不同浓度的浙贝母基因组DNA溶液：一份浓度为原始浙贝母模板DNA浓度的10%，即5ng/μL；一份浓度为原始浙贝母模板DNA浓度的1%，即0.5ng/μL；一份浓度为原始浙贝母模板DNA浓度的1‰，即0.05ng/μL。
分别以这三种不同浓度的浙贝母基因组DNA作为模板（1.2μL），以“ZB1/ZB2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证浙贝母PCR检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道M为Marker，泳道1为0.05ng/μL，泳道2为0.5ng/μL，泳道3为5ng/μL。
结果显示当浙贝母模板基因组DNA浓度为原始模板标准浓度的1‰，即含量为0.06ng时，在719bp处依然出现浙贝母的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的浙贝母PCR检测法灵敏度很高，含量极微弱的浙贝母也能够鉴定出来。
3、浙贝母PCR检测法对混合样品的鉴定效果
配置两份不同的基因组DNA混合溶液：组1为平贝母（吉林长白山）、川贝母（四川）、湖北贝母（湖北恩施））和伊贝母（新疆伊犁）的基因组DNA混合溶液，四者等量加入，浓度各为原先浓度（50ng/μL）的四分之一；组2为浙贝母（浙江宁波鄞州）、平贝母、川贝母、湖北贝母和伊贝母的DNA混合溶液，五者等量加入，浓度各为原先浓度（50ng/μL）的五分之一。
将这两份不同的DNA混合液分别作为模板，以“ZB1/ZB2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以研究浙贝母PCR检测法对混合样品的鉴定效果，见图3所示，泳道M为Marker，泳道1为组2，泳道2为组1。
图3表明，组1没有加入浙贝母的样品经PCR检测后，结果显示在719bp处没有出现扩增条带。组2加入浙贝母的样品经PCR检测后，结果显示在719bp处出现了明亮的条带，浙贝母在五种贝母的混合材料中被很好的鉴定了出来。经过多次重复验证，结果保持稳定，这显示出本发明的浙贝母PCR检测法具有极高的准确性，能在混合药材样品中鉴定出浙贝母。如此，这种方法就拥有了更为广阔的应用前景，不仅可以检测单个浙贝母样品，还可以在混合物中检测出浙贝母，大大扩展了该法的应用范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 浙贝母PCR鉴定试剂盒及鉴定方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 745
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列
<400> 2
acagtactgg gggagaagtc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
caaatggagg gtatgtgtcg 20
Claims (4)
1.一种浙贝母PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为ZB1和ZB2：
ZB1：5'-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3'，
ZB2：5'-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3'。
2.如权利要求1所述的浙贝母PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒的组成为：
3.一种适于权利要求1所述试剂盒的浙贝母基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.一种利用权利要求1所述浙贝母PCR鉴定试剂盒对浙贝母进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：
（1）模板DNA的提取和质量鉴定：提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
（2）PCR鉴定：利用浙贝母PCR鉴定试剂盒中的特异性引物ZB1和ZB2进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：95℃预变性5min，95℃变性30s，52～60℃复性30s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸5min；
（3）PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在719bp处出现扩增条带的为浙贝母，在719bp处不出现扩增条带的不是浙贝母。
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